CONSTRUCCIÓN GÉNICA PLASMÍDICA (PMTT1LUCFF) INCLUYENDO EL PROMOTOR DEL GEN MTT1 DEL CILIADO TETRAHYMENA THERMOPHILA PARA LA ELABORACIÓN DE UN BIOSENSOR CELULAR ÚTIL EN LA DETECCIÓN DE METALES PESADOS.

Construcción génica plasmídica pMTT1LucFF, construida a partir del plásmido pBt{dl}-7Luc,

tras insertar la construcción PMTT1::lucFF. Esta construcción está formada por la región promotora del gen MTT1 (codificante para una Cd-metalotioneina) del ciliado T. thermophila y el gen reportero LucFF (codificante de la luciferasa).Este plásmido es la herramienta molecular base para la construcción de un biosensor celular en el citado-modelo Tetrahymena thermophila, que sea útil para la detección de metales pesados en muestras acuáticas y/o terrestres presumiblemente contaminadas

Construcción génica plasmídica (pMTT1LucFF) incluyendo el promotor del gen MTT1 del ciliado Tetrahymena thermophila para la elaboración de un biosensor celular útil en la detección de metales pesados.

La presente invención se refiere a una construcción génica constituida con el promotor Pmtt1 del gen MTT1 (cuya secuencia ADNc se ha depositado en el GenBank con el número de acceso; EF195745) codificante de una cadmiometalotioneina del protozoo ciliado Tetrahymena thermophila y el gen reportero LucFF codificante de la luciferasa. Esta construcción génica fue incorporada en el plásmido pBtΔ-7Luc, originando un nuevo plásmido que hemos denominado pMTT1LucFF. Este plásmido, objeto de la patente que se solicita, es la base para la obtención de un biosensor celular basado en el ciliado T. thermophila, que sea útil para la detección rápida de metales pesados en muestras naturales (acuáticas o terrestres) presumiblemente contaminadas.

Antecedentes de la invención El promotor Pmtt1, que regula la expresión del gen MTT1 que codifica una cadmio-metalotioneina (Cd-MT) en el microorganismo eucariota (ciliado) T. thermophila, ha sido caracterizado y estudiado por nuestro grupo de trabajo. El análisis comparativo de la expresión de este gen con las dos restantes isoformas que existen de Cd-MTs en el genoma de este ciliado, ha demostrado que este promotor es el segundo más fuerte de las tres isoformas existentes. Por lo que, es una herramienta molecular idónea para sobre-expresar genes heterólogos y/o genes reporteros que sean útiles en la detección de la presencia de factores o elementos que induzcan la apertura del promotor (fundamentalmente metales pesados) .

Este promotor ya se ha utilizado para expresión heteróloga de proteínas de interés por otros autores (Shang et al., 2002) , pero ésta es la primera vez que se utiliza éste promotor para la construcción de un sistema génico reportero de la presencia de metales pesados, siendo esta construcción una herramienta molecular para la obtención de un biosensor celular en T. thermophila, biotecnológicamente útil en la detección de metales pesados en muestras contaminadas.

Descripción de la invención Para generar la construcción PMTT1::lucFF, en primer lugar se amplificó la región promotora (2.479 pb) de MTT1 utilizando los cebadores MTT1UTRA/MTT1UTRB (5'ATAGGATCCCAATAAATAATAGCAATGACTATAC3'/ 5'ATGAAGCTTGCCATTATTTTAAGTTTAGTATTATTATTTATTTTATTAG3') , que añaden las dianas de restricción BamHI y HindIII a los extremos 5' y 3' del promotor de MTT1. El producto de PCR de 2.491 pb obtenido fue clonado, secuenciado e insertado en el sitio específico BamHI/HindIII del vector pBtΔ7Luc, de modo que el gen lucFF quedase bajo control del promotor MTT1, y ambos flanqueados por las regiones 5' y 3' UTR del gen BTU1-1 (β-tubulina 1) , lo que permite su inserción en el locus btul-1 de la cepa CU522 de T. thermophila mediante recombinación homologa. A este nuevo plásmido se le denominó pMTT1LucFF.

Breve descripción de los dibujos En la figura 1, se muestra un esquema del plásmido pMTT1LucFF. El plásmido completo tiene una longitud de 9.233 pb, y en él se distingue la región insertada 5'UTRMTT1 (la secuencia nucleotídica de la misma se muestra en la Fig. 2) fusionada con la región del gen reportero lucFF (cuya secuencia nucleotídica se muestra en la Fig. 3) . Flanqueando ambos extremos están las regiones 3' y 5'UTR (regiones no codificantes) del alelo 1 del gen de la βtubulina. Igualmente, con la finalidad de que este plásmido se mantenga y replique en un hospedador bacteriano, tiene el origen de replicación del plásmido ColE1 y el gen de la resistencia a ampicilina (AmpR) .

Cepa recombinante MTT1Luc

El plásmido pMTT1LucFF se digiere con las enzimas KpnI y SacI (localizadas más allá de las regiones flanqueantes 3 y 5'UTR del gen btul-1, lo que libera la construcción reportera completa PMTT1::lucFF, la cual es introducida en el macronucleo de la cepa CU522 de T. thermophila mediante transformación biolística. Una vez introducida en el genoma macronuclear, ésta construcción eventualmente recombina con la región homologa cromosómica macronuclear 5' y 3'UTR del gen btul-1, incorporándose así al genoma. Esta cepa denominada MTT1Luc, constituye un biosensor celular para la detección de metales pesados en muestras contaminadas, como así lo demuestra la validación (utilizando muestras de agua y/o suelo artificialmente contaminadas con metales pesados o muestras naturales contaminadas o no con metales pesados) llevada a cabo en nuestro laboratorio.

Referencia citada Shang, Y., X. Song, J. Bowen, R. Corstanje, Y. Gao, J. Gaertig and M. A. Gorovsky (2002) . A robust induciblerepressible promoter greatly facilitates gene knockouts, conditional expression, and overexpression of homologous and heterologous genes in Tetrahymena thermophila. Proc Natl Acad SciUSA 99 (6) : 3734-9.

Texto libre de la lista de secuencias Traducción por orden de presentación Application Project: Proyecto de Solicitud de Patente <120> Title: Título <130> AppFileReference: Referencia del Expediente <140> CurrentAppNumber: Número de Solicitud de Patente en trámite.

<141> CurrentFilingDate: Fecha de presentación de la solicitud en trámite.

Sequence: Secuencia <213> OrganismName: Nombre del Organismo <400> PresequenceString: Secuencia <212> Type: Tipo de secuencia <211> Length: Longitud SequenceName: Nombre de la secuencia SequenceDescription: Descripción de la secuencia

1. Construcción génica plasmídica pMTT1LucFF, caracterizada por la fusión del promotor del gen MTT1 (PMTT1) del ciliado Tetrahymena thermophila con el gen reportero LucFF (codificante de luciferasa) PMTT1::lucFF.

2. Cepa transformada (MTT1Luc) de T. thermophila con el plásmido indicado en la reivindicación 1.

3. La utilización de la cepa de T. thermophila indicada en la reivindicación 2, para su utilización como biosensor celular en un bioensayo de detección de metales pesados en muestras acuáticas y/o terrestres.

LISTA DE SECUENCIAS

1. Secuencia de la región 5'UTRMTT1 (citado en el texto como Fig. 2) 2. Secuencia del gen reportero LucFF (citado en el texto como Fig. 3)