Un método para el diagnóstico o pronóstico de sepsis en un paciente que comprende la etapa de monitorear o evaluar la cantidad de lisofosfatidilcolina total en una muestra de fluido o tejido del paciente,

donde el diagnóstico o pronóstico se realiza previo a la aparición de sepsis.

La presente invención se refiere a métodos para diagnóstico o pronóstico de sepsis en un paciente.

La detección temprana de una condición de enfermedad típicamente permite un tratamiento terapéutico más efectivo con el resultado clínico correspondientemente más favorable. En muchos casos, sin embargo, la detección temprana de los síntomas de la enfermedad es problemática debido a la complejidad de la enfermedad; por lo tanto, una enfermedad puede volverse relativamente avanzada antes de que el diagnóstico sea posible. Las afecciones inflamatorias sistémicas representan una de esta clase de enfermedades. Estas afecciones, particularmente sepsis, típicamente, pero no siempre, resultan de una interacción entre un microorganismo patógeno y el sistema de defensa del huésped que provoca una respuesta inflamatoria excesiva y desregulada en el huésped. La complejidad de la respuesta del huésped durante la respuesta inflamatoria sistémica ha complicado los esfuerzos por entender la patogénesis de la enfermedad (revisado en Healy, 2002, Ann. Pharmacother, 36:648-54). Un incompleto entendimiento de la patogénesis de la enfermedad, a su vez, contribuye con la dificultad para encontrar biomarcadores diagnósticos útiles. El diagnóstico temprano y confiable es imperativo, sin embargo, debido al avance marcadamente rápido de la sepsis convirtiéndose en una afección amenazante para la vida.

El desarrollo de sepsis en un sujeto sigue un curso bien descrito, que avanza de un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica ("SIRS") negativo, a SIRS positivo, y después a sepsis, que después puede avanzar a sepsis severa, choque séptico, disfunción múltiple de órganos ("MOD"), y finalmente la muerte.

Documentar la presencia de los microorganismos patógenos que son clínicamente significativos para la sepsis ha probado ser difícil. Los microorganismos causantes típicamente son detectados mediante el cultivo de la sangre del sujeto, esputo, orina, secreción de herida, superficies de catéter de línea permanente, etc. Los microorganismos causantes, sin embargo, pueden residir solamente en ciertos medio ambientes del cuerpo de manera tal que el material particular que es cultivado puede no contener los microorganismos contaminantes. La detección puede ser complicada además por los bajos números de microorganismos en el sitio de infección. Los bajos números de patógenos en sangre presentan un problema particular para diagnosticar sepsis mediante el cultivo de sangre. En un estudio, por ejemplo, se obtuvieron resultados de cultivo positivos en solamente 17% de los sujetos que presentaban manifestaciones clínicas de sepsis (Rangel-Frausto et al., 1995, JAMA 273:117-123). El diagnóstico además puede ser complicado por la contaminación de las muestras por microorganismos no patógenos. Por ejemplo, solamente el 12,4% de los microorganismos detectados eran clínicamente significativos en un estudio de 707 sujetos con septicemia (Weinstein et al., 1997, Clinical Infectious Deseases 24:584-602).

La dificultad en el diagnóstico temprano de sepsis está reflejada por la alta morbilidad y mortalidad asociada con la enfermedad. La sepsis actualmente es la décima causa de muerte en los Estados Unidos y es especialmente prevalente entre los pacientes hospitalizados en unidades de cuidado intensivo no coronario (ICUs), donde es la causa de muerte más común. La tasa total de mortalidad es tan alta como el 35%, con 750.000 casos estimados por año que se producen en Estados Unidos solamente. El costo anual para tratar la sepsis en los Estados Unidos solamente está en el orden de los mil millones de dólares.

La mayoría de los sistemas de clasificación de sepsis existentes o modelos de predicción pronostican solamente el riesgo de las complicaciones de la etapa tardía, que incluye la muerte, en pacientes que ya son considerados sépticos y no pronostican el desarrollo de la misma sepsis. A menudo, el diagnóstico de sepsis se basa en la sospecha clínica con un sistema de clasificación empírico tal como APACHE II (Knaus et al., 1985, Crit. Care Med. 13:818-829), seguido por el cultivo de sangre. Puede tomar 48 horas o más confirmar cualquier infección sistémica. Por entonces, a menudo es demasiado tarde salvar algunos pacientes. Si el diagnóstico o pronóstico de sepsis puede realizarse en forma temprana, el tratamiento puede hacerse disponible para prevenir o disminuir la velocidad del avance de sepsis en sepsis severa o choque séptico.

