Composición celular in vitro con sobrexpresión simultánea de genes humanos mutados PS1 M146V,

APP SWE y TAU P301L.Composición que comprende cultivos primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de embriones de ratones 3XTgAD cultivados en condiciones despolarizantes. Además, la invención se refiere a un método in vitro para evaluar la eficacia de compuestos y materiales para modificar, tratar o prevenir enfermedades relacionadas con patología tau, beta-amiloide o APP que comprende el empleo de cultivos primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de embriones de ratones 3XTgAD cultivados en condiciones despolarizantes

Composición celular in vitro con sobreexpresión simultánea de genes humanos mutados PS1_M146V, APP_Swe y tau_P301L.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un modelo in vitro obtenido a partir de ratones 3xTg-AD para la enfermedad de Alzheimer con sobreexpresión simultánea de PS1_M146V, APP_Swe y tau_P301L así como su utilidad para el estudio de las bases biológicas de la enfermedad de alzheimer y/o enfermedades relacionadas con patología tau y beta-amiloide y para la evaluación de terapias preventivas, terapéuticas y/o paliativas para esta enfermedad.

Estado de la técnica

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa de carácter progresivo, de origen todavía desconocido, y frente a la que no se puede, actualmente, ofrecer ningún tratamiento capaz de curarla o prevenirla. Afecta al 5-7% de las personas de más de sesenta y cinco años y es la causa de invalidez, dependencia y mortalidad más frecuente entre las personas de edad avanzada. Según los datos disponibles en la Fundación Alzheimer España (http://www.fundacionalzheimeresp.org) cerca de 700.000 personas están afectadas en España y se manifiestan más de 100.000 nuevos enfermos al año, lo que representa que más de dos millones de españoles y sus familiares, hoy en día, ven su vida trastornada por la enfermedad. Según las últimas estimaciones, 8 millones de europeos están afectados por la enfermedad de Alzheimer y además teniendo en cuenta el envejecimiento de la población se prevé que el número de enfermos se duplique en 2020 y triplique en 2050.

A nivel neuropatológico la EA se caracteriza por dos estructuras anormales que se acumulan en el cerebro: depósitos amiloides y placas neurofibrilares. Los depósitos amiloides son fibras extracelulares formadas por β-amiloide, (βA, concretamente βA40 y βA42), péptidos generados por la ruptura proteolítica de la proteína precursora de β-amiloide (APP). Las marañas neurofibrilares, en contraste, son filamentos intracelulares formados por la polimeración de tau, que normalmente funciona como proteína asociada a los microtúbulos en los axones neuronales. Aunque hoy en día, existe considerable debate acerca de si las fibras de βA y los filamentos de tau poseen toxicidad intrínseca o simplemente son resultado de otros procesos neurodegenerativos, numerosas evidencias confirman el papel de tau y βA en la neurodegeneración. A pesar de las investigaciones iniciales encaminadas a dilucidar el papel individual de tau y βA en la EA, los últimos estudios indican que la patología amiloide puede empeorar la patología tau y que no necesariamente los tratamientos que mejoran la patología amiloide mejoran también la patología tau, de ahí la necesidad de disponer de modelos para la enfermedad de alzheimer que presenten patología tau y βA de manera simultánea. La proteína precursora de beta-amiloide (APP) es una proteína transmembrana ampliamente conocida por su papel en la enfermedad de Alzheimer. En los cerebros de pacientes con EA las placas amiloides conteniendo agregados de beta-amiloide aparecen en regiones cerebrales específicas, desencadenando una respuesta inflamatoria, muerte neuronal y deteriodo cognitivo progresivo. Uno de los mecanismos por los cuales el péptido beta-amiloide se genera a partir de APP es la ruptura de APP en una posición extracelular (sitio beta) seguido por una ruptura inusual dentro del segmento transmembrana de APP (sitio gamma), generando un fragmento de APP que contiene 39-43 aminoácidos. Varias mutaciones en la proteína APP han sido correlacionadas con la EA debido al incremento o alteración en la transformación de APP en beta-amiloide, en particular la transformación de APP a cantidades grandes de la forma larga de beta-amiloide (es decir beta-amiloide 40 y beta-amiloide 42). El péptido β-amiloide ha sido implicado ademas en defectos neuropatológicos en individuos con el síndrome de Down. Por ejemplo, prácticamente todos los individuos con síndrome de Down, que poseen una copia extra del cromosoma 21 muestran alteraciones neuropatológicas similares a las observadas en la enfermedad de alzheimer si sobreviven más allá de los 40 años y esto parece ser debido a una producción excesiva de β-amiloide, la cual está codificada por el gen de APP localizado en el cromosoma 21.

