Un procedimiento para el rápido control térmico de un volumen de reacción (4) de un recipiente de reacción (2) que comprende un volumen de reacción (4) cerrado ≤

2 ml, preferentemente ≤ 50 μl, rodeado por al menos dos paredes (6, 8), una primera pared (6) y una segunda pared (8), siendo dicha primera pared (6) de un primer material que es permeable a al menos una longitud de onda de la luz y siendo dicha segunda pared (8) de un segundo material con una alta conductividad térmica en el que el control térmico de dicho volumen de reacción (4) en dicho recipiente de reacción (2) comprende un cambio de temperatura del volumen de reacción (4) desde una temperatura anterior hasta una temperatura objetivo en el que dicho cambio de temperatura se lleva a cabo: a) poniendo las paredes (6, 8) del recipiente de reacción (2) en contacto con un primer bloque térmico (14 a 19) i) a una temperatura superior a la temperatura objetivo si la temperatura objetivo es superior a la temperatura anterior, o de la misma manera anterior, ii) a una temperatura inferior a la temperatura objetivo si la temperatura objetivo es inferior a la temperatura durante un tiempo necesario para llevar la temperatura del volumen de reacción (4) hasta la temperatura objetivo o cerca de ella; y b) poniendo después dichas paredes (6, 8) en contacto con un segundo bloque térmico (14 a 19) a la temperatura objetivo para llevar el volumen de reacción (4) a dicha temperatura objetivo y/o mantener el volumen de reacción (4) a dicha temperatura objetivo durante el tiempo estipulado, en el que el primer bloque térmico (14 a 19) se encuentra una primera temperatura predeterminada constante y el segundo bloque térmico (14 a 19) se encuentra a una segunda temperatura predeterminada constante, es decir, la temperatura objetivo, caracterizado porque las paredes (6, 8) se ponen en contacto directo con dicho primer y dicho segundo bloque térmico (14 a 19) y dicho recipiente de reacción (2) empleado comprende también un orificio (10) para introducir una muestra, un canal a través del cual fluye la muestra hacia el volumen de reacción (4), un segundo canal, un volumen de expansión (25), un tercer canal y un segundo orificio (12) a través del cual fluye el aire desplazado por la muestra hacia el exterior del recipiente de reacción, en el que dicho volumen de expansión (25) permite la expansión de una mezcla de reacción analítica dentro de dicho volumen de reacción (4) e impide la rotura de dicho recipiente de reacción (2) por el aumento de presión ocasionado por la evaporación durante el calentamiento de dicha mezcla de reacción en el interior del volumen de reacción (4), y la transferencia de calor entre el recipiente de reacción (2) y un bloque térmico (14 a 19) se intensifica presionando dichas paredes (6, 8) de dicho recipiente de reacción (2) y dichas paredes de los bloques térmicos (14 a 19) unas contra otras y en contacto directo unas con otras

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento de control rápido de la temperatura de un recipiente de reacción que comprende un volumen de reacción para hacer reaccionar analitos biológicos o químicos con el fin de detectar y cuantificar dichos analitos en una muestra que contenga dichos analitos. La presente invención también se refiere a un sistema, y a un software para el sistema, que se usa en el procedimiento. La presente invención también se refiere al uso del sistema para la detección de tipos concretos de analitos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki y col., 1985) constituye un buen ejemplo de una reacción química que requiere un riguroso control de la temperatura: en la PCR, se amplifica una secuencia de ADN específica sometiendo la muestra de ADN a cambios cíclicos de temperatura. En primer lugar, se desnaturaliza el ADN molde de doble cadena aumentando la temperatura de la mezcla de reacción hasta aproximadamente 95 ºC. Después, se baja la temperatura hasta aproximadamente entre 40 y 70 ºC. A esta temperatura, se produce una hibridación de los cebadores sintéticos cortos de oligonucleótidos con sus secuencias complementarias, a las que se ha llevado a un estado de cadena sencilla en la etapa previa de calentamiento. Tras esto, se puede aumentar la temperatura hasta aproximadamente 72 ºC. A esta temperatura, una polimerasa de ADN termoestable extiende los cebadores, creando así una copia complementaria del ADN molde de cadena sencilla original. (En muchas aplicaciones, esta etapa de extensión se puede llevar a cabo a la misma temperatura que la etapa de hibridación. Con bastante frecuencia, tanto la hibridación del cebador como la extensión del cebador se llevan a cabo a aproximadamente 60 ºC). Repitiendo el ciclo de temperatura muchas veces, si la eficiencia de amplificación es la ideal, la cantidad de ADN molde se dobla en cada ciclo. Además de la PCR, muchas, si no todas, las reacciones biológicas y químicas requieren una determinada temperatura para que se produzcan de forma predecible. Entre los ejemplos de dichas reacciones con condiciones de temperatura definidas, se incluyen otras reacciones de amplificación de ácidos nucleicos [como la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) (Compton, 1991), reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Barany, 1991), amplificación con desplazamiento de cadena (SDA) (Walker y col., 1992) y amplificación por círculo rodante (RCA) (Banér y col., 1998)], formación de inmunocomplejos (es decir unión de un anticuerpo a un antígeno) (Price y Newman, 1997) y prácticamente todas las demás reacciones enzimáticas y químicas.

