ADSORBENTES QUE COMPRENDEN LIGANDOS DE COLORANTTES DE ANTRAQUINONA PARA LA SEPARACIÓN DE MATERIALES BIOLÓGICOS.

Un proceso para la separación de materiales biológicos, donde se usa un adsorbente,

el cual comprende un producto de reacción y un compuesto de la fórmula **Fórmula** y un sustrato que tiene un grupo capaz de reaccionar con un grupo reactivo en dicho compuesto de fórmula (1) para formar un enlace covalente, en el cual B es un radical C2-C12alquileno, que puede estar interrumpido por 10 1, 2 o 3 miembros del grupo consistente en -NR1- o -O- y es no sustituido o sustituido por hidroxilo, sulfo, sulfato, ciano o carboxilo, R1 es hidrógeno o C1-C4alquilo, o B es un radical C5-C9cicloalquileno, radical C1C4alquilen- C5-C9cicloalquileno o C1-C4alquilen-C5 C9cicloalquilen-C1-C4alquileno radical, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, sulfo, halógeno o carboxilo, o un radical fenileno, radical C1-C4alquilen-fenileno o radical C1-C4alquilen-fenilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o 15 sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, C2-C4alcanoilamino, sulfo, halógeno o carboxilo, V es un sustituyente reactivo a materiales no fibrosos o es un sustituyente reactivo a la fibra de fórmula **Fórmula** donde R2 es hidrógeno o C1-C4 alquilo no sustituido o sustituido o un radical **Fórmula** R3 es hidrógeno, hidroxi, sulfo, sulfato, carboxi, ciano, halógeno, C1-C4alcoxicarbonilo, C1-C4-alcanoiloxi, carbamoilo o un grupo -SO2-Y, R4 es hidrógeno o C1-C4alquilo, alk y alk1 son independientemente uno del otro C1-C6 alquileno lineal o ramificado, arileno es un radical fenileno o naftileno el cual es no sustituido o sustituido por sulfo, carboxi, hidroxi, C120 C4alquilo, C1-C4alcoxi o por halógeno, Y es vinilo o un radical -CH2-CH2-U y U es un grupo saliente, Y1 es un grupo -CH(Hal)-CH2(Hal) o -C(Hal)=CH2 donde Hal es cloro o bromo, W es un grupo -SO2-NR4-, -CONR4- o -NR4CO- donde R4 es como se definió más arriba, Q es un radical -O- o -NR4- donde R4 es como se definió más arriba, y 25 n es un número 0 o 1, X es halógeno, y k y m son independientemente uno del otro un número 0 o 1 y la suma de k+m is 1 o 2, con la excepción de un adsorbente, que comprende un compuesto de fórmula **Fórmula** y Donde Q es sulfo o carboxi.

La presente invención se relaciona con un proceso para la separación o purificación de materiales biológicos utilizando adsorbentes, que comprenden ligandos de colorantes de antraquinona, un proceso para la preparación de los adsorbentes y los adsorbentes.

Los colorantes reactivos son productos bien establecidos ampliamente utilizados en la industria de los textiles para la coloración de textiles celulósicos tale como algodón o viscosa. La molécula de un tal colorante reactivo puede verse como constituida de dos unidades entrelazadas cada una de las cuales tiene una función distinta. Una unidad es el cromóforo cuya función es impartir el color deseado y otras propiedades tintúrales al textil. La otra unidad es el grupo reactivo a la fibra, al cual, bajo condiciones de aplicación bien establecidas, reacciona químicamente con la celulosa para enlazar de forma covalente las moléculas de colorante al textil con el fin de producir un material teñido que es altamente resistente al proceso de lavado.

Mientras que los colorantes reactivos se desarrollaron inicialmente para resolver ciertos problemas encontrados en la tintura e impresión de materiales textiles celulósicos, a lo largo de los años han demostrado poseer propiedades que los hacen útiles por fuera del campo de la coloración textil.

