PROTEINAS DE FUSION DE LA TRANSFERRINA MODIFICADA QUE COMPRENDEN DOMINOS AINO O CARBOXILO DE TRANSFERRINA DUPLICADOS.
Una proteína de fusión de la transferrina que comprende un resto de transferrina (Tf) y al menos una proteína o péptido terapéutico,
en la que dicho resto de transferrina se selecciona del grupo constituido por
(i) un resto de transferrina que comprende dos o más dominios N de transferrina;
(ii) un resto de transferrina que comprende un dominio N de transferrina y un dominio C de transferrina que ha sido modificado por sustitución de aminoácidos de las regiones del dominio C o aminoácidos para las regiones correspondientes o aminoácidos del dominio N según se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3, para presentar patrones de glicosilación y propiedades de unión del hierro de un dominio N de la transferrina nativa o de tipo natural según se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3;
(iii) un resto de transferrina que comprende dos o más dominios C de transferrina que están modificados para inhibir o prevenir la glicosilación y la unión al receptor de Tf; y
(iv) un resto de transferrina constituido por dos dominios N de transferrina;
en la que dicho resto de transferrina prolonga la estabilidad en el suero, la semivida en circulación in vivo y la biodisponibilidad de dicha proteína terapéutica
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2003/026742.
Solicitante: BIOREXIS PHARMACEUTICAL CORPORATION.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 235 EAST 42ND STREET,NEW YORK, NY 10017-5755.
Inventor/es: SADEGHI, HOMAYOUN, TURNER,ANDREW,J.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 7 de Julio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K47/48R2P
- C07K14/705S
Clasificación PCT:
- A61K39/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
- A61K47/48
- C07K14/79 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Transferrinas, p. ej. lactoferrinas, ovotransferrinas.
- C12N15/62 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
Clasificación antigua:
- A61K39/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
Fragmento de la descripción:
Proteínas de fusión de la transferrina modificada que comprenden dominios aino o carboxilo de transferrina duplicados.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas o péptidos terapéuticos con estabilidad en el suero, semivida en circulación in vivo y biodisponibilidad ampliadas, particularmente a proteínas o péptidos terapéuticos fusionados a, o insertados en, una molécula de transferrina modificada para reducir o inhibir la glicosilación, la unión del hierro y/o la unión al receptor de transferrina.
Antecedentes de la invención
Las proteínas o péptidos terapéuticos en su estado nativo o cuando se producen de forma recombinante son moléculas típicamente lábiles que presentan cortos períodos de estabilidad en suero o cortas semividas en circulación in vivo. Además, estas moléculas son a menudo extremadamente lábiles cuando se encuentran en una formulación, en particular cuando se formulan en disoluciones acuosas con fines de diagnóstico y fines terapéuticos.
Existen pocas soluciones prácticas para prolongar o potenciar la estabilidad in vivo o in vitro de las moléculas proteicas terapéuticas. El polietilenglicol (PEG) es una sustancia que se puede unir a una proteína, dando como resultado una actividad sostenida, de mayor duración, de la proteína. Si la actividad de la proteína se prolonga mediante la unión a PEG, se puede disminuir la frecuencia con la que se necesita administrar la proteína. La unión a PEG, sin embargo, a menudo disminuye o destruye la actividad terapéutica de la proteína. Aunque en algún caso la unión a PEG puede reducir la inmunogenicidad de la proteína, en otros casos puede aumentar la inmunogenicidad.
Las proteínas o péptidos terapéuticos se han estabilizado también mediante fusión a una proteína capaz de prolongar la semivida en circulación in vivo de la proteína terapéutica. Por ejemplo, las proteínas terapéuticas fusionadas a albúmina o a fragmentos de anticuerpos pueden presentar semivida en circulación extendida in vivo en comparación con la proteína terapéutica en el estado no fusionado. Véase Patentes de EEUU Nº 5.876.969 y 5.766.883.
Otra proteína sérica, la transferrina humana glicosilada (Tf), se ha usado también para realizar fusiones con proteínas terapéuticas para dirigir la administración hacia el interior de las células o para trasportar agentes a través de la barrera hematoencefálica. Estas proteínas de fusión que comprenden la Tf humana glicosilada se han usado para dirigir el factor de crecimiento nervioso (NGF) o el factor neurotrófico ciliar (CNTF) a través de la barrera hematoencefálica fusionando la Tf de longitud completa con el agente. Véase Patentes de EEUU Nº 5.672.683 y 5.977.307. En estas proteínas de fusión, la porción Tf de la molécula está glicosilada y se une a dos átomos de hierro, que son necesarios para la unión de la Tf a su receptor en una célula y, según los autores de estas patentes, para dirigir la administración del resto NGF o el CNTF a través de la barrera hematoencefálica. Se han producido también proteínas de fusión de la transferrina insertando una secuencia diana de la proteasa de VIH-1 en los bucles expuestos de la superficie de la transferrina glicosilada para investigar la capacidad para producir otra forma de la Tf de fusión para dirigir la administración al interior de una célula mediante el receptor de Tf (Ali y col. (1999) J. Biol. Chem. 274(34): 24066-24073).