Existen varias soluciones para controlar una temperatura de reacción. En la PCR, los recipientes de reacción se colocan normalmente en un bloque de metal, cuya temperatura se cambia periódicamente. Sin embargo, esta solución presenta un inconveniente importante: se requiere un tiempo considerable para que cambie la temperatura del bloque; una vez alcanzadas las temperaturas objetivo, la reacción se produce muy rápidamente. Por lo tanto, es la masa térmica del bloque, y no la reacción en sí, la que limita la velocidad de la reacción.

Se puede aumentar la tasa de cambio de la temperatura en el interior de un recipiente de reacción mediante una técnica conocida por los expertos en la materia como over o under shooting (exceso o defecto de temperatura): para enfriar el contenido de un recipiente de reacción hasta una baja temperatura objetivo, primero se enfría el bloque de metal hasta una temperatura inferior a la temperatura objetivo, tras lo cual, se vuelve a calentar el bloque de metal hasta la temperatura objetivo. O bien, para calentar el contenido del recipiente de reacción hasta una alta temperatura objetivo, primero se calienta el bloque de metal hasta una temperatura superior a la temperatura objetivo, tras lo cual, se enfría el bloque de metal hasta la alta temperatura objetivo. De este modo, se puede aumentar la tasa de cambio de la temperatura en el interior de un recipiente de reacción. No obstante, el procedimiento todavía es bastante lento, debido al hecho de que el bloque de metal tarda cierto tiempo en cambiar de temperatura.

Otra solución para el ciclado térmico incluye el uso de aire caliente y frío para cambiar la temperatura de una mezcla de reacción que se coloca en el interior de un capilar de vidrio con una gran relación superficie-volumen (Wittwer y col., 1997). Esto permite lograr un cambio de temperatura muy rápido. Sin embargo, cuando se usan capilares de vidrio, el volumen máximo de reacción a menudo es tan pequeño, que empieza a limitar la sensibilidad analítica de la aplicación. Además, las propiedades químicas del vidrio pueden inhibir algunas reacciones químicas. La fragilidad de los capilares de vidrio también supone un problema, ya que se rompen muy fácilmente al manipularlos. Otra solución se basa en mover físicamente la mezcla de reacción a través de un canal que pasa a través de áreas con diferentes temperaturas. Dicha técnica ha sido descrita, por ejemplo, por Kopp y col. (1998). No obstante, en estas aplicaciones, los volúmenes de reacción son aún más pequeños y, por tanto, la sensibilidad analítica se ve seriamente comprometida. Además, hay que reutilizar el mismo canal para muchas muestras, lo que introduce un serio riesgo de contaminación por arrastre entre diferentes muestras o, en caso contrario, los recipientes de amplificación tienen que ser de diseño desechable y de un solo uso, lo cual aumenta de forma considerable los costes totales del ensayo, ya que los costes de producción de los canales microfluídicos pueden ser mucho más elevados que los costes de producción de simples tubos de reacción de plástico; por supuesto, dependiendo del volumen de fabricación. Otra solución más se basa en tener varios bloques de metal o baños de agua a temperaturas definidas e ir cambiando la ubicación del recipiente de reacción cíclicamente entre los bloques o baños con diferentes temperaturas. Entre los ejemplos de termocicladores basados en este principio que se encuentran disponibles en el mercado, se incluyen el RoboCycler (Stratagene, EE.UU.) y el H2OBIT Thermal Cycler (ABgene, Reino Unido). En estas aplicaciones, se logra una mayor tasa de cambio de temperatura que con un único bloque. Sin embargo, al emplear tubos de muestras con relaciones superficie-volumen pequeñas, la tasa de cambio de temperatura sigue sin ser tan rápida como puede llegar a serlo.

En los documentos US 4.902.624, EP 0 31 8255 y US 5.736.106, se han descrito técnicas en las que un recipiente de reacción con una elevada relación superficie-volumen se traslada cíclicamente entre bloques térmicos a temperaturas definidas. En estas soluciones se encuentran ciertos problemas. En primer lugar, la tasa de cambio de temperatura no es la ideal para todas las aplicaciones. En segundo lugar, cuando la mezcla de reacción se calienta a altas temperaturas, la presión en el interior del recipiente de reacción aumenta, lo cual puede hacer que se rompa el recipiente de reacción y que se evapore la mezcla de reacción.