Durante los últimos años, los modelos animales para la enfermedad de Alzheimer han proporcionado oportunidades excelentes para profundizar en el conocimiento de la etiopatología y de las terapias para la enfermedad. Las principales características de la enfermedad de Alzheimer han sido reproducidas en diferentes modelos murinos obtenidos a partir de ratones transgénicos, obtenidos por ingeniería genética incorporando alguno de los transgenes que en humanos están presentes en los pocos casos (sólo un 10%) de Alzheimer de tipo familiar, principalmente modelos que sobreexpresan el gen APP que da lugar a la proteína precursora del βA. Sin embargo, ninguno de estos modelos había logrado aunar las principales características neuropatológicas, conductuales y neuroquímicas de la enfermedad de Alzheimer hasta que en el año 2003 el Profesor LaFerla desarrolló los ratones triple transgénicos 3xTgAD. Se ha demostrado que los ratones 3xTgAD, con transgenes humanos PS1_M146V, APP_Swe y tau_P301L, presentan los caracteres más sobresalientes de la EA y desarrollan, progresivamente, placas de βA y marañas neurofibrilares de Tau en un patrón temporal y neuroanatómico paralelo al de humanos. Además, presentan disfunción sináptica, deficiencias colinérgicas y conductuales, de forma dependiente a la edad pero iniciándose antes de la patología de placas y marañas, y los déficits en plasticidad sináptica a largo plazo correlacionan con la acumulación de βA a nivel intracelular. En base a todo ello, los ratones 3xTg-AD proporcionan un modelo animal único para estudiar la neurobiología de la enfermedad y evaluar estrategias preventivas y terapéuticas potenciales sobre ambos tipos de lesión (patología tau y beta-amiloide) y otras deficiencias celulares y moleculares presentes en la enfermedad de Alzheimer.

Uno de los mayores desafíos en las aproximaciones a la patogénesis de la EA es el desarrollo de modelos celulares adecuados en los que se reproduzcan determinados aspectos celulares, moleculares y bioquímicos de la EA en humanos. A pesar de la proliferación y utilidad de modelos transgénicos in vivo para la EA, en todos ellos las alteraciones neuropatológicas de la EA no aparecen antes de los 2 meses de edad del animal. Esto conlleva que no se pueden realizar estudios de las bases neurobiológicas de la enfermedad ni evaluar sustancias preventivas y/o terapéuticas para la EA hasta una cierta edad del animal. Además, las aproximaciones in vivo son extremadamente costosas tanto en términos de tiempo como económicos debido al coste del mantenimiento de los animales, la muerte prematura y el número de animales que se necesitan para cada uno de estos estudios, etc por lo que el potencial preventivo y/o terapéutico de distintos tipos de estrategias para la EA que pueden tener enorme valor terapéutico, no pueden ser evaluadas mediante estos métodos.

Descripción de la invención

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un modelo celular in vitro para evaluar la eficacia de compuestos y materiales para modificar, tratar o prevenir enfermedades relacionadas con patología tau, beta-amiloide o APP que comprende el empleo de cultivos primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de embriones de ratones 3xTgAD cultivados en condiciones despolarizantes.

Por "patologías relacionadas con patología tau, beta-amiloide o APP" se entiende cualquier enfermedad que curse con incremento en los agregados de proteína tau, y/o incremento de los niveles de beta-amiloide o proteína precursora de beta amiloide.

En una realización preferida de la invención los compuestos evaluados se seleccionan del grupo que consiste en péptidos, polipéptidos, proteínas, agentes biológicos o fármacos. En una realización más preferida de la presente invención la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer. En una realización aún más preferida de la presente invención la evaluación se lleva a cabo empleando métodos de HTS (high through-put screening). En aún otra realización de la invención los cultivo primarios de neuronas se obtienen a partir...

1. Método in vitro para evaluar la eficacia de compuestos y materiales para modificar, tratar o prevenir enfermedades relacionadas con patología tau, beta-amiloide o APP que comprende el empleo de cultivos primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de embriones de ratones 3XTgAD cultivados en condiciones despolarizantes.

2. Método in vitro de acuerdo con la primera reivindicación, donde los compuestos evaluados se seleccionan del grupo que consiste en péptidos, polipéptidos, proteínas, agentes biológicos, sustancias químicas o fármacos.

3. Método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer.

4. Método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el proceso de evaluación se lleva a cabo empleando métodos de HTS (high through-put screening).

5. Método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los cultivo primarios de neuronas se obtienen a partir de embriones de ratones 3XTgAD cuya edad está comprendida entre 15-17 días de gestación.

6. Composición que comprende cultivos primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de embriones de ratones 3XTgAD cultivados en condiciones despolarizantes.

7. Método de preparación de la composición de la reivindicación 6, que comprende los siguientes pasos: