PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN Y/O DE MEDICIÓN A ALTO CAUDAL DE UNA ACTIVIDAD LIPÁSICA O FOSFOLIPÁSICA.

Procedimiento de preparación de placas de microtitulación que comprenden unos pocillos revestidos con un sustrato lipídico,

que puede ser hidrolizado por una lipasa o una fosfolipasa liberando ácido α-eleosteárico, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: - añadir a los pocillos de dichas placas una composición que comprende el sustrato lipídico en disolución en un disolvente apropiado susceptible de poder ser evaporado al vacío, siendo esta adición, llegado el caso, efectuada después del lavado de los pocillos de dichas placas con dicho disolvente, - evaporar al vacío dicho disolvente hasta la formación de un revestimiento con dicho sustrato lipídico de 0,5 a 5 µm, y preferentemente de 1 µm de grosor en las paredes de los pocillos de las placas de microtitulación.

La presente invención tiene por objeto un procedimiento de detección y/o de medición in vitro a alto caudal de una actividad lipásica o fosfolipásica, así como sus aplicaciones.

La elaboración de métodos analíticos para la detección y la dosificación de lipasas ha sido el objeto de investigaciones desde hace numerosos años (Beisson F., Tiss A., Rivière C. y Verger R. (2000) Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur. J. Lipid Sci.Technol. 2: 133-153).

Unos triglicéridos naturalmente fluorescentes para detectar actividades lipásicas muy bajas han sido utilizados con el objetivo de caracterizar las propiedades cinéticas y enantioselectivas de las lipasas generadas mediante la técnica del "phage display" (Beisson F., Ferté N., Nari J., Noat G., Arondel V. y Verger R. (1999). Use of naturally fluorescent triacylglycerols from Parinari glaberrimum to detect low lipase activities from Arabidopsis thaliana seedlings. J. Lipid Res. 40: 2313-2321).

El principio de este método se basa por un lado en la presencia en el aceite de parinario de un ácido graso naturalmente fluorescente (ácido parinárico) que posee cuatro dobles enlaces conjugados y por consiguiente absorbe la luz en el campo ultravioleta y la reemite mediante un fenómeno de fluorescencia. Bajo la acción hidrolítica de las lipasas, el ácido parinárico se libera del triglicérido de origen para ser solubilizado en una fase micelar. Este cambio de fase (de una fase emulsificada hacia una fase micelar) se acompaña de una variación de emisión espectral de fluorescencia que ha sido aprovechada para seguir, con una gran sensibilidad, la evolución en el curso del tiempo de la reacción de hidrólisis.

Una de las limitaciones de este método fluorescente está relacionada con la oxidabilidad por el oxígeno atmosférico de los cuatro dobles enlaces conjugados del ácido parinárico. Es por eso que los inventores han extrapolado el mismo principio de medición a un aceite extraído de la madera de China (Tung oil) y utilizado desde la antigüedad en la fabricación de las lacas chinas. Este aceite contiene una proporción muy grande de ácido α-eleosteárico que posee sólo tres dobles enlaces conjugados y que no es fluorescente pero absorbe la luz ultravioleta. Este ácido es asimismo mucho menos oxidable que el ácido parinárico. Así es como los inventores han utilizado por un lado las propiedades de absorción ultravioleta del ácido alfa-eleosteárico y, por otro lado, el cambio de fase descrito anteriormente (de una fase emulsificada hacia una fase micelar) para poner a punto un método denominado en "emulsión" descrito en el artículo de Pencreac'h G., Graille J., Pina M. y Verger R. (2002) An ultraviolet spectrophotometric assay for measuring lipase activity using long-chain triacylglycerols from Aleurites fordii seeds. Anal. Biochem, 303: 17-24.

El documento US 20040014133 describe unos procedimientos de detección de una actividad lipásica, por ejemplo, mediante SPA o fluorescencia, y obtiene una buena reproducibilidad uniendo el sustrato después de la modificación sobre la fase sólida (ejemplo biotina).