Por ello existe una necesidad de métodos para diagnosticar afecciones inflamatorias sistémicas, que incluye sepsis, mediante la utilización de técnicas que tengan especificidad y sensibilidad satisfactorias, suficientemente tempranas para permitir la intervención y prevención efectivas. La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico

o pronóstico de sepsis en un paciente que comprende la etapa de monitorear o evaluar la cantidad de lisofosfatidilcolina total en una muestra de fluido o tejido del paciente, donde el diagnóstico o pronóstico se realiza previo a la aparición de sepsis.

La presente invención además se refiere a un método para el diagnóstico o pronóstico de sepsis en un paciente que comprende la etapa de detectar la lisofosfatidilcolina en el paciente mediante el contacto de una muestra de fluido o tejido del paciente con: una enzima o reactivo capaz de hacer reaccionar la lisofosfatidilcolina para formar glicerofosfatidilcolina; una enzima o reactivo capaz de hacer reaccionar la glicerofosfatidilcolina para formar colina; una enzima o reactivo capaz de hacer reaccionar la colina, agua y oxígeno para formar peróxido; una peroxidasa; y un sustrato fluorogénico de dicha peroxidasa; en condiciones apropiadas para la formación de un producto fluorescente donde el producto fluorescente indica la lisofosfatidilcolina; donde el diagnóstico o pronóstico se realiza previo a la aparición de sepsis.

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En un aspecto, la presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la cantidad de lisofosfatidilcolina total en una muestra de un paciente puede utilizarse para el diagnóstico o pronóstico rápido, sensible y exacto de una afección inflamatoria sistémica en un sujeto. En aspectos de la invención, la lisofosfatidilcolina total en una muestra de un paciente se utiliza para evaluar la presencia de o riesgo de la afección inflamatoria sistémica. Según lo que se muestra en los ejemplos más abajo, los métodos de la invención pueden utilizarse para el diagnóstico o pronóstico de la afección inflamatoria sistémica. Si bien la afección inflamatoria sistémica en los métodos de la invención es sepsis, en la presente memoria se describe cualquier afección inflamatoria sistémica conocida para aquellos expertos en la técnica que incluye síndrome de respuesta inflamatoria sistémica ("SIRS"), sepsis, sepsis severa, choque séptico, disfunción múltiple de órganos ("MOD") y mortalidad.

En ciertas realizaciones, se evalúa la lisofosfatidilcolina total en una muestra del sujeto para evaluar la presencia o riesgo de una afección inflamatoria sistémica. Según lo que se describe en la presente memoria, se ha descubierto que la cantidad de lisofosfatidilcolina total en una muestra de un paciente puede estar correlacionada con la aparición de una afección inflamatoria sistémica y aún puede indicar la afección en anticipación a su aparición. Como resultado, en ciertas realizaciones, la lisofosfatidilcolina total en una muestra del paciente puede utilizarse como un pronóstico para una afección inflamatoria sistémica. La evaluación puede proceder de acuerdo a cualquier técnica para evaluar la lisofosfatidilcolina total conocida para aquellos expertos en la técnica.

Las técnicas ejemplares se describen en la presente memoria. Sin embargo, la presente invención proporciona métodos basados en cualquier técnica para evaluar la lisofosfatidilcolina total evidente para aquellos expertos en la técnica.

En otro aspecto, la presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de una clase de biomarcadores de lisofosfatidilcolina que son útiles para el diagnóstico o pronóstico rápido, sensible y exacto de una afección inflamatoria sistémica en un sujeto. En aspectos de la invención, se utiliza la evaluación de un biomarcador de la invención en el sujeto para evaluar la presencia de o riesgo de la afección inflamatoria sistémica. Según lo que se muestra en los ejemplos más abajo, los métodos de la invención pueden utilizarse para el diagnóstico o... [Seguir leyendo]

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1. Un método para el diagnóstico o pronóstico de sepsis en un paciente que comprende la etapa de monitorear o evaluar la cantidad de lisofosfatidilcolina total en una muestra de fluido o tejido del paciente, donde el diagnóstico o pronóstico se realiza previo a la aparición de sepsis.

