Un adenovirus quimérico recombinante que tiene un genoma que comprende una región E2B,

en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico; en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, C, D, E, o F y son distintos entre sí; y en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico mejorado para una célula tumoral

Esta Solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional U.S. Serie nº 60/574.851, presentada el 26 de mayo de 2004, que se incorpora aquí como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La invención descrita aquí se refiere generalmente al campo de la biología molecular, y más específicamente a adenovirus oncolíticos que tienen aplicaciones terapéuticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer es la causa principal de muerte en los Estados Unidos de América y en cualquier otra parte del mundo. Dependiendo del tipo de cáncer, típicamente se trata con cirugía, quimioterapia, y/o radiación. Estos tratamiento fracasan a 10 menudo, y está claro que son necesarias nuevas terapias, para ser usadas solas o en combinación con técnicas clásicas.

Un enfoque ha sido el uso de adenovirus, ya sea solos o como vectores capaces de suministrar proteínas terapéuticas contra el cáncer a células tumorales. Los adenovirus son virus de ADN bicatenario icosaédricos sin cubierta, con un genoma lineal de aproximadamente 36 mil pares de bases. Cada extremo del genoma vírico tiene una secuencia corta 15 conocida como la repetición terminal invertida (o ITR), que es necesaria para la replicación vírica. Todos los genomas de adenovirus humanos examinados hasta la fecha tienen misma organización general; esto es, los genes que codifican funciones específicas están situados en la misma posición en el genoma vírico. El genoma vírico contiene cinco unidades de transcripción tempranas (E1A, E1B, E2, E3, y E4), dos unidades tempranas retrasadas (IX e Iva2), y una unidad tardía (tardía principal) que se procesa para generar cinco familias de ARNm tardíos (L1-L5). Las proteínas codificadas 20 por los genes tempranos están implicadas en la replicación, mientras que los genes tardíos codifican proteínas estructurales víricas. Las porciones del genoma vírico se pueden sustituir fácilmente por ADN de origen extraño, y los adenovirus recombinantes son estructuralmente estables, propiedades que hacen a estos virus potencialmente útiles para la terapia génica (véase Jolly, D. (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64).

Actualmente, los esfuerzos de investigación para producir terapia adenovírica clínicamente útil se han centrado en el 25 serotipo adenovírico Ad5. Las genéticas de este adenovirus humano están bien caracterizadas, y los sistemas están bien descritos para su manipulación molecular. Se han desarrollado métodos de producción de alta capacidad para apoyar aplicaciones clínicas, y existe cierta experiencia clínica con el agente. Véase, Jolly, D. (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64. La investigación referida al uso de adenovirus (Ad) humanos en el tratamiento del cáncer se ha centrado en el desarrollo de adenovirus a base de Ad5 que tienen una mayor potencia en, o que se dirigen preferentemente a, 30 tipos de células tumorales específicos, y existe la necesidad de la generación de virus oncolíticos más potentes si la terapia adenovírica va a encontrar aplicación práctica en un marco clínico.

Ad5 es solo uno de los 51 serotipos adenovíricos actualmente conocidos, que se clasifican en subgrupos A-F, basándose en diversos atributos, incluyendo sus propiedades de hemoaglutinamiento ((véase, Shenk, “Adenoviridae: The Viruses y Their Replication,” en Fields Virology, Vol. 2, Cuarta Edición, Knipe, ea., Lippincott, Williams & Wilkins, p. 2265-35 2267 (2001)). Estos serotipos difieren en una variedad de niveles, por ejemplo patología en receptores celulares de seres humanos y roedores usados para la unión, pero estas diferencias se han ignorado principalmente como medios potenciales para desarrollar adenovirus oncolíticos más potentes (con la excepción de alteraciones de fibra; véanse Stevenson et al. (1997) J. Virol. 71:4782-4790; Krasnykh et al. (1996) J. Virol. 70: 6839-6846; Wickham et al. (1997) J.Virol. 71:8221-8229; Legrand et al. (2002) Curr. Gene Ther. 2:323-329; Barnett et al. (2002) Biochim. Biophys. Acta 1-40 3:1-14; Solicitud de Patente US 2003/0017138).

