- Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido de fusión,

en el que dicho polipéptido de fusión tiene actividad ß(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferasa III o actividad ß(1,4)-galactosiltransferasa, y comprende el dominio de localización en Golgi de una manosidasa II humana

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la modificación de la glicosilación de proteínas. Más en concreto, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo constructos de fusión, que tienen actividad catalítica y al uso de éstas para la modificación de la glicosilación de células hospedantes para generar polipéptidos con mejores propiedades terapéuticas, incluyendo anticuerpos con mayor unión al receptor de Fc y mayor función efectora. Antecedentes de la técnica

Las glicoproteínas median en muchas funciones esenciales en los seres humanos, otros organismos eucariotas y algunos procariotas, incluyendo la catálisis, la señalización, la comunicación célula-célula, y el reconocimiento y la asociación molecular. Forman la mayoría de las proteínas no citosólicas en los organismos eucariotas (Lis et al., Eur. J. Biochem., 218:1-27 (1993)). Muchas glicoproteínas se han aprovechado para fines terapéuticos, y durante las últimas dos décadas, las versiones recombinantes de glicoproteínas segregadas naturales han sido el producto principal de la industria biotecnológica. Los ejemplos incluyen la eritropoyetina (EPO), los anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAb terapéuticos), el activador del plasminógeno tisular (tPA), el interferón-º (IFN-º), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), y la gonadotropina coriónica humana (hCG) (Cumming et al., Glycobiology, 1:115-130 (1991)).

El componente de oligosacárido puede afectar significativamente a las propiedades importantes para la eficacia de una glicoproteína terapéutica, incluyendo la estabilidad física, la resistencia a ataques de proteasas, las interacciones con el sistema inmunológico, la farmacocinética y la actividad biológica específica. Estas propiedades pueden depender no sólo de su presencia o ausencia, sino también de las estructuras específicas de los oligosacáridos. Pueden realizarse algunas generalizaciones entre la estructura de los oligosacáridos y la función de la glicoproteína. Por ejemplo, ciertas estructuras de oligosacáridos median en la rápida eliminación de la glicoproteína de la corriente sanguínea a través de interacciones con proteínas de unión a carbohidratos específicas, mientras que otras pueden ser unidas por anticuerpos y desencadenar reacciones inmunológicas no deseadas (Jenkins et al., Nature Biotechnol., 14:975-981 (1996)).

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Las células de mamífero son los hospedantes preferidos para la producción de glicoproteínas terapéuticas, debido a su capacidad para glicosilar proteínas en la forma más compatible para la aplicación humana (Cumming et al., Glycobiology, 1:115-130 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol., 14:975-981 (1996)). Las bacterias muy raramente glicosilan proteínas, y al igual que otros tipos de hospedantes habituales, tales como células de levadura, de hongos filamentosos, de insecto y vegetales, producen unos patrones de glicosilación asociados con la rápida eliminación de la corriente sanguínea, interacciones inmunológicas no deseadas y, en algunos casos específicos, una menor actividad biológica. Entre las células de mamífero, las células de ovario de hámster chino (CHO) han sido las que se han utilizado más habitualmente durante las últimas dos décadas. Además de producir unos patrones de glicosilación adecuados, estas células permiten la generación constante de líneas de células clónicas muy productivas y genéticamente estables. Éstas pueden cultivarse hasta densidades altas en biorreactores sencillos utilizando un medio exento de suero y permiten el desarrollo de bioprocesos seguros y reproducibles. Otras células animales que se emplean de modo habitual incluyen las células de riñón de cría de hámster (BHK), células de mieloma de ratón NSO y SP/20. En fechas más recientes también se ha ensayado la producción a partir de animales transgénicos (Jenkins et al., Nature Biotechnol., 14:975-981 (1996)).

