PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACIÓN DE HEPARINA, BASADA EN UN FACTOR XA, UTILIZANDO UN COMPONENTE MODIFICADOR DE HEPARINA.

Procedimiento para determinar la actividad heparínica en una muestra líquida,

en donde se cuantifica la inactivación del factor Xa agregado, que depende de la heparina, caracterizado porque antes de agregar el factor Xa, la muestra se incuba con una enzima del conjunto de las heparinasas o con una enzima del conjunto de las glucuronidasas o con una mezcla de diferentes enzimas de uno de los conjuntos, o con una mezcla de diferentes enzimas de ambos conjuntos

La presente invención se enmarca en el sector de diagnóstico de coagulación y comprende un procedimiento in vitro para determinar la actividad heparínica en una muestra. 5

Las heparinas son cadenas de glucosaminoglicanos de carga negativa, polisulfatadas, de diferente longitud, y pertenecen a las sustancias anticoagulantes más difundidas que inhiben inmediatamente, y dependiendo de la concentración, la coagulación in vivo e in vitro. Según la longitud de cadena, se distinguen, básicamente, las denominadas heparinas no fraccionadas, de alto peso molecular (HUF, heparina UF), con un peso molecular de entre 3 000 y 30 000 Dalton y las 10 denominadas heparinas fraccionadas, de bajo peso molecular (HLMW, heparinas LMW) con un peso molecular de entre, aproximadamente, 4 000 y 9 000 Dalton. Las heparinas fraccionadas en general se obtienen por disociación enzimática o química, o por cromatografía, a partir de heparina no fraccionada. Según el método de disociación, para estos productos se obtienen diferentes características físico-químicas, como una longitud de cadena media, distribución de del peso 15 molecular, grado de sulfatación o modificaciones de glicano, que presentan una influencia en la actividad biológica de estos productos. Los derivados de la heparina y los heparinoides son cadenas de glucosaminoglicano enzimática y/o químicamente modificadas, cuyas características anticoagulantes se pueden modificar biotecnológicamente a través de la influencia adecuada de la longitud de la cadena de glicano, modelo de sulfatación o acetilación, o la mezcla de diferentes 20 glusaminoglicanos, por ejemplo, en el caso del Danaparoid sódico, una mezcla de glicosaminoglicanos formado predominantemente por sulfato de heparan y en una proporción inferior, sulfato de dermatan y sulfato de condroitina.

El efecto anticoagulante de todas las heparinas se basa en su complejización con antitrombina (AT, antitrombina III), el principal inhibidor plasmático de factores activados de 25 coagulación. La antitrombina pertenece al conjunto de inhibidores de la serin-proteasa (Serpin) e inhibe los factores de coagulación trombina (factor IIa, FIIa) y factor Xa (FXa), así como, en menor medida, también las demás serin-proteasas FIXa, FXIa, FXlla, calicreína y plasmina. Gracias al enlace de heparina y antitrombina se obtienen las modificaciones en la conformación de antitrombina, que intensifica varias veces el efecto inhibidor de la antitrombina. El punto de enlace en las moléculas de 30 heparina, responsable del enlace de la antitrombina, consiste en una secuencia característica de pentasacáridos. La forma completamente sintética de este pentasacárido (Fondaparinux) también es utilizado, al igual que la HUF o la HLMW, para la inhibición medicamentosa de la capacidad de coagulación.

Las heparinas no fraccionadas y las heparinas fraccionadas, los derivados de heparina, 35 heparinoides o pentasacáridos se diferencian en su efecto anticoagulante. Mientras que la trombina HUF y FXa inhiben del mismo modo, las HLMW presentan un efecto predominantemente inhibidor de FXa y sólo en menor medida un efecto inhibidor de trombina. Los pentasacáridos, como el Fondaparinux, inhiben selectivamente el FXa y no presentan un efecto inhibidor de trombina.

Acorde a la indicación, las heparinas se utilizan de modo profiláctico o terapéutico, por 40 ejemplo, para la profilaxis de tromboembolias en situaciones de riesgo, o en el caso de inmovilización, para la terapia de episodios tromboembólicos ya iniciados o también en el caso de procedimientos terapéuticos extracorporales, como hemodiálisis, bypass cardiopulmonar o cateterismo cardíaco. Dado que el efecto anticoagulante de la heparina está supeditado a una serie de magnitudes de influencia individuales, por ejemplo, el peso corporal o las funciones del hígado y de los riñones, y una 45 dosificación errónea puede desencadenar complicaciones hemorrágicas o tromboemólicas, se indica una monitorización de la terapia para la HUF en todos los pacientes y para HLMW en los pacientes de riesgo (insuficiencia renal, sobrepeso, embarazo).