La explotación de diferencias entre serotipos adenovíricos puede proporcionar una fuente de tratamientos a base de adenovirus, usando nuevos adenovirus con una mayor selectividad y potencia. Existe la necesidad de tales terapias a base de adenovirus mejoradas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN 45

La presente invención proporciona nuevos adenovirus quiméricos útiles para la terapia a base de virus. En particular, la invención proporciona adenovirus quiméricos que tienen un genoma que comprende una región E2B, en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico;

en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, 50 C, D, E, o F y son distintos entre sí; y

en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico mejorado para una célula tumoral.

En una realización, el adenovirus quimérico comprende además regiones que codifican proteínas fibra, hexón, y pentón, en el que los ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas son todos del mismo serotipo adenovírico. En otra realización, el adenovirus quimérico de la invención comprende una región E3 o E4 modificada.

En otra realización, el adenovirus quimérico demuestra un índice terapéutico mejorado en una célula tumoral de colon, mama, páncreas, pulmón, próstata, ovario o hematopoyética. En una realización particularmente preferida, el adenovirus quimérico presenta un índice terapéutico mejorado en células tumorales de colon.

En una realización preferida, la región E2B del adenovirus quimérico comprende SEC ID NO: 3. En una realización 5 particularmente preferida, el adenovirus quimérico comprende SEC ID NO: 1.

La presente invención proporciona un adenovirus quimérico recombinante, o una variante o derivado del mismo, que tiene un genoma que comprende una región E2B

en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y una segunda secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico; 10

en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, C, D, E, o F y son distintos entre sí;

en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico aumentado para una célula tumoral; y

en el que dicho adenovirus quimérico se ha hecho deficiente para la replicación a través de la supresión de una o más 15 regiones adenovíricas que codifican proteínas implicadas en la replicación adenovírica seleccionadas del grupo que consiste en E1, E2, E3 o E4.

En una realización, el adenovirus quimérico de la invención comprende además un gen heterólogo que codifica una proteína terapéutica, en el que dicho gen heterólogo se expresa dentro de una célula infectada con dicho adenovirus. En una realización preferida, la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en citocinas y quimiocinas, anticuerpos, enzimas conversoras de profármacos, y proteínas inmunorreguladoras.

La presente invención proporciona usos para los adenovirus quiméricos de la invención para fines terapéuticos. En una realización, los adenovirus quiméricos se pueden usar para inhibir el crecimiento de células cancerígenas. En una realización particular, un adenovirus quimérico que comprende SEC ID NO: 1 es útil para inhibir el crecimiento de células de cáncer de colon. 25

En otra realización, los adenovirus de la invención son útiles como vectores para suministrar proteínas terapéuticas a células.

La presente invención proporciona un método para la producción de los adenovirus quiméricos de la invención, en el que el método comprende

a) reunir los serotipos adenovíricos que representan los subgrupos adenovíricos B-F, creando de ese modo una mezcla 30 adenovírica;

b) hacer pasar la mezcla adenovírica reunida procedente de la etapa (a) sobre un cultivo activamente creciente de células tumorales a una relación de partículas por célula suficientemente elevada para alentar la recombinación entre los serotipos, pero no tan alta como para producir la muerte celular prematura;

1. Un adenovirus quimérico recombinante que tiene un genoma que comprende una región E2B,

en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico;

en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, 5 C, D, E, o F y son distintos entre sí; y

en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico mejorado para una célula tumoral.

2. El adenovirus de la reivindicación 1, que comprende además regiones que codifican proteínas fibra, hexón, y pentón, en el que el ácido nucleico que codifica las proteínas fibra, hexón, y pentón de dicho adenovirus proceden del mismo serotipo adenovírico. 10

3. El adenovirus de la reivindicación 1 ó 2, que comprende además una región E3 modificada, o que comprende además una región E4 modificada.

4. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha célula tumoral es una célula tumoral de colon, de mama, de páncreas, de pulmón, de próstata, ovárica, o hematopoyética.