La transferrina sérica (Tf) es una glicoproteína monomérica con un peso molecular de 80.000 dalton que se une al hierro en la circulación y lo trasporta a diversos tejidos a través del receptor de la transferrina (TfR) (Aisen y col. (1980) Ann. Rev. Biochem. 49: 357-393; MacGillivray y col. (1981) J. Biol. Chem. 258: 3543-3553, Patente de EEUU Nº 5.026.651). La Tf es una de las moléculas séricas más comunes, que comprende hasta aproximadamente un 5-10% de las proteínas séricas totales. Se produce transferrina deficiente en carbohidratos en grandes cantidades en la sangre de individuos alcohólicos y presenta una semivida más larga (aproximadamente 14-17 días) que la de la transferrina glicosilada) (aproximadamente 7-10 días) Véase van Eijk y col. (1983) Clin. Chim. Acta 132: 167-171, Stibler (1991) Clin. Chem. 37: 2029-2037 (1991), Arndt (2001) Clin. Chem. 47(1): 13-27 y Stibler y col. en "Carbohydrate-deficient consumption", Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann y col.), Pergamon, 1988, Vol. 71, páginas 353-357).
Se ha caracterizado bien la estructura de la Tf y el mecanismo de unión al receptor, la unión y liberación de hierro y se ha dilucidado la unión al ión carbonato (Patentes de EEUU Nº 5.026.651, 5.986.067 y MacGillivray y col. (1983) J. Biol. Chem. 258(6): 3543-3546).
Se han usado también la transferrina y los anticuerpos que se unen al receptor de la transferrina para administrar o trasportar agentes tóxicos a células tumorales como terapia para el cáncer (Baselga y Mendelsohn, 1994), y se ha usado la transferrina como un vector no viral de terapia génica para administrar ADN a las células (Frank y col, 1994; Wagner y col, 1992). La capacidad de liberar proteínas en el sistema nervioso central (SNC) se ha demostrado usando el receptor de la transferrina como punto de entrada con diversas proteínas y péptidos, incluidos CD4 (Walus y col, 1996), el factor neurotrófico derivado de cerebro (Pardridge y col, 1994), el factor neurotrófico derivado de la glia (Albeck y col), un análogo de péptido vasointestinal (Bickel y col, 1993), un péptido beta-amiloide (Saito y col, 1995) y un oligonucleótido antisentido (Pardridge y col, 1995).
Sin embargo, las proteínas de fusión de la transferrina no se han modificado o construido mediante ingeniería genética para prolongar la semivida en circulación in vivo de una proteína ni de un péptido terapéutico o para aumentar la biodisponibilidad reduciendo o inhibiendo la glicosilación del resto de Tf ni para reducir o evitar la unión al hierro y/o al receptor de Tf.
Resumen de la invención
Como se describe más detalladamente a continuación, la presente invención incluye las proteínas de fusión de la Tf modificada que comprenden al menos una proteína, un polipéptido o un péptido terapéutico, en los que la porción o el resto de Tf se construye por ingeniería genética para que comprenda al menos dos dominios N de la transferrina nativa o de tipo natural, al menos dos dominios C modificados que están modificados para inhibir o para evitar la glicosilación y la unión al receptor de Tf o un dominio N y un dominio C, en el que el dominio C se ha modificado por sustitución de aminoácidos de las regiones del domino C o aminoácidos para las regiones correspondientes o aminoácidos del dominio N como se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3, para presentar patrones de glicosilación y propiedades de unión de hierro de un dominio N de la transferrina nativa o de tipo natural como se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3. La invención también incluye formulaciones farmacéuticas y composiciones que comprenden las proteínas de fusión, los procedimientos para ampliar la estabilidad en el suero, la semivida en circulación in vivo y la biodisponibilidad de una proteína terapéutica por medio de la fusión a la transferrina modificada, las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de Tf modificada y similares. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una proteína de fusión de Tf modificada para uso en el tratamiento de una enfermedad o los síntomas de una enfermedad en un paciente.
Descripción detallada
Descripción general
Se ha descubierto que se puede estabilizar una proteína terapéutica (por ejemplo, un polipéptido, un anticuerpo, o un péptido, o sus fragmentos y variantes) para prolongar la semivida en circulación in vivo y/o para retener la actividad de la proteína terapéutica durante periodos de tiempo prolongados in vivo fusionando genéticamente o conjugando químicamente la proteína, el polipéptido o péptido terapéutico a una transferrina modificada que comprende al menos dos dominios N de la transferrina nativa o de tipo natural, al menos dos dominios C modificados y un domino N y un dominio C, según se describió anteriormente. Las proteínas de fusión de la transferrina modificada incluyen una proteína o un dominio de la transferrina unido covalentemente a una proteína o péptido terapéutico, en la que la porción de la transferrina se ha modificada para contener una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en...
Reivindicaciones:
1. Una proteína de fusión de la transferrina que comprende un resto de transferrina (Tf) y al menos una proteína o péptido terapéutico, en la que dicho resto de transferrina se selecciona del grupo constituido por
en la que dicho resto de transferrina prolonga la estabilidad en el suero, la semivida en circulación in vivo y la biodisponibilidad de dicha proteína terapéutica.