Es bien conocido, por ejemplo, a partir de las patentes de los Estados Unidos Nºs 4,016,149 y 4,546,161, que estos colorantes pueden unirse por técnicas similares a sustratos de carbohidratos, tales como polímeros y copolímeros derivados de agarosa, dextrosa, dextranos, etc. Los productos de reacción de tales sustratos de carbohidratos y ciertos colorantes reactivos disponibles comercialmente se han utilizado en cromatografía de afinidad como adsorbentes para la separación o purificación cromatográfica de ciertos materiales proteináceos. Entre los colorantes textiles comerciales, que han sido utilizados como ligandos para separación de proteínas o enzimas, hay ciertos colorantes de antraquinona azules que comprenden una unidad estructural monoclorotriazina, tal como C.I. Azul Reactivo 2 (Cibacron Blue 3GA),

C.I. Azul Reactivo 5 y C.I. Azul Reactivo 49.

La US 6,638,740 divulga un proceso para la purificación de la proteína albúmina de suero humano por cromatografía de afinidad utilizando una resina que comprende un colorante inmovilizado del tipo Azul Reactivo, por ejemplo Azul Reactivo 2. Se proporciona albúmina altamente purificada. Sin embargo, ese documento se relaciona solamente con la purificación de dicha proteína individual.

La cromatografía de afinidad se basa en las afinidades diferenciales de las proteínas o enzimas por los ligandos de la fase estacionaria del adsorbente y crecientemente ha demostrado ser crucial en áreas de aplicación de alto nivel tales como productos biofarmacéuticos y de diagnóstico tal como se describe, por ejemplo, en WO 2004052870. La naturaleza de la interacción puede ser puentes de hidrógeno, fuerzas electroestáticas, apilamiento como resultado de geometría favorable o cualquier otro aspecto que promueva la relación ligando-objetivo. La interacción ligando-objetivo debería ser suficientemente fuerte para permitir el retiro de otras moléculas contaminantes de una muestra a la vez que mantiene el complejo ligando-objetivo intacto, esto es, las proteínas que tengan afinidad a los ligandos se enlazan a la matriz mientras que otras sin afinidad son lavadas. Las proteínas enlazadas pueden ser eludidas selectivamente bajo condiciones de pH, fuerza iónica y reguladores variables, tal como se describe, por ejemplo en P.D.G. Dean, W.S. Johnson y F.A. Middle (Ed), Affinity Chromatography: A Practical Approach, 1982. La mezcla de proteínas puede ser sometida a separación por agitación o pasando a través de una columna con el adsorbente.

La cromatografía de afinidad ha demostrado ser ventajosa en el fraccionamiento de sangre para captura fina y rápida de proteínas de las fracciones del plasma. La cromatografía de afinidad se aplica a las fracciones del plasma prepurificado por fraccionamiento clásico con etanol y/o por cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía de afinidad está siendo utilizada en la producción industrial de diversos productos del plasma, tales como concentrados del factor VIII, factor IX, factor de von Willebrand, proteína C y Antitrombina III tal como se encuentra, por ejemplo, en T.Burnouf y M.Radosevich, J. Biochem. Biophys. Metods, 2001, 49, 575.

El Azul Cibacron 3GA ha sido bien estudiado en cuanto a sus interacciones con diversas proteínas y enzimas. Se ha observado que el colorante imita a la unidad estructural NAD+ y por lo tanto interactúa con las proteínas y enzimas que reconocen este sitio tal como lo describe, por ejemplo, S.Subramanian, CRC Critical Rev. Biochem., 1984, 16, 169. Se ha purificado albúmina exitosamente utilizando Azul de Cibracron 3GA inmovilizado a gran escala como se sabe, por ejemplo, a partir de M. Allary, J. Saint-Blancard, E. Boschetti y P. Girot, Bioseparation, 1991, 2, 167. El fraccionamiento de 27 proteínas de plasma se ha llevado a cabo con la ayuda de la cromatografía de afinidad utilizando Azul Cibacron 3GA inmovilizado sobre perlas de agarosa entrecruzada con un gradiente de pH como se describe, por ejemplo, en E.Gianazza y P.Arnaud, Biochem. J., 1982, 201, 129. La purificación de proteasa de serinas sobre Sefarosa Azul (Azul Cibacron 3GA inmovilizado sobre agarosa) también ha sido reportada. Se conoce, por ejemplo, de C. Koch, L. Borg, K. Skjodt y G. Hoven, J. Chromatogr. B., 1998, 718, 41 que la interacción de las proteasas de serina con Sefarosa Azul involucra el sitio activo de la enzima.

