PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE PRODUCTOS DE HIDROLISIS DE LA PECTINA.

Procedimiento para la obtención de productos de la hidrólisis de la pectina,

en donde la pectina o el material vegetal que contiene pectina en solución o suspensión acuosa, se trata en un primer paso de procedimiento, con una enzima A hidrolizante de la pectina, y en un segundo paso de procedimiento, con una enzima B hidrolizante de la pectina, en el cual se obtienen los productos de la hidrólisis de la pectina con una proporción de galacturónidos, los cuales contienen por lo menos una molécula de ácido galacturónico sin saturar en 4,5 y se esterifican con metanol hasta =q 20%

Procedimiento para la preparación de productos de hidrólisis de la pectina.

La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de hidrolizados de pectina, en particular de un preparado farmacéutico o dietético para la disminución y/o la inhibición de la adhesión de substancias y organismos patógenos a las células eucariotas, en particular células de mamíferos o para la inhibición de acciones recíprocas célula-célula y/o célula-matriz, inducidas por la galectina-3, las cuales conducen al desarrollo de enfermedades tumorales, un procedimiento para el bloqueo de la fijación de substancias u organismos patógenos en las células eucariotas, un procedimiento para la inhibición de las acciones recíprocas célula-célula y/o célula-matriz inducidas por la galectina-3, así como los hidrolizados y preparados de pectina preparados por medio de este procedimiento.

Los organismos patógenos aunque también las substancias perjudiciales para las células deben adherirse solamente a la superficie de las células diana, para poder desarrollar una infección o respectivamente un perjuicio a las células atacadas. Esta adhesión o pegado está inducida por ejemplo por una dependencia ligando-receptor en la cual las glicoestructuras juegan un papel importante. Cuando estas glicoestructuras se bloquean sobre la superficie de las células diana, o en los ligandos, se puede inhibir una infección.

Las glicoestructuras juegan también un papel importante en la formación de tumores y formación de metástasis (Liotta y col., Annu. Rev. Cell Biol., 55 (1986), 1037-1057). La formación de tumores comprende interacciones celulares que son inducidas por componentes de la superficie celular, en particular proteínas unidas a hidratos de carbono. Así, la adhesión de las células tumorales es inducida por moléculas de adhesión celular. Muchos pasos de la formación de metástasis comprenden también acciones recíprocas célula- célula o respectivamente acciones recíprocas entre células y la matriz extracelular (ECM), la cual es inducida por los componentes de la superficie de la célula. La matriz extracelular (ECM) se compone principalmente de laminina, fibronectina y proteoglicanos, de los cuales se glicosidan muchos, y cuyas cadenas laterales de oligosacáridos son determinantes de reconocimiento para las moléculas de adhesión celular. La laminina es una glicoproteína unida al -N, la cual tiene secuencias de poli-N-acetillactosamina. La colonización por metástasis tiene lugar cuando los aglomerados circulantes de células tumorales, trombocitos y linfocitos toman contacto con el endotelio de los capilares mediante moléculas de adhesión. Esta toma de contacto suministra la señal para la apertura de las funciones de las células endoteliales. De esta forma las células tumorales pueden unirse, mediante otras moléculas de adhesión, a los receptores sobre la membrana basal. Después de la destrucción de la membrana basal, las células tumorales tienen entrada directa al estoma, en donde de nuevo, como en la primera invasión tumoral, tienen lugar interacciones entre la laminina y la fibronectina y los receptores correspondientes.

Importantes representantes de las proteínas unidas a hidratos de carbono, son la galectina-1 y la galectina-3 unidas a galactósidos (Raz y Lotan, Cáncer Metastasis Rev. 6 (1987), 433; Gabius, Biochim. Biophys. Acta, 1071 (1991), 1). De la galectina-3 es sabido que fomenta la dispersión tumoral embólica en el circuito sanguíneo, y aumenta la formación de metástasis. La galectina-3 se expresa sobre la superficie celular de muchas células tumorales, en las cuales la expresión de la galectina-3 aumenta con un progresivo desarrollo tumoral. La galectina-3 se expresa igualmente a partir de macrófagos activos y células transformadas o congénitas o respectivamente células de metástasis. La galectina-3 posee una alta afinidad para los oligosacáridos, los cuales comprenden la polilactosamina, en donde la galectina-3 se une en particular a dos glicoproteínas, las cuales se encuentran en varios tipos de células, por ejemplo las células del carcinoma del intestino grueso humano y las células del carcinoma de mama humano. Otro ligando de la galectina-3 es por ejemplo la laminina. La galectina-3, que se expresa también sobre la superficie de las células endoteliales, participa igualmente en la adhesión de las células tumorales a las células endoteliales.