En el marco del desarrollo de estas investigaciones, los inventores han utilizado los triglicéridos purificados del aceite de tung para cubrir con una película muy delgada (equivalente a algunos centenares de capas monomoleculares) los pocillos de placas de microtitulación (constituidos por un material plástico no absorbente en el ultravioleta). Los inventores han demostrado que esta película delgada de triglicéridos permanece perfectamente adsorbida en las paredes de los pocillos, incluso después del aclarado mediante diferentes tampones acuosos. Bajo la acción hidrolítica (en la interfaz aceite-agua) de diferentes lipasas, tal como se ha descrito anteriormente, el ácido α-eleosteárico se libera y se solubiliza en fase micelar. Por consiguiente, su espectro de absorción ultravioleta se modifica y, por otro lado, el camino óptico aumenta considerablemente tras el paso del estado adsorbido al estado soluble, lo cual constituye una ventaja significativa para la técnica por revestimiento o "coating".

La presente invención es el resultado de la demostración por los inventores del hecho de que esta nueva técnica por revestimiento o "coating" de lípidos (triglicéridos o ésteres de síntesis) presenta con relación a la técnica en "emulsión" anterior, las ventajas siguientes:

- una mejor conservación a lo largo del tiempo de los sustratos lipídicos adsorbidos (o "revestidos") en los pocillos de las placas de microtitulación,

- una actividad de las lipasas más elevada sobre el sustrato "revestido" que sobre el sustrato en emulsión,

- una mejor reproducibilidad de los experimentos con el sustrato "revestido",

- una relación señal/ruido más favorable debido al incremento del camino óptico tras el paso del estado adsorbido al estado soluble.

Así, la presente invención tiene por objetivo proporcionar un nuevo método de medición de la actividad lipásica que

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es más específico, cuantitativo y sensible, que los métodos descritos hasta ahora en este campo, y que permite medir actividades lipolíticas muy débiles (equivalentes a una cantidad mínima de aproximadamente 2 ng para la lipasa de Thermomyces lanuginosus, "TLL"), utilizando un sustrato natural de las lipasas.

La presente invención tiene asimismo por objetivo proporcionar un nuevo método de medición de la actividad lipásica que permite cribar a alto caudal los numerosos mutantes de las lipasas susceptibles de ser generados gracias a la técnica del "phage display".

La invención tiene asimismo por objetivo proporcionar un nuevo método de medición de la actividad lipásica a alto caudal para seleccionar unos mutantes y unas lipasas enantioselectivas, con la ayuda de los ésteres quirales, de interés farmacéutico y biotecnológico, que contienen ácido alfa-eleosteárico. Estos mutantes así seleccionados podrán servir de catalizadores enzimáticos para la síntesis asimétrica de moléculas de interés farmacéutico y agroalimentario.

La invención tiene asimismo por objetivo proporcionar un nuevo método de medición de la actividad lipásica que se puede utilizar en clínica humana, para la medición de la lipasemia plasmática, durante el diagnóstico precoz de diversas afecciones pancreáticas.

La invención se refiere a un procedimiento de detección y/o de medición in vitro de una actividad lipásica o fosfolipásica característica de una lipasa o fosfolipasa de origen natural o sintético en una muestra susceptible de contener esta lipasa o fosfolipasa, caracterizado porque comprende:

- añadir la muestra mencionada anteriormente susceptible de contener dicha lipasa o fosfolipasa en disolución acuosa, en los pocillos de placas de microtitulación revestidos con una capa de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 µm, y preferentemente de aproximadamente 1 µm de grosor de un sustrato lipídico que puede ser hidrolizado por dicha lipasa o fosfolipasa liberando ácido α-eleosteárico que se solubiliza en fase micelar en dicha disolución acuosa,

- detectar y/o medir la actividad lipásica o fosfolipásica mediante espectrofotometría en el espectro de absorción UV del ácido α-eleosteárico liberado durante la etapa anterior.

Por lipasa o fosfolipasa de origen natural o sintético se entiende cualquier lipasa o fosfolipasa de mamíferos o de microorganismos (bacterias, hongos, etc.), llegado el caso modificada por mutación de uno o varios aminoácidos. La actividad lipásica puede ser medida clásicamente según los métodos descritos en particular en Beisson et al. (Beisson F., Tiss A., Rivière C. y Verger R. (2000) Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2: 133-153). La actividad lipásica o fosfolipásica puede ser, por ejemplo, medida por el método descrito en Wolf et al. (Wolf C., Sagaert L. y Bereziat G. (1981) A sensitive assay of phospholipases using the fluorescent probe 2-parinaroyllecithin. Biochem. Biophys. Res. Com. 99: 275-283) en el que se ha utilizado un fosfolípido de síntesis que contiene ácido parinárico para medir la actividad enzimática de una fosfolipasa A2 de veneno de serpiente.