Los avances en biotecnología como la tecnología de fagos y el diseño ayudado por ordenador de ligandos artificiales ha llevado a desarrollos adicionales en la aplicación de cromatografía de afinidad para la purificación de proteínas tal como se describe, por ejemplo, en C.R. Lowe, A.R. Lowe y G. Gupta, J. Biochem. Biophys. Metods, 2001, 49, 561. Diversos ligandos sintéticos hechos a la medida, además de los bioligandos utilizados tradicionalmente tales como heparina,

5 gelatina, proteína A y proteína C, han provisto una productividad mejorada de las proteínas del plasma.

La aplicación de técnicas de ligandos artificiales para la purificación industrial de proteínas no ha sido impulsada hasta un nivel mayor y ha estado limitada primariamente al uso de Azul Cibacron 3GA. Puesto que el principio de la cromatografía de afinidad se basa en el fenómeno del reconocimiento molecular, las variaciones estructurales del ligando juegan un papel vital bien sea en la estabilización o desestabilización de las interacciones proteína-colorante. Véase, por ejemplo, N. Lindner, R. Jeffcoat, C. Lowe, J. Chromatogr. 1989, 473, 227 y Y.D. Clonis, N.E. Labrou, V. Kotsira, C. Mazitsos, S. Melissis, G. Gogolas, J. Chromatogr. A, 2000, 891, 33. Las interacciones secundarias con un complejo ternario podían también haber producido un efecto profundo al exhibir afinidad hacia una proteína específica tal como se describe, por ejemplo, en N.E. Labrou, E. Eliopoulos, Y.D. Clonis, Biochem J., 1996,315,695.

De acuerdo con lo anterior, hay una necesidad de proveer adsorbentes colorante-ligando sintetizables fácilmente para abordad diversos problemas de separación o purificación y para incrementar el alcance de los métodos confiables para la purificación de proteínas.

La presente invención se relaciona con un proceso para la separación de materiales biológicos, donde se usa un adsorbente, que comprende un producto de reacción de un compuesto de formula

Y un sustrato que tiene un grupo capaz de reaccionar con un grupo reactivo en dicho compuesto de la formula (1) para formar un enlace covalente en el cual B es Radical C2-C12alquileno, que puede estar interrumpido por 1, 2 o 3 miembros del grupo consistente en -NR1-o –O y es no sustituido o sustituido por hidroxilo, sulfo, sulfato, ciano o carboxilo, R1 es hidrógeno o C1-C4alquilo, o B es un radical C5-C9cicloalquileno, Radical C1-C4alquilen-C5C9cicloalquileno o Radical C1-C4alquilen-C5-C9cicloalquilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, sulfo, halógeno o carboxilo, o un radical fenileno, Radical C1-C4alquilenfenileno o Radical C1-C4alquilen-fenilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, C2-C4alcanoilamino, sulfo, halógeno o carboxilo, V es un sustituyente reactivo a materiales no fibrosos o es un sustituyente reactivo a las fibras... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para la separación de materiales biológicos, donde se usa un adsorbente, el cual comprende un producto de reacción y un compuesto de la fórmula

**(Ver fórmula)**

y un sustrato que tiene un grupo capaz de reaccionar con un grupo reactivo en dicho compuesto de fórmula (1)

para formar un enlace covalente, en el cual B es un radical C2-C12alquileno, que puede estar interrumpido por 10 1, 2 o 3 miembros del grupo consistente en -NR1- o -O- y es no sustituido o sustituido por hidroxilo, sulfo,

sulfato, ciano o carboxilo, R1 es hidrógeno o C1-C4alquilo, o B es un radical C5-C9cicloalquileno, radical C1

C4alquilen-C5-C9cicloalquileno o C1-C4alquilen-C5 C9cicloalquilen-C1-C4alquileno radical, los cuales están no

sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, sulfo, halógeno o carboxilo, o un radical fenileno, radical

C1-C4alquilen-fenileno o radical C1-C4alquilen-fenilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o15 sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, C2-C4alcanoilamino, sulfo, halógeno o carboxilo, V es un sustituyente

reactivo a materiales no fibrosos o es un sustituyente reactivo a la fibra de fórmula

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

10 

15 R3 es hidrógeno, hidroxi, sulfo, sulfato, carboxi, ciano, halógeno, C1-C4alcoxicarbonilo, C1-C4-alcanoiloxi, carbamoilo o un grupo -SO2-Y, R4 es hidrógeno o C1-C4alquilo, alk y alk1 son independientemente uno del otro C1-C6 alquileno lineal o ramificado, arileno es un radical fenileno o naftileno el cual es no sustituido o sustituido por sulfo, carboxi, hidroxi, C120 C4alquilo, C1-C4alcoxi o por halógeno, Y es vinilo o un radical -CH2-CH2-U y U es un grupo saliente, Y1 es un grupo -CH(Hal)-CH2(Hal) o -C(Hal)=CH2 donde Hal es cloro o bromo, W es un grupo -SO2-NR4-, -CONR4- o -NR4CO- donde R4 es como se definió más arriba, Q es un radical -O- o -NR4- donde R4 es como se definió más arriba, y 25 n es un número 0 o 1,

X es halógeno, y k y m son independientemente uno del otro un número 0 o 1 y la suma de k+m is 1 o 2, con la excepción de un adsorbente, que comprende un compuesto de fórmula y

**(Ver fórmula)**

Donde Q es sulfo o carboxi.

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el compuesto de fórmula (1) corresponde a un 10 compuesto de fórmula

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

donde B es un radical C2-C6alquileno, un radical metilen-ciclohexileno, el cual es no sustituido o sustituido por C1-C4alquilo, o a fenileno o metilen-fenilen-metileno radical, el cual es no sustituido o sustituido por C1

25 C4alquilo, C1-C4alcoxi, halógeno o sulfo,

V es amino, N-mono- o N,N-di-C1-C4alquilamino el cual es no sustituido o sustituido en la unidad estructural alquilo por hidroxi, sulfato o por sulfo Y es no interrumpido o interrumpido por un radical -O-, morfolino, fenilamino o N-C1-C4alquil-Nfenilamino el cual es no sustituido o sustituido en el anillo fenilo por sulfo, carboxi, cloro, acetilamino, metilo o por metoxi, o naftilamino el cual es no sustituido o sustituido por de 1 a 3 grupos 30 sulfo, o

V es un grupo de fórmula

**(Ver fórmula)**

o

**(Ver fórmula)**

3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2, donde B es un radical

**(Ver fórmula)**

5  V corresponde a β-hidroxietilamino, 2-(β-hidroxietoxi)etilamino, N.N-di-β-hidroxietilamino, β-sulfoetilamino, morfolino, 2-, 3- o 4-sulfofenilamino, 1-sulfonaft-2-il-amino o 3,7-disulfonaft-2-il-amino, o V es un grupo de fórmula (2c') o (2d') como se define en la reivindicación 2.

4. Un proceso de acuerdo con una cualquier de las Reivindicaciones 1 a 3 donde

el sustrato es un carbohidrato o un carbohidrato modificado, preferiblemente agarosa, agarosa entrecruzada, 10 dextrosa, dextranos o versiones modificadas de los mismos.