2. El método de la Reivindicación 1, donde la lisofosfatidilcolina es un compuesto en conformidad con la fórmula (I)

**(Ver fórmula)**

o una sal o solvato del mismo, donde R es acilo C10-C22.

3. El método de la Reivindicación 2, donde R es acilo C14-C22 , preferiblemente acilo C16-C20, más 10 preferiblemente acilo C16--C18 .

4. El método de la Reivindicación 1 que comprende la etapa de medir en el tiempo una pluralidad de cantidades de lisofosfatidilcolina total en la muestra de fluido o tejido del paciente.

5. El método de la Reivindicación 4 donde dicha lisofosfatidilcolina comprende 1-0-palmitoil-2-liso-sn-glicero3-fosfocolina y 1-0-estearoilo-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina.

15 6. El método de la Reivindicación 4 donde la lisofosfatidilcolina libre total y/o lisofosfatidilcolina unida total indica la cantidad de lisofosfatidilcolina total.

7. El método de la Reivindicación 4, donde la lisofosfatidilcolina es un compuesto en conformidad con la fórmula (I)

**(Ver fórmula)**

20 o una sal o solvato del mismo, donde R es acilo C10-C22.

8. El método de la Reivindicación 7 donde R es acilo C14-C22, preferiblemente acilo C16-C20, más preferiblemente acilo C16-C18 .

9. El método de la Reivindicación 7 donde R es acilo saturado, preferiblemente acilo saturado C16, o acilo saturado C18.

25 10. El método de la Reivindicación 7 donde R es acilo C16-C18 no ramificado, preferiblemente palmitoilo, o estearoilo.

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11. El método de la Reivindicación 4 o 7 donde una cantidad decreciente indica riesgo creciente de sepsis o una cantidad creciente indica riesgo decreciente de sepsis, o donde una cantidad decreciente indica diagnóstico de sepsis o una cantidad creciente indica contra diagnóstico de sepsis.

12. El método de la Reivindicación 4 o 7 donde el paciente es SIRS positivo.

13. El método de la Reivindicación 4 o 7 que adicionalmente comprende la medición de uno o más biomarcadores, donde dicho biomarcador es distinto de lisofosfatidilcolina.

14. El método de la Reivindicación 4 o 7 donde la cantidad se mide por espectrometría, cromatografía, inmunoensayo y, electroforesis o ensayo enzimático.

15. El método de la Reivindicación 4 o 7 donde el fluido o tejido es sangre, plasma, saliva, suero, esputo, orina, células, extracto celular o biopsia tisular.

16. El método de la Reivindicación 4 o 7 donde el fluido o tejido es sangre.

17. El método de la Reivindicación 1 o 2 que comprende la etapa de monitorear o evaluar una o más mediciones clínicas.

18. El método de la Reivindicación 17 donde la medición clínica es de acuerdo a un modelo de severidad clínica para sepsis, donde el modelo clínico se selecciona del grupo que consiste en la Evaluación de Salud Crónica y Fisiología Aguda, la Evaluación de Salud Crónica y Fisiología Aguda II, la Evaluación de Salud Crónica y Fisiología Aguda III, la Modelo de Predicción de Mortalidad, la puntuación de Fisiología Aguda Simplificada, la puntuación de Disfunción Múltiple de Órganos, la puntuación de Evaluación de Falla de Órganos Secuencial, la Puntuación Logística de Disfunción de Órganos, y la predisposición, infección, respuesta, y concepto de disfunción de órganos.

19. El método de la Reivindicación 1 que comprende la etapa de comparar la cantidad de lisofosfatidilcolina total en la muestra de fluido o tejido del paciente respecto de una cantidad de referencia indicativa de la cantidad de lisofosfatidilcolina total en una muestra de fluido o tejido de un individuo que tiene sepsis.

20. El método de la Reivindicación 19, donde la lisofosfatidilcolina es un compuesto en conformidad con la fórmula (I)

**(Ver fórmula)**

o una sal o solvato del mismo, donde R es acilo C10-C22.

21. El método de la Reivindicación 20 donde R es acilo C14-C22, preferiblemente acilo C16-C20, más preferiblemente acilo C16-C18.