La invención se refiere más particularmente a un procedimiento tal como se ha... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de preparación de placas de microtitulación que comprenden unos pocillos revestidos con un

sustrato lipídico, que puede ser hidrolizado por una lipasa o una fosfolipasa liberando ácido α-eleosteárico, 5 caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

- añadir a los pocillos de dichas placas una composición que comprende el sustrato lipídico en disolución en un disolvente apropiado susceptible de poder ser evaporado al vacío, siendo esta adición, llegado el caso, efectuada después del lavado de los pocillos de dichas placas con dicho disolvente,

10 -evaporar al vacío dicho disolvente hasta la formación de un revestimiento con dicho sustrato lipídico de 0,5 a 5 µm, y preferentemente de 1 µm de grosor en las paredes de los pocillos de las placas de microtitulación.

2. Placas de microtitulación que comprenden unos pocillos revestidos con un sustrato lipídico que puede ser hidroxilado por una lipasa o una fosfolipasa liberando ácido α-eleosteárico, obtenidas mediante el procedimiento según la reivindicación 1, siendo el revestimiento con dicho sustrato lipídico sobre las paredes de los pocillos de las placas de microtitulación de 0,5 a 5 µm, y preferentemente de 1 µm de grosor.

3. Procedimiento de detección y/o de medición in vitro de una actividad lipásica o fosfolipásica característica de una lipasa o fosfolipasa de origen natural o sintético en una muestra susceptible de contener esta lipasa o fosfolipasa, caracterizado porque comprende:

- añadir una disolución tampón constituida por Tris y por sales biliares (NaTDC) y, llegado el caso, por β-ciclodextrina, en los pocillos de placas de microtitulación obtenidas según la reivindicación 1, 25

- añadir la muestra mencionada anteriormente susceptible de contener dicha lipasa o fosfolipasa en disolución acuosa, en los pocillos de placas de microtitulación obtenidas según la reivindicación 1, revestidos con una capa de un sustrato lipídico que puede ser hidroxilado por dicha lipasa o fosfolipasa liberando ácido α-eleosteárico que se solubiliza en fase micelar en dicha disolución acuosa,

30 -detectar y/o medir la actividad lipásica o fosfolipásica mediante espectrofotometría en el espectro de absorción UV del ácido α-eleosteárico liberado durante la etapa anterior.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el sustrato lipídico que puede ser hidrolizado por 35 dicha lipasa o fosfolipasa liberando ácido α-eleosteárico se selecciona de entre:

- los triglicéridos purificados del aceite de tung de fórmula general

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

- o unos ésteres de ácido α-eleostearato con otros alcoholes o moléculas proquirales o quirales de interés

farmacéutico tal como el propanolol, el sotalol o el carvedilol, o con unas moléculas de interés industrial tal como el mentol.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, de medición in vitro de la lipasemia plasmática en el ser humano o en el animal, caracterizado porque la muestra que contiene la lipasa es una muestra sanguínea extraída del ser humano o del animal.

6. Aplicación de un procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 5, al diagnóstico in vitro:

10 -de afecciones pancreáticas tales como la pancreatitis aguda, la pancreatitis crónica, caracterizadas por un incremento del porcentaje plasmático de lipasa en el ser humano o en el animal, con respecto al porcentaje plasmático de esta lipasa en un individuo sano, o

- de la insuficiencia renal, los traumatismos del abdomen (isquemia, infarto mesentérico, perforación u oclusión 15 intestinal).

7. Utilización de las placas según la reivindicación 2, para la realización de un procedimiento de detección y/o de medición in vitro de una actividad lipásica o fosfolipásica tal como el definido según una de las reivindicaciones 3 a 5, o para la realización de un procedimiento de cribado de inhibidores de enzimas lipolíticas.