En el estado actual de la técnica se conocen diferentes procedimientos para monitorizar la terapia heparínica o para determinar el nivel de heparina. 50

La terapia y profilaxis con heparina puede ser monitoreada, por un lado, indirectamente, controlando la coagulabilidad de la sangre mediante pruebas de coagulación clásicas, por ejemplo, el PT, APTT y el tiempo de trombina. La comparación de un tiempo de coagulación medido de una muestra de paciente heparinizada, con los valores de referencia correspondientes de plasmas

estándar, de concentraciones definidas de de heparina, también posibilitan una cuantificación del nivel de heparina de una muestra de un paciente. Ejemplos de procedimientos basados en el tiempo de coagulación para la determinación de la heparina se describen, por ejemplo, en las memorias de patente US 4 067 777 y EP 217 768 B1.

Una forma especial de determinación de heparina basada en el tiempo de coagulación está 5 descrita en la memoria EP 259 463 B1. En el caso de dicho procedimiento, se determina, para una alícuota de una muestra de paciente, un tiempo de coagulación, mientras que una segunda alícuota de la muestra es tratada con heparinasa para la descomposición completa de la heparina presente en la muestra y sólo entonces se determina el tiempo de coagulación. La diferencia entre ambos tiempos de coagulación es una medida para la cantidad de heparina presente en la muestra, que puede ser 10 leída en una correspondiente curva estándar. Sin embargo, en la literatura, las pruebas de coagulación se consideran inadecuadas para la determinación de HLMW, dado que, debido a su efecto antitrombina reducido no existe una influencia lineal, dependiente de la concentración, sobre el resultado de medición (tiempo de coagulación, INR) [véase, por ejemplo, Harenberg, J. (2004) Is laboratory monitoring of low-molecular-weight heparin therapy necessary? Yes. (Es necesario el 15 monitoreo en laboratorio de la terapia de heparina de bajo peso molecular? Sí.) J. Thromb. Haemost. 2; páginas 547-550].

Por otro lado, el monitoreo de una terapia o profilaxis de heparina mediante los denominados ensayos de heparina amidolíticos o cromógenos, que permiten una determinación precisa y sensible de la actividad heparínica. Dicho procedimiento se basa, esencialmente, en que una 20 muestra heparínica se incuba con FXa exógeno o trombina (FIIa), así como con un sustrato cromógeno correspondiente, de factor específico, y la inactivación de la heparina de la actividad enzimática del FXa o de la trombina se determina a partir del sustrato convertido. La cantidad del producto de disociación cromógeno liberado es inversamente proporcional a la actividad heparínica. Mediante una curva de calibrado, obtenida a partir de la medición de plasmas con proporciones 25 conocidas de heparina, se puede cuantificar correctamente la cantidad de heparina de una muestra de un paciente. El agregado adicional de antitrombina a la mezcla de reacción, o bien en forma de plasma normal o también en forma purificada, provoca, por un lado, gracias a la generación de un excedente, una compensación de diferentes concentraciones de antitrombina en diferentes muestras de pacientes y, por otro lado, un incremento de la sensibilidad de las pruebas, especialmente, en los 30 sectores de concentraciones bajas de heparina. Dichos ensayos de heparina amidolíticos se pueden adquirir en diferentes variantes en el mercado. Ejemplos de ello están descritos en las memorias EP 004 271 A2 y EP 034 320 B1. Acorde al estado actual de la técnica, dichas pruebas cromógenas anti-FXa se deben utilizar, preferentemente, para la determinación de la HLMW [véase también, por ejemplo, Harenberg, J. (2004)]. 35

Otros procedimientos están descritos en las memorias WO 03/078960 y WO 02/23190.

La cuantificación de heparina se lleva a cabo, usualmente, en unidades internacionales (units) por mililitro (IU/ml). Dado que la heparina como material de extracción biológica, están sujeta a una importante dependencia del organismo, el tejido, las condiciones de extracción entre otros, y los efectos mensurables en la coagulación, sólo se pueden registrar indirectamente, una definición de 40 efecto físico-química (unit) ha sido consideradas como no aplicable. Se definieron, por ello, estándares metrológicos correspondientes con los cuales se pueden medir y declarar preparados, pero también nuevos estándares. El sistema más difundido es el sistema apoyado por WHO de unidad internacional (IU), administrado por el...

