ANÁLISIS DE MUESTRAS DE ALIENTO EN CUANTO A PENTILFURANO.

El uso del biomarcador pentilfurano en el bioanálisis de microorganismos en una biomuestra gaseosa procedente del aliento de un animal, incluido un ser humano

Campo de la invención

La invención se refiere a la determinación de un biomarcador único, pentilfurano, y a su uso para el ensayo en cuanto a la presencia de agentes patógenos fúngicos y bacterianos, incluido Aspergillus fumigatus, en un individuo o a partir de 5 un cultivo utilizando el análisis de muestras de aliento.

Antecedentes de la invención

Todos los microorganismos producen subproductos como resultado de su metabolismo normal. La capacidad de diferentes organismos de metabolizar diferentes sustratos con el fin de satisfacer sus requisitos energéticos y nutritivos es fundamental para la microbiología de laboratorio, y constituye la base de muchos ensayos de identificación rápida. 10 Los metabolitos producidos por una sola especie pueden variar ampliamente, dependiendo del sustrato de crecimiento, de las condiciones (temperatura, disponibilidad de oxígeno) y de la edad del cultivo propiamente dicho.

Entre los muchos metabolitos grandes primarios y secundarios producidos por microbios, se forman algunas sustancias orgánicas que se volatizan fácilmente a bajas temperaturas. Compuestos orgánicos volátiles microbianos (MVOCs - siglas en inglés) han sido estudiados ampliamente en agricultura y en la producción de alimentos, dado que algunos 15 MVOCs tienen importantes implicaciones en la salud y económicas en estos campos. Por ejemplo, algunos MVOCs han estado asociados con el deterioro en cosechas y productos alimenticios almacenados en donde pueden ser responsables de “malos olores” contaminantes, la decoloración de productos o la toxicidad. Crecientemente se están encontrando perfiles de MVOCs que son únicos para el nivel de especie o cepa.

La aspergilosis invasiva es una de las infecciones más problemáticas debido a dificultades de diagnóstico y de 20 tratamiento. Compuestos orgánicos volátiles (VOCs - siglas en inglés) tienen el potencial de mejorar la especificidad y sensibilidad de diagnóstico de esta y otras infecciones. Sería útil identificar un biomarcador único de una especie de Aspergillus, en particular Aspergillus fumigatus, en el gas del espacio de cabeza de cultivos in vitro y detectar el marcador a partir de muestras de aliento de pacientes infestados o colonizados.

Objeto de la invención 25

Es un objeto de la invención proporcionar un biomarcador para detectar agentes patógenos bacterianos y/o fúngicos tales como Aspergillus fumigatus en una biomuestra, o al menos proporcionar a la población una elección útil.

Sumario de la invención

La invención proporciona el biomarcador, pentilfurano, para uso en bioanálisis de microorganismos tales como agentes patógenos fúngicos y bacterianos en una muestra gaseosa procedente del aliento de un animal, incluido un ser 30 humano. En particular, la invención proporciona el uso del biomarcador pentilfurano para detectar especies de hongos, más particularmente especies de Aspergillus, en una biomuestra gaseosa procedente del aliento de un animal, incluido un ser humano.

Más particularmente, la invención proporciona el uso del biomarcador, pentilfurano, para detectar Aspergillus fumigatus en una biomuestra gaseosa procedente del aliento de un animal, incluido un ser humano. 35

La biomuestra puede ser, lo más preferiblemente, una muestra de aliento de un paciente.

En particular, la invención proporciona el uso del biomarcador pentilfurano en el bioanálisis de microorganismos en una biomuestra gaseosa procedente del aliento de un animal, incluido un ser humano.

También se pueden detectar otros microorganismos tales como Aspergillus flavus, Haemophilus influenza y Pseudomonas aeruginosa. La biomuestra es una muestra del aliento. Preferiblemente, el biomarcador es 2-40 pentilfurano. Sin embargo, podría ser 3-pentilfurano.

La invención proporciona un método ex-vivo para detectar Aspergillus en un paciente, que comprende:

(a) analizar una biomuestra obtenida del aliento del paciente en cuanto a la presencia de pentilfurano; y

(b) determinar si en la muestra del aliento está presente Aspergillus.

La invención proporciona también el uso de un biomarcador, pentilfurano, en la detección de Aspergillus fumigatus 45 procedente de una muestra del aliento de un animal.

La especie de Aspergillus es preferiblemente Aspergillus fumigatus.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un escáner TC (tomografía computarizada) del tórax de un paciente con múltiples focos de opacidad de espacio de aire rodeados por material hiperdenso.