En los casos en los que no se necesitan cambios cíclicos de temperatura, por ejemplo en la mayoría de los inmunoensayos, la práctica habitual consiste en colocar el recipiente de reacción en la atmósfera de un incubador ajustado a una temperatura definida. En estos procedimientos, se tarda un tiempo considerable en calentar o enfriar el contenido del recipiente de reacción, ya que, debido a la baja relación superficie-volumen de los recipientes y a la escasa conductividad térmica del aire estático, la tasa de intercambio térmico entre el recipiente y su entorno no es la ideal. En el documento US 5.446.263 se describe un dispositivo para ajustar selectivamente la temperatura de una muestra a diferentes valores.

OBJETIVOS Y RESUMEN DE LA PRESENTE INVENCIÓN

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para un rápido control térmico de un volumen de reacción (4) de un recipiente de reacción (2). Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un sistema mejorado (20) para detectar y/o cuantificar un analito o analitos biológicos y/o químicos en una muestra que supuestamente contenga dicho analito o analitos. Otro objeto más de la presente invención consiste en proporcionar usos para el sistema de detección y/o cuantificación.

De este modo, la invención se refiere a un procedimiento según la reivindicación 1.

La invención también se refiere a un sistema (20) para detectar... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para el rápido control térmico de un volumen de reacción (4) de un recipiente de reacción (2) que comprende un volumen de reacción (4) cerrado ≤ 2 ml, preferentemente ≤ 50 μl, rodeado por al menos dos paredes (6, 8), una primera pared (6) y una segunda pared (8), siendo dicha primera pared (6) de un primer material que es permeable a al menos una longitud de onda de la luz y siendo dicha segunda pared (8) de un segundo material con una alta conductividad térmica en el que el control térmico de dicho volumen de reacción (4) en dicho recipiente de reacción

(2) comprende un cambio de temperatura del volumen de reacción (4) desde una temperatura anterior hasta una temperatura objetivo en el que dicho cambio de temperatura se lleva a cabo:

a) poniendo las paredes (6, 8) del recipiente de reacción (2) en contacto con un primer bloque térmico (14 a 19)

i) a una temperatura superior a la temperatura objetivo si la temperatura objetivo es superior a la temperatura anterior, o de la misma manera

ii) a una temperatura inferior a la temperatura objetivo si la temperatura objetivo es inferior a la temperatura anterior,

durante un tiempo necesario para llevar la temperatura del volumen de reacción (4) hasta la temperatura objetivo

o cerca de ella; y

b) poniendo después dichas paredes (6, 8) en contacto con un segundo bloque térmico (14 a 19) a la temperatura objetivo para llevar el volumen de reacción (4) a dicha temperatura objetivo y/o mantener el volumen de reacción (4) a dicha temperatura objetivo durante el tiempo estipulado,

en el que el primer bloque térmico (14 a 19) se encuentra una primera temperatura predeterminada constante y el segundo bloque térmico (14 a 19) se encuentra a una segunda temperatura predeterminada constante, es decir, la temperatura objetivo, caracterizado porque las paredes (6, 8) se ponen en contacto directo con dicho primer y dicho segundo bloque térmico (14 a 19) y

dicho recipiente de reacción (2) empleado comprende también un orificio (10) para introducir una muestra, un canal a través del cual fluye la muestra hacia el volumen de reacción (4), un segundo canal, un volumen de expansión (25), un tercer canal y un segundo orificio (12) a través del cual fluye el aire desplazado por la muestra hacia el exterior del recipiente de reacción,

en el que dicho volumen de expansión (25) permite la expansión de una mezcla de reacción analítica dentro de dicho volumen de reacción (4) e impide la rotura de dicho recipiente de reacción (2) por el aumento de presión ocasionado por la evaporación durante el calentamiento de dicha mezcla de reacción en el interior del volumen de reacción (4), y

la transferencia de calor entre el recipiente de reacción (2) y un bloque térmico (14 a 19) se intensifica presionando dichas paredes (6, 8) de dicho recipiente de reacción (2) y dichas paredes de los bloques térmicos (14 a 19) unas contra otras y en contacto directo unas con otras.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se llevan a cabo varios cambios de temperatura del volumen de reacción (4), y más de uno de dichos cambios de temperatura se llevan a cabo usando cada cambio un par de bloques térmicos (14 a 19) consistentes en un primer y un segundo bloque térmico (14 a 19), en el que cada bloque térmico (14 a 19) de cada uno de dichos pares puede ser también un bloque térmico (14 a 19) de uno o más de los otros dichos pares, de acuerdo con las etapas a) y b) de la reivindicación 1.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque todos los cambios de temperatura del volumen de reacción (4) se llevan a cabo de acuerdo con las etapas a) y b) de la reivindicación 1.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la conductividad térmica del segundo material es ≥ 10 mW/mmK, preferentemente ≥ 100 mW/mmK.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el segundo material de la segunda pared (8) se selecciona entre el grupo formado por los metales, preferentemente aluminio o cobre.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la superficie externa de la segunda pared (8) es aplanada, preferentemente plana.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la relación del área de la segunda pared (8) que encierra, es decir, el área de la segunda pared orientada hacia, el volumen de reacción