La patente US 5.834.442 describe un procedimiento para el tratamiento de las enfermedades cancerígenas en los mamíferos, en particular para el tratamiento de carcinomas de próstata, en donde el tratamiento de las enfermedades cancerígenas incluida la inhibición de la formación de metástasis mediante la administración oral de pectina modificada, tiene lugar preferiblemente en la citruspectina de pH modificado, soluble en agua. Para la preparación de la pectina de pH modificado se despolimeriza una solución de pectina elevando el valor del pH a 10,0 y a continuación disminuyendo el valor del pH a 3,0. La pectina modificada posee un peso molecular de aproximadamente 1 a 15 kd. Ratas, a las cuales se administró citruspectina modificada en agua potable, mostraron en comparación con grupos de control sin tratar, una formación significativamente disminuida de metástasis pulmonares. Experimentos in vitro, mostraron que la adhesión de la galectina-3 que se expresa en células endoteliales MLL en las células endoteliales de la aorta de la rata (RAEC) en presencia de citruspectina modificada fue casi completamente inhibida. En otros experimentos se investigó la acción de la citruspectina de pH modificado sobre la formación de colonias de células endoteliales MLL. La capacidad de crecimiento de las células en un medio semisólido (con independencia de la fijación) puede emplearse como criterio para la transformación y el potencial de invasión de las células, puesto que el crecimiento de las células en un medio semisólido fomenta la migración de las células y la formación de colonias. A este respecto se estableció que la citruspectina modificada podría reducir tanto el número de colonias MLL formadas como también podía reducir significativamente su tamaño. La citruspectina modificada parece a este respecto ejercer más bien un efecto citostático que un efecto citotóxico. También se investigó el efecto de la citruspectina modificada sobre las relaciones recíprocas célula-célula y las acciones recíprocas célula- matriz, las cuales se basan en mecanismos inducidos por hidratos de carbono, en particular interacciones inducidas por la galectina-3. A este respecto, se mostró, que la citruspectina modificada al contrario de la citruspectina sin modificar, inhibió la adhesión de las células de melanoma B16-F1 en la laminina. De la laminina se conoce que sirve como ligando para la galectina-3, soluble.

A partir de la patente EP 0 716 605, se conoce que mediante una sopa de zanahorias particularmente preparada, "Blasentee" ("té de vejiga"), leche de coco, etc., la adherencia de microorganismos patógenos, como por ejemplo el E. coli, en células, en particular en las células epiteliales del tracto gastrointestinal y urogenital puede ser reducida esencialmente (es decir, hasta un 90%). Según ese documento, este efecto debe atribuirse a la pectina que se encuentra en los productos vegetales, esencialmente se trata de galacturónidos unidos 1,4-a-glicosidicamente en cadenas, cuyos grupos ácidos están esterificados desde un 20 hasta un 80% con metanol, y pueden contener eventualmente junto al ácido galacturónico, otros elementos fundamentales de azúcar, como por ejemplo glucosa, galactosa, xilosa, y arabinosa. Además, puede todavía deducirse del documento, que el ácido monogalacturónico no muestra ningún bloqueo de la adhesión, mientras que con el digalacturónido y el trigalacturónido puede comprobarse un bloqueo de hasta el 91,7% o respectivamente el 84,6%. En este documento se comprueba claramente que el ácido galacturónico monómero no presenta ningún bloqueo de la adhesión y que el efecto bloqueante deseado disminuye a la vez que aumenta el peso molecular de los galacturónidos. De ello se deduce que el grado de polimerización de los galacturónidos deseados es de DP 2 ó respectivamente 3. Además se reivindicó que el grado de esterificación era < 2%. Los productos de la hidrólisis de la pectina preparados según el método allí descrito, contienen sin embargo una parte muy pequeña de los di- y trigalacturónidos descritos como efectivos (aproximadamente el 12% referido al producto crudo). Este método de obtención hace inútil toda investigación y conduce a problemas del medio ambiente, pues-to que los productos secundarios, que se producen...

1. Procedimiento para la obtención de productos de la hidrólisis de la pectina, en donde la pectina o el material vegetal que contiene pectina en solución o suspensión acuosa, se trata en un primer paso de procedimiento, con una enzima A hidrolizante de la pectina, y en un segundo paso de procedimiento, con una enzima B hidrolizante de la pectina, en el cual se obtienen los productos de la hidrólisis de la pectina con una proporción de galacturónidos, los cuales contienen por lo menos una molécula de ácido galacturónico sin saturar en 4,5 y se esterifican con metanol hasta =q 20%.

2. Procedimiento para la obtención de productos de la hidrólisis de la pectina según la reivindicación 1, en donde los productos de la hidrólisis líquidos obtenidos en el segundo paso de procedimiento son tratados en un tercer paso de procedimiento con una enzima C, en donde dicha enzima C es una pectinesterasa (EC 3.1.1.11).

3. Procedimiento para la obtención de productos de la hidrólisis de la pectina según la reivindicación 1 ó 2, en donde los productos de la hidrólisis líquidos obtenidos en el segundo o tercer paso del procedimiento, se liberan por filtración y/o centrifugación de los componentes insolubles y se transforman en forma sólida.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque, la pectina empleada es la pectina de cítricos, la pectina de manzana o la pectina de remolacha azucarera.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque, el material que contiene pectina son recortes de remolacha azucarera, restos de manzana, o residuos secos de la fabricación de jugo de naranja, jugo de limón y/o jugo de lima.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, la enzima A es una endopoligalacturonasa o una pectinliasa (EC 4.2.2.10).

