Composición constituida por lo menos por 60% en peso de un polipéptido factor neurotrófico derivado de astrocitos maduros (MANF),

que está constituido por la secuencia de SEC ID nº 3 ó 4, o una secuencia que es idéntica por lo menos 90% a la secuencia de SEC ID nº 3 ó 4

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a composiciones y a procedimientos para incrementar la supervivencia de las neuronas.

El crecimiento, supervivencia y diferenciación de las neuronas en los sistemas nerviosos periférico y central (SNP y SNC, respectivamente) dependen, en parte, de factores neurotróficos paracrinos y autocrinos derivados de la diana. A la inversa, la falta de factores neurotróficos se cree que desempeña un papel en la etiología de las enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica (ALS o enfermedad de Lou Gehrig). En los cultivos de células neuronales, se proporciona el soporte neurotrófico mediante cocultivo con astrocitos o proporcionando medio condicionado (MC) preparado a partir de astrocitos. Los astrocitos de origen mesencefálico ventral presentan una eficacia mucho mayor en la estimulación de la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas ventrales que los astrocitos procedentes de otras regiones del SNC, tales como los córtex neoestriatal y cerebral. En los cultivos mesencefálicos crónicos de 21 días in vitro (DIV) o más largos, el porcentaje de neuronas dopaminérgicas se incrementa de 20% a 60%, coincidiendo con la proliferación de una monocapa de astrocitos. En contraste, bajo condiciones en las que se encuentra inhibida la proliferación de los astrocitos, las neuronas dopaminérgicas, pero no las GABAérgicas, resultaron prácticamente eliminadas de los cultivos transcurridos 5 DIV. Estos resultados demuestran la importancia de los astrocitos derivados homotípicamente para la supervivencia y el desarrollo de neuronas dopaminérgicas contiguas, y sugiere que los astrocitos mesencefálicos son una fuente probable de un factor neurotrófico paracrino fisiológico para las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas.

Paschision et al. (J. Mol. Neurosci. Vol 11 nº 3 p.209-221) crearon una línea celular mesencefálica ventral de rata y el MC libre de suero procedente de dichas células mostró una actividad que incrementaba la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas en cultivo.

La demostración repetida de que los astrocitos secretan moléculas que estimulan la supervivencia neuronal los ha convertido en un foco de búsqueda de terapias para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas. Muchos laboratorios han intentado aislar factores neurotróficos derivados de astrocitos pero se han debido enfrentar a un problema técnico importante: el suero es un componente esencial del medio para el crecimiento óptimo de los astrocitos primarios en cultivo, pero la presencia del suero interfiere con la purificación posterior de los factores que se han secretado al medio condicionado.

De esta manera, existe una necesidad de identificación y purificación de nuevos factores neurotróficos, y de identificación de nuevos procedimientos para producir medio condicionado, que resulten compatibles con las técnicas de aislamiento de proteínas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Anteriormente se había aislado una línea celular de tipo astrocito de tipo 1 inmortalizada espontáneamente, denominada línea celular mesencefálica ventral 1 (VMCL-1). Esta línea celular, depositada en la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA; nº de acceso ATCC PTA-2479; fecha de depósito: 18 de septiembre de 2000), se obtuvo del mesencéfalo ventral y conservaba las características de los astrocitos de tipo 1 primarios, pero crece robustamente en un medio libre de suero. El MC preparado a partir de dichas células contiene uno o más factores de supervivencia neuronal que incrementa la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas por lo menos 3 veces, y también estimula su desarrollo.

Mediante la utilización de un procedimiento de purificación multietapa, se identificó una proteína rica en argininas (ARP) como una proteína que se copurifica con la actividad estimulante de la supervivencia neuronal dopaminérgica del MC de la VMCL-1. Debido a que la proteína y la actividad se copurificaron a través de cinco etapas de purificación, los presentes inventores concluyeron que esta proteína es uno de los factores implicados en que el MC de la VMCL-1 presente la actividad estimulante de la supervivencia neuronal dopaminérgica deseada.