(4) con respecto a dicho volumen es ≥ 0,5 mm2/µl, preferentemente ≥ 5 mm2/µl.

8. Un sistema (20) para detectar y/o cuantificar un analito o analitos biológicos y/o químicos en una muestra que supuestamente contenga dicho analito o analitos, que comprende

i) uno o más recipientes de reacción (2) que comprenden un volumen de reacción (4) cerrado ≤ 2 ml, preferentemente ≤ 50 μl, rodeado por al menos dos paredes (6, 8), una primera pared (6) y una segunda pared (8), siendo dicha primera pared (6) de un primer material que es permeable a al menos una longitud de onda de la luz y siendo dicha segunda pared (8) de un segundo material con una alta conductividad térmica,

ii) cuatro o más bloques térmicos (14 a 19), y

iii) unos medios (22) para poner dichas paredes (6, 8) de dichos recipientes de reacción (2) en contacto con cada uno de dichos bloques térmicos (14 a 19),

en el que una unidad de procesamiento de datos, con un software para la reducción de datos dedicada para dicha detección y/o cuantificación de dicho analito o analitos, está dispuesta para controlar al menos un cambio de temperatura del volumen de reacción (4) desde una temperatura precedente hasta una temperatura objetivo de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas paredes (6, 8) están dispuestas para ponerlas en contacto directo con dichos primer y segundo bloques térmicos (14 a 19), y

dicho recipiente de reacción (2) empleado comprende también un orificio (10) para introducir una muestra, un canal a través del cual fluye la muestra hacia el volumen de reacción (4), un segundo canal, un volumen de expansión (25), un tercer canal y un segundo orificio (12) a través del cual fluye el aire desplazado por la muestra hacia el exterior del recipiente de reacción (2),

en el que dicho volumen de expansión (25) permite la expansión de una mezcla de reacción analítica dentro de dicho volumen de reacción (4) e impide la rotura de dicho recipiente de reacción (2) por el aumento de presión ocasionado por la evaporación durante el calentamiento de dicha mezcla de reacción en el interior del volumen de reacción (4), y dicho sistema comprende unos medios para presionar dichas paredes (6, 8) de dicho recipiente de reacción (2) y dichas paredes de los bloques térmicos (14 a 19) unas contra otras y en contacto directo unas con otras.

9. El sistema según la reivindicación 8, caracterizado porque la conductividad térmica del segundo material es ≥ 10 mW/mmK, preferentemente ≥ 100 mW/mmK.

10. El sistema según la reivindicación 9, caracterizado porque el segundo material de la segunda pared (8) se selecciona entre el grupo formado por los metales, preferentemente aluminio o cobre.

11. El sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque la superficie externa de la segunda pared (8) es aplanada, preferentemente plana.

12. El sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque la relación del área de la segunda pared (8) que encierra, es decir, el área de la segunda pared orientado hacia, el volumen de reacción (4) con respecto a dicho volumen es ≥ 0,5 mm2/µl, preferentemente ≥ 5 mm2/µl.

13. El sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque la primera pared (6) es permeable a la luz visible y ultravioleta (UV).

14. El sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado porque el primer material de la primera pared (6) se selecciona entre el grupo formado por plásticos o vidrios.

15. El sistema (20) según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, caracterizado porque los medios (22) para poner las paredes del recipiente de reacción en contacto directo con los bloques térmicos (14 a 19) comprenden un soporte (24) para dicho recipiente (2) con unos medios (22) para mover dicho soporte (24) en una trayectoria circular o lineal y dichos bloques térmicos (14 a 19) se encuentran en diferentes puntos de dicha trayectoria circular o lineal, de manera que dichas paredes (6, 8) de dicho recipiente de reacción (2) se puedan poner en contacto directo con cada bloque térmico (14 a 19) moviendo dicho soporte (24) a lo largo de dicha trayectoria circular o lineal.

16. El uso del sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real).

17. El uso del sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, preferentemente la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación por círculo rodante (RCA) y reacción en cadena de la ligasa (LCR).

18. El uso del sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para ensayos de unión de ligandos.