2. Una proteína de fusión de la transferrina según la reivindicación 1, en la que el resto de transferrina comprende dos o más dominios N de transferrina.
3. Una proteína de fusión de la transferrina según la reivindicación 1, en la que la transferrina está constituida por dos dominios N de transferrina.
4. Una proteína de fusión de la transferrina según la reivindicación 1, en la que el resto de transferrina comprende un dominio N de transferrina y un dominio C de transferrina que se ha modificado por sustitución de aminoácidos de las regiones del dominio C o aminoácidos para las regiones correspondientes o aminoácidos del dominio N según se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3, para presentar patrones de glicosilación y propiedades de unión de hierro de un dominio N de transferrina nativa o de tipo natural según se muestra en ID. SEC. Nº 2 ó 3.
5. Una proteína de fusión de la transferrina según la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina no está glicosilado.
6. Una proteína de fusión de la reivindicación 5, en la que la semivida en suero de la proteína o péptido terapéutico está aumentada en comparación con la semivida en suero de la proteína o péptido terapéutico en estado no fusionado.
7. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que la proteína o péptido terapéutico está fusionado al extremo C terminal del resto de transferrina.
8. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que la proteína o péptido terapéutico está fusionado al extremo N terminal del resto de transferrina.
9. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que la proteína o péptido terapéutico está insertado en al menos un bucle del resto de transferrina.
10. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina tiene afinidad reducida por un TfR.
11. La proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina es lacto transferrina (lactoferrina).
12. Una proteína de fusión de la reivindicación 10, en la que el resto de transferrina no se une a TfR.
13. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina tiene afinidad reducida por el hierro.
14. Una proteína de fusión de la reivindicación 13, en la que el resto de transferrina no une el hierro.
15. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina comprende al menos una mutación que evita la glicosilación.
16. Una proteína de fusión de la reivindicación 15, en la que la proteína transferrina es lacto transferrina (lactoferrina).
17. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que un conector peptídico une la proteína o péptido terapéutico al resto de transferrina.
18. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el resto de transferrina tiene al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácido en la región bisagra para impedir el cambio conformacional necesario para la unión del hierro o el reconocimiento del receptor de Tf.
19. Una proteína de fusión de la reivindicación 18, en la que dicha región horquilla se selecciona del grupo constituido por el residuo 94 al residuo 96 de ID. SEC. Nº 3, el residuo 245 al residuo 247 de ID. SEC. Nº 3, y el residuo 316 al residuo 318 de ID. SEC. Nº 3 del dominio N.
20. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que dicho resto de transferrina tiene al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácido en una posición en ID. SEC. Nº 3 seleccionada del grupo constituido por los residuos Asp 63, Gly 65, Tyr 95, Tyr 188, Lys 206, His 207, His 249, Thr 120, Arg 124, Ala 126 y Gly 127 del dominio N.
21. Una proteína de fusión de la reivindicación 9, en la que la proteína o péptido terapéutico sustituye al menos un bucle.
22. Una proteína de fusión de la reivindicación 4, en la que los residuos del dominio C que corresponden a los aminoácidos 413-427 de ID. SEC. Nº 3 están sustituidos con los residuos del dominio N que corresponden a los aminoácidos 86-96 de ID. SEC. Nº 3.
23. Una proteína de fusión de la reivindicación 4, en la que los residuos del dominio C que corresponden a los aminoácidos 610-620 de ID. SEC. Nº 3 están sustituidos con los residuos del dominio N que corresponden a los aminoácidos 276-283 de ID. SEC. Nº 3.
24. Una proteína de fusión de la transferrina según la reivindicación 1, en la que el resto de transferrina comprende dos o más dominios C de transferrina que están modificados para inhibir o evitar la glicosilación y la unión al receptor de Tf.
25. Una proteína de fusión de la transferrina de la reivindicación 24, en la que el resto de transferrina se ha modificado para inhibir o evitar la unión del hierro.
26. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la reivindicación 1.
27. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 26.
28. Una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 26 o un vector de la reivindicación 27.
29. Un procedimiento para expresar una proteína de fusión de Tf que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 29 en condiciones en las que exprese la proteína de fusión codificada.
30. Una célula huésped de la reivindicación 28, en la que la célula es procariota o eucariota.
31. Una célula huésped de la reivindicación 30, en la que la célula es una célula de levadura.
32. Un animal transgénico no humano que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 26.
33. Un procedimiento para producir una proteína de fusión de Tf que comprende aislar una proteína de fusión de una muestra obtenida de un animal transgénico no humano de la reivindicación 32.
34. Un procedimiento de la reivindicación 33, en el que el resto de transferrina es un resto de lactoferrina.
35. Un procedimiento de la reivindicación 34, en el que la muestra es un líquido biológico de un animal transgénico no humano.
36. Un procedimiento de la reivindicación 35, en el que el líquido es suero o leche.
37. Una proteína de fusión de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de una enfermedad o síntoma de enfermedad en un paciente.
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