Se descubrió asimismo que se produce la ARP en una forma secretada previamente no reconocida; se hace referencia a esta forma como MANF (factor neurotrófico derivado de astrocitos maduros). El MANF no presenta la parte N-terminal rica en argininas de la proteína, tal como se muestra en la figura 1 y en SEC ID nº 3. Basándose en el examen de las secuencias, se crea que esta forma secretada resulta del corte de una variante de procesamiento previamente no identificada de la ARP (ARPβ o pro-MANF), que presenta la secuencia representada en SEC ID nº 2. MANF y pro-MANF, y los análogos, derivados y fragmentos biológicamente activos de los mismos, se denominan colectivamente "polipéptidos MANF".

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en un primer aspecto, la invención proporciona una composición constituida por por lo menos 60% en peso de un polipéptido factor neurotrófico derivado de astrocitos maduros (MANF) constituido por la secuencia SEC ID nº 3 ó 4, o una secuencia que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia SEC ID nº 3 ó 4. En una forma de realización, el polipéptido MANF presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 3, 4, 6 ó 7. En otra forma de realización, el polipéptido MANF incluye una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 3, 4, 6 ó 7, o, además de lo expuesto anteriormente, es sustancialmente idéntica a una proteína que presenta una de dichas secuencias de aminoácidos. En un aspecto relacionado, la invención proporciona una composición según la reivindicación 1 para la utilización como medicamento.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un polinucleótido sustancialmente purificado codificante de un polipéptido MANF, en el que dicho polipéptido MANF está constituido por la secuencia SEC ID nº 3 ó 4, o una secuencia que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia SEC ID nº 3 ó 4. Tal como se ha indicado anteriormente, el polipéptido MANF puede presentar la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 3, 4, 6 ó 7, o puede presentar una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos respecto a dichas secuencias de aminoácidos. En una forma de realización, el polinucleótido codifica una proteína sustancialmente idéntica a una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 3, 4, 6 ó 7. En otra forma de realización, el polinucleótido está constituido por la secuencia SEC ID nº 9 ó 10.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que incluye el polinucleótido según el segundo aspecto. El vector de expresión puede ser, por ejemplo, un vector adenovírico o un vector retrovírico. En una forma de realización particular, el polinucleótido se encuentra operablemente ligado a secuencias reguladoras que permiten la expresión del polinucleótido en una célula neural.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que incluye: (i) una composición según la reivindicación 1, e (ii) un portador que es farmacéuticamente aceptable para la administración en el sistema nervioso central.

En un quinto aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica según el cuarto aspecto que incluye una célula neural. La célula neural puede ser, por ejemplo, una neurona, una célula madre neural o una célula precursora neuronal.

En un sexto aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vitro para incrementar la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas, incluyendo el procedimiento la etapa de poner en contacto las neuronas dopaminérgicas con una cantidad estimulante de la supervivencia de una composición según la reivindicación 1.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vitro para cultivar neuronas dopaminérgicas para el trasplante. Este procedimiento incluye la etapa que consiste en cultivar las neuronas, o células progenitoras de las mismas, con una cantidad estimulante de la supervivencia de una composición según la reivindicación 1.

En un octavo aspecto, la invención proporciona: i) la utilización de una composición según la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica destinada...

1. Composición constituida por lo menos por 60% en peso de un polipéptido factor neurotrófico derivado de astrocitos maduros (MANF), que está constituido por la secuencia de SEC ID nº 3 ó 4, o una secuencia que es idéntica por lo menos 90% a la secuencia de SEC ID nº 3 ó 4.

2. Polinucleótido sustancialmente purificado codificante de un polipéptido MANF, en el que dicho polipéptido MANF está constituido por la secuencia de SEC ID nº 3 ó 4, o una secuencia que es idéntica por lo menos 90% a la secuencia de SEC ID nº 3 ó 4.

3. Composición según la reivindicación 1 para la utilización como medicamento.

4. Composición farmacéutica que comprende: (i) una composición según la reivindicación 1, e (ii) un portador que resulta farmacéuticamente aceptable para la administración al sistema nervioso central.