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 al 6, caracterizado porque, la enzima B es una endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15) ó una pectinliasa.

8. Productos de la hidrólisis de la pectina, que pueden obtenerse según uno de los procedimientos según una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde en los productos de la hidrólisis de la pectina, la proporción de hidratos de carbono con un DP-1 en los hidratos de carbono totales del hidrolizado de la pectina es <25% en peso (referido a la substancia seca).

9. Preparado farmacéutico o dietético, que contiene un producto de la hidrólisis de la pectina según la reivindicación 8, eventualmente junto con un soporte farmacéuticamente compatible.

10. Empleo de los productos de la hidrólisis de la pectina, obtenidos según uno de los procedimientos según una de las reivindicaciones 1 a 7, para la elaboración de un preparado farmacéutico para combatir una infección.

11. Empleo según la reivindicación 10, en donde el preparado farmacéutico se administra por vía oral.

12. Empleo de los productos de la hidrólisis de la pectina obtenidos según uno de los procedimientos según una de las reivindicaciones 1 a 7, como componente de determinados productos alimenticios para la alimentación humana.

13. Empleo de los productos de la hidrólisis de la pectina obtenidos según uno de los procedimientos según una de las reivindicaciones 1 a 7, como componente de piensos animales.

14. Empleo de los productos de la hidrólisis de la pectina obtenidos según uno de los procedimientos según una de las reivindicaciones 1 a 7, para la elaboración de un preparado farmacéutico para la inhibición de acciones recíprocas células-célula y/o acciones recíprocas entre las células y la matriz extracelular en un ser humano o en un animal mamífero.

15. Empleo según la reivindicación 14, en donde las acciones recíprocas células-célula y/o célula-matriz, se inducen mediante moléculas de galectina-3 unidas a hidratos de carbono que se encuentran en la superficie de las células.

16. Empleo según la reivindicación 14 ó 15, en donde las células son células tumorales y las acciones recíprocas células-célula y/o célula-matriz son responsables del desarrollo de enfermedades tumorales de humanos o animales mamíferos.

17. Empleo según una de las reivindicaciones 14 a 16, en donde las enfermedades tumorales son el carcinoma de próstata, el carcinoma de riñón, el sarcoma de Kaposi, formas del curso de leucemias crónicas, carcinomas de mama, adenocarcinomas de mama, sarcomas, carcinomas de ovario, carcinomas del recto, carcinomas de la laringe, melanomas, tumores del intestino delgado, carcinomas del intestino grueso, tumores laríngeos, mastocitomas, carcinomas pulmonares, carcinomas bronquiales, carcinomas epiteliales en placas de la laringe, carcinomas gastrointestinales y/o tumores del estómago.

18. Empleo según una de las reivindicaciones 14 a 17, en donde el hidrolizado de pectina inhibe la adherencia de las células tumorales y/o el potencial de invasión de las células tumorales metastásicas.

19. Empleo según una de las reivindicaciones 14 a 18, en donde el preparado farmacéutico se administra por vía oral.

20. Empleo de los productos de la hidrólisis de la pectina obtenidos según uno de los procedimientos según una de las reivindicaciones 1 al 7, para la elaboración de un preparado farmacéutico para el tratamiento de enfermedades tumorales de un ser humano o de un animal mamífero.

21. Empleo según la reivindicación 20, en donde las enfermedades tumorales se basan en acciones recíprocas célula-célula y/o acciones recíprocas entre células y la matriz.

22. Empleo según la reivindicación 20 ó 21, en donde las acciones recíprocas célula-célula y/o celulas-matriz son inducidas por moléculas de galectina-3 unidas a hidratos de carbono que se encuentran en la superficie de las células.

23. Empleo según una de las reivindicaciones 20 a 22, en donde las enfermedades tumorales son el carcinoma de próstata, el carcinoma de riñón, el sarcoma de Kaposi, formas del curso de la leucemia crónica, carcinomas de mama, adenocarcinomas de mama, sarcomas, carcinomas de ovario, carcinomas del recto, carcinomas de la laringe, melanomas, tumores del intestino delgado, carcinomas del intestino grueso, tumores laríngeos, mastocitomas, carcinomas pulmonares, carcinomas bronquiales, carcinomas epiteliales en placas de la laringe, carcinomas gastrointestinales y/o tumores del estómago.

24. Empleo según una de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el preparado farmacéutico para la reducción del crecimiento de tumores, se emplea en particular para la inhibición de la adherencia de células tumorales.

25. Empleo según una de las reivindicaciones 20 a 24, en donde el preparado farmacéutico para la reducción de la formación de metástasis se emplea en particular para la reducción del potencial de invasión de las células tumorales.

26. Empleo según una de las reivindicaciones 20 a 25, en donde el preparado farmacéutico se administra por vía oral.