Descrjpción detallada de la invención

Se describirá ahora la invención a modo de ejemplo únicamente. 5

Se utilizó la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) con la microextracción en fase sólida (SPME - siglas en inglés) para identificar pentilfurano en calidad de un biomarcador específico de A. fumigatus a partir de cultivos. Se recogieron cuatro litros de muestras del aliento de pacientes con fibrosis quística (FQ), con o sin colonización de A. fumigatus y otros agentes patógenos, y voluntarios sanos. Las muestras del aliento se analizaron semi-cuantitativamente mediante SPME/GC-MS en cuanto a la presencia o ausencia de pentilfurano. Se sometió a 10 ensayo a un total de 21 individuos. Pentilfurano se detectó a partir de muestras del aliento de 4/4 pacientes con FQ y colonización por A. fumigatus, 3/7 pacientes con FQ y sin evidencia microbiológica de A. fumigatus y 0/10 individuos control sanos.

Materiales y métodos

Cepas y condiciones de cultivo 15

En estos experimentos se utilizaron aislados clínicos de Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Mucor racemosus, Fusarium solani y Cryptococcus neoformans.

Los organismos se hicieron crecer en agar sangre en viales de vidrio estéril de 100 ml cerrados con tapones de aluminio estancos al aire que incorporan un septum de caucho revestido con teflon.

Preparación de las cepas 20

Las cepas se hicieron crecer durante 72 horas en placas de agar sangre y luego, en el caso de cepas de levaduras, se retiró de la placa un asa de siembra estéril de cultivo y se transfirió a 5 mL de agua estéril. Para cepas de hongos filamentosos, las esporas se recolectaron de la placa con agua estéril que contenía Tween al 0,05%. Quinientos microlitros de esta suspensión se introdujeron en el vial de cultivo sellado mediante inyección a través del septum en el medio. 25

Los cultivos se mantuvieron a 37ºC durante 5 días. Los viales se barrieron con 100 ml de aire seco purificado una vez cada aproximadamente 12 horas.

Detección de pentilfurano mediante GC-MS. Calibración y estandarización

Se trazaron curvas de calibración del análisis del gas del espacio de cabeza de diluciones acuosas en serie de pentilfurano. La curva de calibración resultante demostró ser lineal en el intervalo de 1-50 pg. 30

Demografía de pacientes

Se identificaron cuatro pacientes con fibrosis quística y colonización por Aspergillus, 6 pacientes con FQ y sin colonización por Aspergillus y 10 individuos control que cumplían los criterios de inclusión para el estudio. En la Tabla 2 se muestran datos demográficos y clínicos relevantes.

Microextracción en fase sólida (SPME) - cromatografía de gases - espectrometría de masas (GC-MS) 35

Se llevó a cabo una revisión bibliográfica exhaustiva y se creó una base de datos de todos los MVOCs procedentes de especies de Aspergillus, que incluían el compuesto aislado, la especie y la cepa, el medio y las condiciones de cultivo y el método de análisis. Los gases del espacio de cabeza de las cepas cultivadas según se describe antes se sometieron a análisis por SPME/GC-MS.

Preparación de la muestra 40

La fibra acondicionada por SPME se expuso en viales de cultivo durante 10 minutos y luego se desorbió directamente en el orificio de inyección durante 5 minutos.

Parámetros de GC/MS

Las temperaturas del inyector, trampa de iones, colector y tubería de transferencia eran 250, 200, 60 y 250ºC, respectivamente. El programa de la estufa comenzó a 50ºC durante 2 minutos y se elevó a 250ºC a una velocidad de 45 10ºC/min, temperatura a la cual se mantuvo durante 2 minutos... [Seguir leyendo]

1. El uso del biomarcador pentilfurano en el bioanálisis de microorganismos en una biomuestra gaseosa procedente del aliento de un animal, incluido un ser humano.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los microorganismos son agentes patógenos fúngicos.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde los microorganismos proceden de especies de Aspergillus o en donde el microorganismo es una especie de Aspergillus. 5

4. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el microorganismo es Aspergillus fumigatus.

5. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el pentilfurano es 2-pentilfurano.

6. Un método ex vivo para detectar un agente patógeno bacteriano o fúngico, p. ej. Aspergillus, en un paciente, comprendiendo el método:

(a) analizar una biomuestra obtenida del aliento del paciente en cuanto a la presencia de pentilfurano; y 10

(b) así, determinar si el agente patógeno está presente en la biomuestra del aliento o en el paciente.

7. Un método ex vivo de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la especie de Aspergillus es Aspergillus fumigatus.

8. Uso del biomarcador pentilfurano en la detección de un agente patógeno fúngico o bacteriano tal como Aspergillus fumigatus, procedente de una muestra del aliento de un animal.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el animal es un ser humano. 15

10. El uso de pentilfurano para la detección ex vivo de la presencia de un microorganismo tal como un agente patógeno bacteriano o fúngico en un animal, incluido un ser humano, en donde el pentilfurano está presente en la biomuestra gaseosa procedente del aliento del animal.