5. Adsorbentes para la separación de materiales biológicos, los cuales comprenden un producto de reacción de

**(Ver fórmula)**

B es Radical C2-C12alquileno, que puede estar interrumpido por 1, 2 o 3 miembros del grupo consistente en NR1- o

- O- y es no sustituido o sustituido por hidroxilo, sulfo, sulfato, ciano o carboxilo,

20 R1 es hidrógeno o C1-C4alquilo, or

B es un radical C5-C9cicloalquileno, radical C1-C4alquilen-C5-C9cicloalquileno o radical C1-C4alquilen-C5C9cicloalquilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, sulfo, halógeno o carboxilo, o un radical fenileno, radical C1-C4alquilen-fenileno o radical C1-C4alquilenfenilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, C2

25 C4alcanoilamino, sulfo, halógeno o carboxilo,

V es un sustituyente reactivo a materiales no fibrosos o es un sustituyente reactivo a la fibra de fórmula

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

carbamoilo o un grupo -SO2-Y,15 R4 es hidrógeno o C1-C4alquilo, alk y alk1 son independientemente uno del otro C1-C6 alquileno lineal o

ramificado, arileno es un radical fenileno o naftileno el cual es no sustituido o sustituido por sulfo, carboxi, hidroxi, C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi o por halógeno, Y es vinilo o un radical -CH2-CH2-U y U es un grupo saliente, Y1 es un grupo -CH(Hal)-CH2(Hal) o -C(Hal)=CH2 donde Hal es cloro o bromo, W es un grupo -SO2-NR4-, -CONR4- o -NR4CO- donde R4 es como se definió más arriba, Q es un radical -O- o -NR4- donde R4 es como se definió más arriba, y n es un número 0 o 1, X es halógeno, y k y m son independientemente uno del otro un número 0 o 1 y la suma de k+m is 1 o 2, con la excepción de un adsorbente, que comprende un compuesto de fórmula

30 

35 

**(Ver fórmula)**

y

5 

10 

**(Ver fórmula)**

donde Q es sulfo o carboxi.

6. Un proceso para la preparación de los adsorbentes de acuerdo con la reivindicación 5, proceso que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula

**(Ver fórmula)**

en el cual B es Radical C2-C12alquileno, que puede estar interrumpido por 1, 2 o 3 miembros del grupo consistente en NR1- o -O- y es no sustituido o sustituido por hidroxilo, sulfo, sulfato, ciano o carboxilo,

R1 es hidrógeno o C1-C4alquilo, o

B es un radical C5-C9cicloalquileno, radical C1-C4alquilen-C5-C9cicloalquileno o radical C1-C4alquilen-C5C9cicloalquilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, sulfo, halógeno o carboxilo, o un radical fenileno, radical C1-C4alquilen-fenileno o radical C1-C4alquilen-fenilen-C1C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, C2-C4alcanoilamino, sulfo, halógeno o carboxilo,

V es un sustituyente reactivo a materiales no fibrosos o es un sustituyente reactivo a la fibra de fórmula donde

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

10 

R3 es hidrógeno, hidroxi, sulfo, sulfato, carboxi, ciano, halógeno, C1-C4alcoxicarbonilo, C1-C4-alcanoiloxi, carbamoilo o un grupo -SO2-Y, R4 es hidrógeno o C1-C4alquilo, alk y alk1 son independientemente uno del otro C1-C6 alquileno lineal o ramificado, 15 arileno es un radical fenileno o naftileno el cual es no sustituido o sustituido por sulfo, carboxi, hidroxi, C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi o por halógeno, Y es vinilo o un radical -CH2CH2-U y U es un grupo saliente, Y1 es un grupo -CH(Hal)-CH2(Hal) o -C(Hal)=CH2 donde Hal es cloro o bromo, W es un grupo -SO2-NR4-, -CONR4- o -NR4CO- donde R4 es como se definió más arriba, 20 Q es un radical -O- o -NR4- donde R4 es como se definió más arriba, y n es un número 0 o 1, X es halógeno, and

k y m son independientemente uno del otro un número 0 o 1 y la suma de k+m is 1 o 2, con la excepción de un compuesto de fórmula

**(Ver fórmula)**

y donde V1 is β-hidroxietilamino, 2-(β-hidroxietoxi)etilamino o morfolino, V2 y V3 cada uno independientemente del otro son β-hidroxietilamino, 2-(β-hidroxietoxi)etilamino, N,N-di-β-hidroxietilamino o morfolino, y Q es el número 0, 1, 2 o 3.