5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, que comprende además una célula neural.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5, en la que dicha célula neural es una neurona, una célula madre neural o una célula precursora neuronal.

7. Procedimiento in vitro para incrementar la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas, comprendiendo dicho procedimiento la etapa que consiste en poner en contacto dichas neuronas dopaminérgicas con una cantidad estimulante de la supervivencia de una composición según la reivindicación 1.

8. Procedimiento in vitro para el crecimiento de neuronas dopaminérgicas para trasplante, comprendiendo dicho procedimiento la etapa que consiste en cultivar dichas neuronas, o las células progenitoras de las mismas, con una cantidad estimulante de la supervivencia de una composición según la reivindicación 1.

9. Vector de expresión que comprende un polinucleótido codificante de un polipéptido MANF, en el que dicho polipéptido MANF está constituido por la secuencia de SEC ID nº 3 ó 4, o de una secuencia que es idéntica por lo menos 90% a la secuencia de SEC ID nº 3 ó 4.

10. Vector de expresión según la reivindicación 9, en el que dicho vector es un

vector adenovírico o vector retrovírico.

11. Procedimiento para determinar si un compuesto candidato modula la actividad estimulante de la supervivencia neuronal dopaminérgica mediada por MANF, que incluye:

(a) proporcionar una composición según la reivindicación 1;

(b) poner en contacto dicha composición con el compuesto candidato; y

(c) medir la actividad estimulante de la supervivencia neuronal dopaminérgica de MANF, en el que la actividad estimulante de la supervivencia neuronal dopaminérgica de MANF alterada respecto a la de dicho polipéptido MANF no puesto en contacto con el compuesto indica que el compuesto modula la actividad estimulante de la supervivencia neuronal dopaminérgica de MANF.

12. Procedimiento para determinar si un compuesto candidato resulta útil para reducir la neurodegeneración, incluyendo el procedimiento las etapas siguientes:

(a) proporcionar una composición según la reivindicación 1;

(b) poner en contacto dicha composición con el compuesto candidato; y

(c) medir la unión del polipéptido MANF, en el que la unión del polipéptido MANF indica que el compuesto candidato resulta útil para reducir la neurodegeneración.

13. Utilización de una composición según la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de un paciente que presenta una enfermedad o trastorno del sistema nervioso o a la prevención de la muerte celular neuronal dopaminérgica en un mamífero.

14. Utilización según la reivindicación 13, en la que dicha enfermedad es la enfermedad de Parkinson.

15. Utilización de una composición según la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica para la administración en un mamífero, habiendo dicho mamífero previamente presentado células trasplantadas en su sistema nervioso, en la que dicha composición farmacéutica se ha concebido para administrarse a dicho mamífero en una ventana de tiempo de cuatro horas antes de dicho trasplante de dichas células a cuatro horas después de dicho trasplante de dichas células.

16. Utilización según la reivindicación 15, en la que dicha ventana de tiempo es de dos horas antes de dicho trasplante de dichas células a dos horas después de dicho trasplante de dichas células.

17. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que dicho mamífero es un humano.

18. Composición según la reivindicación 1 para el tratamiento de un paciente que presenta una enfermedad o trastorno del sistema nervioso o para la prevención de la muerte celular neuronal dopaminérgica en un mamífero.

19. Composición según la reivindicación 18, en la que dicha enfermedad es la enfermedad de Parkinson.

20. Composición según la reivindicación 1 para la administración a un mamífero, habiendo dicho mamífero previamente presentado células trasplantadas en su sistema nervioso, en la que dicha composición farmacéutica se ha concebido para administrarse a dicho mamífero en una ventana de tiempo de cuatro horas antes de dicho trasplante de dichas células a cuatro horas después de dicho trasplante de dichas células.

21. Composición según la reivindicación 20, en la que dicha ventana de tiempo es de dos horas antes de dicho trasplante de dichas células a dos horas después de dicho trasplante de dichas células.

22. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en la que dicho mamífero es un humano.