Todos los anticuerpos contienen estructuras de carbohidratos en posiciones conservadas en las regiones constantes de la cadena pesada, poseyendo cada isotipo una disposición exclusiva de estructuras de carbohidratos N-enlazados, que afectan de modo variable al ensamblaje de las proteínas, su secreción o su actividad funcional (Wright, A., y Morrison, S.L., Trends Biotech., 15:26-32 (1997)). La estructura del carbohidrato N-enlazado unido varía considerablemente, dependiendo del grado de procesamiento, y puede incluir oligosacáridos con múltiples ramificaciones y alto contenido en manosa, así como oligosacáridos complejos biantenarios (Wright, A., y Morrison, S.L., Trends Biotech., 15:26-32 (1997)). De forma típica, existe un procesamiento heterogéneo de las estructuras de los oligosacáridos centrales unidas en un sitio de glicosilación particular, de modo que incluso los anticuerpos monoclonales existen como múltiples glicoformas. De manera similar, se ha demostrado que se producen diferencias importantes en la glicosilación de anticuerpos entre las líneas celulares, e incluso se observan pequeñas diferencias en una línea celular concreta cultivada bajo diferentes condiciones de cultivo (Lifely, M.R. et al., Glycobiology, 5(8):813-822 (1995)).

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Los anticuerpos monoclonales (mAb) no conjugados pueden ser medicinas útiles para el tratamiento del cáncer, según ha sido demostrado por la aprobación por parte del U.S. Food and Drug Administration del rituximab (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA; y Genentech Inc., San Francisco, CA) para el tratamiento del linfoma no hodgkiniano de células B CD20-positivo, de grado bajo o folicular, del trastuzumab (Herceptin™; Genentech Inc.) para el tratamiento del cáncer de mama avanzado (Grillo-López, A. J., et al., Semin. Oncol., 26:66-73 (1999); Goldenberg, M.M., Clin. Then., 21:309-318 (1999)), del gemtuzumab (Mylotarg™, Celltech/Wyeth-Ayerst) para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda en recaída, y del alemtuzumab (CAMPATH™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica de células B. El éxito de estos productos se basa no sólo en su eficacia sino también en sus extraordinarios perfiles de seguridad (Grillo-López, A. J., et al., Semin. Oncol., 26:66-73 (1999); Goldenberg, M.M., Clin. Then., 21:309-318 (1999)). A pesar de los logros de estos fármacos, actualmente existe un gran interés en obtener una actividad de anticuerpos específicos mayor que la se obtiene de modo típico con la terapia de mAb no conjugados.

Una manera de obtener un gran aumento en la potencia, manteniendo un proceso de producción sencillo y evitando potencialmente efectos secundarios no deseados y significativos, es potenciar las funciones efectoras naturales mediadas por células de los mAb modificando su componente de oligosacáridos (Umaña, P. et al., Nature Biotechnol., 17:176-180 (1999)). Los anticuerpos de tipo IgG1, que son los anticuerpos que se emplean más habitualmente en la inmunoterapia del cáncer, son glicoproteínas que tienen un sitio de glicosilación N-enlazado conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos a Asn297 están escondidos entre los dominios CH2, formando contactos extensos con el esqueleto polipeptídico, y su presencia es fundamental para que el anticuerpo medie en funciones efectoras, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely, M.R., et al., Glycobiology, 5:813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol Rev., 163:59-76 (1998); Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotechnol., 15:26-32 (1997)).

Los presentes inventores han demostrado previamenteque la sobreexpresión en células de ovario de hámster chino (CHO) de º(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glicosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos bisectados, aumenta significativamente la actividad ADCC in vitro de un anticuerpo monoclonal quimérico antineuroblastoma (chCE7) producido por las células CHO

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modificadas (véase Umafia, P. et al., Nature Biotechnol., 17:176-180 (1999), publicación internacional nº WO 99/54342). El anticuerpo chCE7 pertenece a una gran clase de mAb no conjugados que tienen una alta afinidad y especificidad de tumor pero que tienen una potencia demasiado pequeña para ser clínicamente útiles cuando se producen en líneas celulares industriales convencionales que carecen de la enzima GnTIII (Umana, P. et al., Nature Biotechnol., 17:176-180 (1999)). Este estudio fue el primero en...

1. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido de fusión, en el que dicho polipéptido de fusión tiene actividad º(1,4)-N5 acetilglucosaminiltransferasa III o actividad º(1,4)-galactosiltransferasa, y comprende

el dominio de localización en Golgi de una manosidasa II humana.

2. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico de la º(1,4)-Nacetilglucosaminiltransferasa III o de la º(1,4)-galactosiltransferasa.

10 3. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, que tiene la secuencia de nucleótidos que aparece en la figura 24 y en SEQ ID NO:14. 4. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que aparece en la figura 24 y en SEQ ID NO:15.

15 5. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, que comprende una secuencia que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una sonda de hibridación cuya secuencia de nucleótidos consiste en la secuencia de nucleótidos que aparece en la figura 24 y en SEQ ID NO:14.

6. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, que comprende una 20 secuencia al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos que aparece en la figura 24 y en SEQ ID NO:14.

7. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos que aparece en la figura 24 y en

25 SEQ ID NO:15. 8. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que aparece en la figura 24 y en SEQ ID NO:15 con sustituciones de aminoácidos conservadoras.

30 9. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8. 10. Un polipéptido de fusión codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1.

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11. Un polipéptido de fusión según la reivindicación 10, que comprende el dominio catalítico de la º(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III o de la º(1,4)galactosiltransferasa.

12. Una célula hospedante de mamífero, que comprende un vector de

5 expresión que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido de fusión, en la que dicho polipéptido de fusión tiene actividad º(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III o actividad º(1,4)galactosiltransferasa, y comprende el dominio de localización en Golgi de una manosidasa II humana.

10 13. Un método para producir un polipéptido de fusión que tiene actividad º(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III o actividad º(1,4)-galactosiltransferasa, que comprende cultivar la célula hospedante de la reivindicación 12 en un medio bajo condiciones que permiten la expresión de dicho ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de fusión, y recuperar dicho polipéptido de fusión del cultivo resultante.

15 14. Un método para modificar el perfil de glicosilación de un polipéptido producido por una célula hospedante, que comprende introducir en dicha célula hospedante el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

15. Un método para modificar el perfil de glicosilación de un polipéptido producido por una célula hospedante, que comprende introducir en dicha célula 20 hospedante el vector de expresión de la reivindicación 9. 16. Un método según la reivindicación 13, 14 ó 15, en el que dicho polipéptido es IgG o un fragmento de ésta. 17. Un método según la reivindicación 16, en el que dicho polipéptido es IgG1

o un fragmento de ésta.

25 18. Un método según la reivindicación 16, en el que dicho polipéptido es una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una IgG humana. 19. Una célula hospedante de mamífero modificada para que exprese al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad

30 º(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III o actividad º(1,4)-galactosiltransferasa, y que comprende el dominio de localización en Golgi de una manosidasa II humana, en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fc de un polipéptido producido por dicha célula hospedante, en la que dicho polipéptido se selecciona del grupo que consiste en una molécula de anticuerpo completa, un fragmento de

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anticuerpo, y una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina. 20. Una célula hospedante según la reivindicación 19, en la que dicho polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico de la º(1,4)-N5 acetilglucosaminiltransferasa III o de la º(1,4)-galactosiltransferasa. 21. Un método para producir un polipéptido en una célula hospedante de mamífero, que comprende:

a. cultivar una célula hospedante de mamífero modificada para que exprese al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad 10 º(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III o actividad º(1,4)-galactosiltransferasa, y que comprende el dominio de localización en Golgi de una manosidasa II humana, bajo condiciones que permiten la producción de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en una molécula de anticuerpo completa, un fragmento de anticuerpo, y una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una

15 inmunoglobulina, en el que dicho polipéptido de fusión se expresa en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fc de dicho polipéptido producido por dicha célula hospedante; y

b. aislar dicho polipéptido. 22. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, que comprende una

20 secuencia que codifica un polipéptido de fusión, en el que dicho polipéptido de fusión tiene actividad º(1,4)-galactosiltransferasa, y comprende el dominio de localización en Golgi de una manosidasa II humana.

23. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 22, en el que dicho polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico de la º(1,4)-galactosiltransferasa. 25 24. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado según

una cualquiera de las reivindicaciones 22-23. 25. Un polipéptido de fusión codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1, que tiene actividad º(1,4)-galactosiltransferasa. 26. Un polipéptido de fusión según la reivindicación 25, que comprende el 30 dominio catalítico de la º(1,4)-galactosiltransferasa. 27. Una célula hospedante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 24. 28. Un método para producir un polipéptido de fusión que tiene actividad

º(1,4)-galactosiltransferasa, que comprende cultivar la célula hospedante de la 35 reivindicación 27 en un medio bajo condiciones que permiten la expresión de dicho

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ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de fusión, y recuperar dicho polipéptido de fusión del cultivo resultante. 29. Un método para modificar el perfil de glicosilación de un polipéptido producido por una célula hospedante, que comprende introducir en dicha célula 5 hospedante el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 22-23.

30. Un método para modificar el perfil de glicosilación de un polipéptido producido por una célula hospedante, que comprende introducir en dicha célula hospedante el vector de expresión de la reivindicación 24.

31. Una célula hospedante de mamífero según la reivindicación 12, que 10 comprende además:

un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en la que dicho polipéptido tiene actividad manosidasa II (ManII).

32. La célula hospedante de la reivindicación 31, en la que dicho polipéptido 15 de fusión comprende el dominio catalítico de GnTIII. 33. La célula hospedante de la reivindicación 31, en la que dicho polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico de GalT. 34. Un célula hospedante de levadura o de insecto, que comprende:

(a) un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que 20 codifica un polipéptido de fusión, en la que dicho polipéptido de fusión tiene actividad

º(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), y comprende el dominio de localización en Golgi de una manosidasa II humana; y

(b) un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en la que dicho polipéptido tiene actividad manosidasa II 25 (ManII).

35. La célula hospedante de la reivindicación 31, en la que dicha célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63, una célula PER, una célula PER.C6, y una célula de hibridoma.

30 36. La célula hospedante de la reivindicación 31, que comprende además un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en la que dicho polipéptido tiene actividad º(1,2)-Nacetilglucosaminiltransferasa II (GnTII).

37. La célula hospedante de la reivindicación 36, en la que dicha molécula de 35 ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión, dicha molécula de ácido nucleico

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que codifica un polipéptido que tiene actividad ManII, y dicha molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnTII están en el mismo vector de expresión.

38. La célula hospedante de la reivindicación 36, en la que dicha molécula de

5 ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión, dicha molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad ManII, y dicha molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnTII están cada una en diferentes vectores de expresión.

39. La célula hospedante de la reivindicación 36, en la que dicha molécula de

10 ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión está en un vector de expresión, y dicha molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad ManII y dicha molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnTII están en el mismo vector de expresión. 40. La célula hospedante de la reivindicación 36, en la que dicha molécula de

15 ácido nucleico que codifica una ManII está en un vector de expresión, y dicha molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión y dicha molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnTII están en el mismo vector de expresión. 41. La célula hospedante de la reivindicación 36, en la que dicha molécula de

20 ácido nucleico que codifica dicha GnTII está en un vector de expresión, y dicha molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión y dicha molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad ManII están en el mismo vector de expresión. 42. La célula hospedante de la reivindicación 36, en la que dicho polipéptido

25 de fusión comprende el dominio catalítico de GalT. 43. La célula hospedante de la reivindicación 36, en la que dicha célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63, una célula PER, una célula PER.C6, y una célula de hibridoma.