5. El adenovirus de la reivindicación 4, en el que dicha célula tumoral es una célula tumoral de colon. 15

6. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la secuencia nucleotídica de región E2B de dicho adenovirus comprende SEC ID NO: 3.

7. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la secuencia nucleotídica de dicho adenovirus comprende SEC ID NO: 1.

8. Un adenovirus quimérico recombinante que tiene un genoma que comprende una región E2B 20

en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y una segunda secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico, y

en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, C, D, E, o F y son distintos entre sí;

en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico aumentado para una célula tumoral, y

en el que dicho adenovirus quimérico se ha hecho deficiente para la replicación a través de la supresión de una o más regiones adenovíricas que codifican proteínas implicadas en la replicación adenovírica seleccionadas del grupo que consiste en E1, E2, E3 o E4.

9. El adenovirus de replicación deficiente de la reivindicación 8, en el que se han suprimido las regiones E1 y E3. 30

10. El adenovirus de replicación deficiente de la reivindicación 9, que comprende además una supresión de la región E4.

11. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un gen heterólogo, en el que dicho gen heterólogo es expresado en una célula infectada con dicho adenovirus.

12. El adenovirus de la reivindicación 11, en el que dicho gen heterólogo es timidina cinasa.

13. El adenovirus de la reivindicación 11, en el que dicho gen heterólogo codifica una proteína terapéutica seleccionada 35 del grupo que consiste en citocinas y quimiocinas, anticuerpo, enzimas conversoras de profármacos, y proteínas inmunorreguladoras.

14. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para uso en terapia.

15. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para uso en el tratamiento de enfermedad neoplásica o cáncer, o para inhibir el crecimiento de una célula cancerígena. 40

16. Un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerígena, que comprende infectar a dicha célula cancerígena in vitro con el adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

17. El adenovirus de la reivindicación 15 o el método de la reivindicación 16, en el que dicha célula cancerígena es una célula cancerígena de colon.

18. El adenovirus o el método de la reivindicación 17, en el que la secuencia nucleotídica de dicho adenovirus comprende SEC ID NO: 1.

19. El adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para uso para suministrar una proteína terapéutica a una célula.

20. Un método para aislar el adenovirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho método comprende 5

a) reunir los serotipos adenovíricos que representan los subgrupos adenovíricos B-F, creando de ese modo una mezcla adenovírica;

b) hacer pasar la mezcla adenovírica reunida procedente de la etapa (a) sobre un cultivo activamente creciente de células tumorales a una relación de partículas por célula suficientemente elevada para alentar la recombinación entre los serotipos, pero no tan alta como para producir la muerte celular prematura; 10

c) cosechar el sobrenadante de la etapa (b);

d) infectar un cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en la etapa (c);

e) cosechar el sobrenadante del cultivo celular de la etapa (d) antes de cualquier signo de CPE;

f) infectar un cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en la etapa (e); y

g) aislar el virus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 del sobrenadante cosechado en la etapa (f) mediante purificación en placas.

21. El método de la reivindicación 20, en el que la etapa (b) se lleva a cabo dos veces antes de cosechar el sobrenadante en la etapa (c).

22. El método de la reivindicación 20, en el que las etapas (e) y (f) se repiten hasta 20 veces antes de la etapa (g).

23. El método de la reivindicación 20, en el que se lleva a cabo una segunda ronda de purificación en placas tras la 20 etapa (g).

24. El método de la reivindicación 20, en el que la célula tumoral es una célula tumoral de colon, de mama, de páncreas, de pulmón, de próstata, ovárica, o hematopoyética.

25. Un adenovirus quimérico recombinante que tiene un genoma que comprende una región E2B,

en el que dicha región E2B comprende una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un primer serotipo adenovírico y 25 una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un segundo serotipo adenovírico;

en el que dichos serotipos adenovíricos primero y segundo se seleccionan cada uno de los subgrupos adenovíricos B, C, D, E, o F y son distintos entre sí; y

en el que dicho adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un índice terapéutico mejorado para una célula tumoral;

producido por un método de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24. 30