1. Procedimiento para determinar la actividad heparínica en una muestra líquida, en donde se cuantifica la inactivación del factor Xa agregado, que depende de la heparina, caracterizado porque antes de agregar el factor Xa, la muestra se incuba con una enzima del conjunto de las heparinasas o con una enzima del conjunto de las glucuronidasas o con una mezcla de diferentes 5 enzimas de uno de los conjuntos, o con una mezcla de diferentes enzimas de ambos conjuntos.

2. Procedimiento acorde a la reivindicación 1, caracterizado porque antes de agregar el factor Xa, la muestra es incubada con heparinasa I, heparinasa II, heparinasa III o una mezcla de ellas.

3. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque antes 10 de agregar el factor Xa, la muestra se incuba con una enzima del conjunto de las heparinasas o con una enzima del conjunto de las glucuronidasas o con una mezcla de diferentes enzimas de uno de los conjuntos, o con una mezcla de diferentes enzimas de ambos conjuntos en una concentración de 0,05 a 5,0 U/ml, de modo especialmente preferido, en una concentración de 0,25 a 1,25 U/ml en la mezcla.

4. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque antes 15 de agregar el factor Xa, la muestra se incuba durante 10 a 900 segundos, preferentemente, durante 15 a 90 segundos, de modo especialmente preferido, durante 20 a 60 segundos, con una enzima del conjunto de las heparinasas o con una enzima del conjunto de las glucuronidasas o con una mezcla de diferentes enzimas de uno de los conjuntos, o con una mezcla de diferentes enzimas de ambos conjuntos. 20

5. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque la inactivación del factor Xa agregado, que depende de la heparina, se cuantifica en presencia de antitrombina agregada.

6. Procedimiento acorde a la reivindicación 5, caracterizado porque la antitrombina es agregada al mismo tiempo que una enzima del conjunto de las heparinasas o una enzima del conjunto 25 de las glucuronidasas o una mezcla de diferentes enzimas de uno de los conjuntos, o una mezcla de diferentes enzimas de ambos conjuntos.

7. Procedimiento acorde a las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque a la muestra se le agrega, adicionalmente, sulfato de dextrano.

8. Procedimiento acorde a la reivindicación 7, caracterizado porque el sulfato de dextrano 30 es agregado a la muestra, al mismo tiempo que el factor Xa.

9. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se determina la actividad heparínica en una muestra de líquidos corporales, preferentemente, en sangre, plasma de sangre, suero u orina.

10. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque, 35 además, independientemente del tipo de heparina que contiene la muestra, la actividad heparínica en la muestra se cuantifica a partir de una curva de calibrado adecuada para todas las variantes de heparina, generada previamente utilizando cualquier heparina.

11. Kit de prueba para la realización de un procedimiento acorde a la reivindicación 1, caracterizado porque contiene un reactivo que presenta una enzima del conjunto de las heparinasas 40 o una enzima del conjunto de las glucuronidasas o una mezcla de diferentes enzimas de uno de los conjuntos, o una mezcla de diferentes enzimas de ambos conjuntos, y un reactivo que contiene el factor Xa.

12. Kit de prueba acorde a la reivindicación 11, caracterizado porque, además, presenta un reactivo que contiene un sustrato de factor Xa. 45

13. Kit de prueba acorde a una de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque, además, presenta un reactivo que contiene antitrombina.

14. Kit de prueba para la realización de un procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque contiene un reactivo que presenta una enzima del conjunto de las heparinasas o una enzima del conjunto de las glucuronidasas o una mezcla de diferentes enzimas de uno de los conjuntos, o una mezcla de diferentes enzimas de ambos conjuntos, y antitrombina. 5

15. Kit de prueba acorde a una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque el reactivo que contiene el factor Xa, presenta, adicionalmente, sulfato de dextrano.

16. Kit de prueba acorde a una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque el reactivo que contiene antitrombina contiene, adicionalmente, sulfato de dextrano.

17. Kit acorde a una de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque uno o múltiples 10 de los reactivos están liofilizados.

18. Utilización de un kit de prueba acorde a una de las reivindicaciones 11 a 17 para llevar a cabo un procedimiento acorde a la reivindicación 1.