22. El método de la Reivindicación 19 o 20 donde la diferencia entre las cantidades se correlaciona inversamente con el riesgo de sepsis.

23. El método de la Reivindicación 19 o 20 donde la cantidad de referencia es una cantidad de referencia límite.

24. El método de la Reivindicación 23, donde una cantidad menor que la cantidad de referencia límite indica el diagnóstico de sepsis.

25. El método de la Reivindicación 19 o 20 donde la cantidad se mide 12, 24, 36 o 48 horas previo a la aparición de sepsis.

26. El método de la Reivindicación 19 o 20 donde el paciente es SIRS positivo.

27. El método de la Reivindicación 26 donde el individuo es SIRS positivo.

28. El método de la Reivindicación 26 donde el individuo es sepsis positivo.

29. Un método para el diagnóstico o pronóstico de sepsis en un paciente que comprende la etapa de detectar la lisofosfatidilcolina en el paciente mediante el contacto de una muestra de fluido o tejido del paciente con:

una enzima o reactivo capaz de hacer reaccionar la lisofosfatidilcolina para formar glicerofosfatidilcolina; una enzima o reactivo capaz de hacer reaccionar la glicerofosfatidilcolina para formar colina;

una enzima o reactivo capaz de hacer reaccionar la colina, agua y oxígeno para formar peróxido;

una peroxidasa; y

un sustrato fluorogénico de dicha peroxidasa;

en condiciones apropiadas para la formación de un producto fluorescente donde el producto fluorescente indica la lisofosfatidilcolina;

donde el diagnóstico o pronóstico se realiza previo a la aparición de sepsis.

30. El método de la Reivindicación 29 donde dicha enzima o reactivo capaz de hacer reaccionar la lisofosfatidilcolina para formar glicerofosfatidilcolina es una lisofosfolipasa.

31. El método de la Reivindicación 29 donde dicha enzima o reactivo capaz de convertir la lisofosfatidilcolina en glicerofosfatidilcolina es EC 3.1.1.5.

32. El método de la Reivindicación 29 donde dicha enzima o reactivo capaz de hacer reaccionar la glicerofosfatidilcolina para formar colina es un glicerofosfatidilcolina diesterasa.

33. El método de la Reivindicación 29 donde dicha enzima o reactivo capaz de hacer reaccionar la glicerofosfatidilcolina para formar colina es EC 3.1.4.2.

34. El método de la Reivindicación 29 donde dicha enzima o reactivo capaz de hacer reaccionar la colina para formar peróxido es una colina oxidasa.

35. El método de la Reivindicación 29 donde dicha enzima o reactivo capaz de hacer reaccionar la colina con peróxido es EC 1.1.3.17.

36. El método de la Reivindicación 29 donde dicha peroxidasa es peroxidasa del rábano.

37. El método de la Reivindicación 29 donde dicho sustrato fluorogénico es 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina y dicho producto fluorescente es 7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona.

38. El método de la reivindicación 29 donde dicho producto fluorescente es detectado por detección fluorescente.

39. El método de la Reivindicación 29 donde la muestra se pone en contacto con una lisofosfolipasa, una glicerofosfatidilcolina diesterasa, una colina oxidasa, una peroxidasa y 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina en condiciones apropiadas para la formación de 7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona donde 7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona indica la lisofosfatidilcolina.

40. El método de la Reivindicación 29 donde la muestra se pone en contacto con EC 3.1.1.5, EC 3.1.4.2, EC 1.1.3.17, peroxidasa del rábano y 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina en condiciones apropiadas para la formación de 7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona donde 7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona indica la lisofosfatidilcolina.

41. El método de la Reivindicación 29 donde la cantidad de producto fluorescente indica la cantidad de lisofosfatidilcolina.

42. El método de la Reivindicación 19, donde la cantidad de lisofosfatidilcolina total en la muestra de fluido o tejido del paciente es comparada con una cantidad de referencia indicativa de las cantidades de lisofosfatidilcolina total en fluidos o tejidos de una pluralidad de individuos que tienen sepsis.

43. El método de la Reivindicación 1 que comprende la etapa de comparar la cantidad de lisofosfatidilcolina total en la muestra de fluido o tejido del paciente con un estándar interno en el fluido o el tejido.

44. El método de la Reivindicación 17 donde las medición/es clínica/s se seleccionan del grupo que consiste en ritmo respiratorio, temperatura, ritmo cardíaco, recuento de glóbulos blancos en sangre, recuento de monocitos, recuento de linfocitos, recuento de granulocitos, recuento de neutrófilos, relación de neutrófilo inmaduro y neutrófilo total, recuento de plaquetas, concentración de creatinina sérica, concentración de urea, concentración de lactato, exceso bases, concentración de pO2 y HCO3-.

45. El método de la Reivindicación 17 donde se monitorea o evalúa una medición clínica.

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46. El método de la Reivindicación 45 donde se monitorea o evalúa el ritmo respiratorio.

47. El método de la Reivindicación 45 donde se monitorea o evalúa la temperatura.

48. El método de la Reivindicación 17 donde se monitorea o evalúa m'as que una medición clínica.

49. El método de la Reivindicación 48 donde se monitorean o evalúan el ritmo respiratorio y la temperatura.

50. El método de la Reivindicación 17 que además comprende monitorear o evaluar uno o más biomarcadores en la muestra de fluido o tejido del paciente, donde los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en endotoxina, ADN bacteriano, proteína C, procalcitonina, proteína de unión a LBP -LPS, productos de degradación de fibrina, antitrombina III, dímero D, HLA-DR, CD-64, E-selectina, cortisol, ACTH, CD-14, sTNF-RI, sTNF-RII, TNF, IL- 6, IL-8 y IL- 10, D-dímero, tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial activada, inhibicor-1 activador del plasminógeno, trombomodulina soluble, inhibidor de fibrinolisis activable por trombina, proteína S, antitrombina y TNF-a.

51. El método de la Reivindicación 1 que comprende las etapas de: medir una pluralidad de cantidades de un compuesto en conformidad con la fórmula (I)

**(Ver fórmula)**

o una sal o solvato del mismo, donde R es acilo C10-C22, en la muestra de fluido o tejido del paciente; y medir una o más mediciones clínicas del paciente.

52. El método de la Reivindicación 51 donde la/s medición/es clínica/s se seleccionan del grupo que consiste en ritmo respiratorio, temperatura, ritmo cardíaco, recuento de glóbulos blancos en sangre, recuento de monocitos, recuento de linfocitos, recuento de granulocitos, recuento de neutrófilos, relación de neutrófilo inmaduro y neutrófilo total, recuento de plaquetas, concentración de creatinina sérica, concentración de urea, concentración de lactato, exceso de bases, concentración de pO2 y HCO3 .

53. El método de la Reivindicación 51 donde se mide una medición clínica.

54. El método de la Reivindicación 53 donde se mide el ritmo respiratorio.

55. El método de la Reivindicación 53 donde se mide la temperatura.

56. El método de la Reivindicación 51 donde se mide más que una medición clínica.

57. El método de la Reivindicación 56 donde se miden el ritmo respiratorio y la temperatura.

58. El método de la reivindicación 17 o la Reivindicación 51 donde el paciente es SIRS negativo.

59. El método de la Reivindicación 17 o la Reivindicación 51 donde el paciente es SIRS positivo.

60. El método de la Reivindicación 17 o la Reivindicación 51 donde la cantidad se mide por espectrometría, cromatografía, inmunoensayo, electroforesis o ensayo enzimático.

61. El método de la Reivindicación 17 o la Reivindicación 51 donde el fluido o tejido es sangre, plasma, saliva, suero, esputo, orina, células, extracto celular o biopsia tisular.

62. El método de la reivindicación 51 que además comprende medir uno o más biomarcadores en la muestra de fluido o tejido del paciente, donde los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en endotoxina, ADN bacteriano, proteína C, procalcitonina, Proteína de unión a LBP -LPS, productos de degradación de fibrina, antitrombina III, dímero D, HLA-DR, CD-64, E-selectina, cortisol, ACTH , CD-14, sTNF-RI, sTNF- RII, TNF, IL-6, IL-8 y IL-10, D-dímero, tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial activada, inhibitor-1 activador de

plasminógeno, trombomodulina soluble, inhibidor de la fibrinolisis activable por trombina, proteína S, antitrombina y TNF-a