POLIPEPTIDOS MODIFICADOS DEPENDIENTES DE LA VITAMINA K.

Procedimiento para la preparación de un polipéptido modificado dependiente de la vitamina K que comprende la modificación del péptido de activación de un primer polipéptido dependiente de la vitamina K de forma que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida aumentada en comparación con el primer polipéptido dependiente de la vitamina K en el que el péptido de activación no se ha modificado,

procedimiento en el que la proteína dependiente de la vitamina K se selecciona entre un listado compuesto por factor VII, factor IX, factor X, protrombina y sus formas activadas, proteína S, proteína C y proteína Z y

a. en el que el péptido de activación modificado comprende, como mínimo, parte de la secuencia de aminoácidos de un segundo polipéptido dependiente de la vitamina K y

b. en el que la citada parte de la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K es

i.como mínimo, 3 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FVII,

ii.como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FX, o

iii.como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FIX a condición de que se excluya el péptido QSFNDFTR, o

iv.como mínimo, 8 aminoácidos contiguos del péptido de activación de la protrombina, o

v.como mínimo, un tramo de aminoácidos contiguos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K que tiene una longitud de, como mínimo, 15% de la longitud total de la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K, en el que el segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto por proteína Z y proteína S

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2005/008678.

Solicitante: CSL BEHRING GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: EMIL-VON-BEHRING-STRASSE 76,35041 MARBURG.

Inventor/es: WEIMER, THOMAS, DR., HAUSER, HANS-PETER DR., SCHULTE,STEFAN,DR, HOFMANN,KAY.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 26 de Mayo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/62 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.

Clasificación PCT:

  • A61K38/36 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Factores de coagulación sanguínea o de fibrinolisis.
  • A61P7/04 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.A61P 7/00 Medicamentos para el tratamiento de trastornos de la sangre o del fluido extracelular. › Antihemorrágicos; Procoagulantes; Hemostáticos; Antifibrinolíticos.
  • C12N15/57 C12N 15/00 […] › que actúan sobre los enlaces peptídicos (3.4).
  • C12N9/64 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › que provienen de tejido animal, p. ej. renina.

Fragmento de la descripción:

Polipéptidos modificados dependientes de la vitamina K.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ADNc modificado que codifican para polipéptidos dependientes de la vitamina K, en particular al factor VII humano, factor VIIa humano, factor IX humano y proteína C humana y a sus derivados con una estabilidad mejorada y una semivida plasmática prolongada, a vectores de expresión recombinante que contienen dichas secuencias de ADNc, a células huésped transformadas con dichos vectores de expresión recombinante, a polipéptidos recombinantes y a derivados que tienen las actividades biológicas de la proteína natural sin modificar pero que tienen estabilidad mejorada y a procedimientos para la fabricación de dichas proteínas recombinantes y de sus derivados. La invención también cubre un vector de transferencia para su uso en terapia génica humana, que comprende dichas secuencias de ADN modificado.

Antecedentes de la invención

Las proteínas dependientes de la vitamina K se utilizan para tratar ciertos tipos de hemofilia. La hemofilia clásica o hemofilia A es un trastorno hemorrágico hereditario. Es el resultado de una deficiencia ligada al cromosoma X del factor VIII de la coagulación sanguínea y afecta casi de forma exclusiva a varones con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada 10 000. El defecto del cromosoma X es transmitido por portadores de sexo femenino que no son hemofílicas. La manifestación clínica de la hemofilia A es un aumento de la tendencia a la hemorragia. Antes de que se introdujese el tratamiento con concentrados del factor VIII, la esperanza media de vida para una persona con hemofilia grave era de menos de 20 años. La utilización de concentrados del factor VIII procedentes de plasma y más tarde de formas recombinantes del FVIII ha mejorado de forma considerable la situación para los pacientes con hemofilia, aumentando en gran medida la esperanza media de vida, lo que les proporciona a la mayoría de ellos la posibilidad de vivir una vida más o menos normal. La hemofilia B es 5 veces menos prevalente que la hemofilia A y es causada por un FIX no funcional o ausente y se trata con concentrados del FIX procedentes de plasma o con una forma recombinante del FIX. Tanto en la hemofilia A como en la hemofilia B, el problema médico más grave en el tratamiento de la enfermedad es la generación de aloanticuerpos contra los factores de sustitución. Hasta el 30% de todos los pacientes con hemofilia A desarrollan anticuerpos para el FVIII. Los anticuerpos para el FIX surgen en una menor medida aunque con consecuencias más graves, ya que son menos susceptibles a la terapia de inducción de tolerancia inmunológica.

El modelo actual de coagulación afirma que el desencadenante fisiológico de la coagulación es la formación de un complejo entre el factor tisular (FT) y el factor VIIa (FVIIa) en la superficie de las células que expresan el FT que normalmente se encuentran situadas fuera de la red vascular. Esto conduce a la activación del FIX y del FX que a la larga genera algo de trombina. En un bucle de retroalimentación positiva la trombina activa los FVIII y FIX, el denominado brazo "intrínseco" de la cascada de la coagulación sanguínea, lo que amplifica de este modo la generación del FXa, que es necesario para la generación de un gran incremento de la cantidad de trombina total para lograr la hemostasia completa. Se demostró que mediante la administración de concentraciones suprafisiológicas del FVIIa, se conseguía la hemostasia eludiendo la necesidad del FVIIIa y del FIXa. La clonación del ADNc para el FVII (patente de EUA 4,784,950) hizo posible el desarrollo de una sustitución recombinante de ese factor de coagulación procedente del plasma. Este FVIIa se administró con éxito por primera vez en 1988 a un paciente con una alta concentración de anticuerpos inhibidores para el FVIII. Desde entonces el número de indicaciones del FVIIa ha crecido continuamente, lo que demuestra que tiene potencial para llegar a ser un agente hemostático universal (Erhardtsen, 2002).

El FVII es una glicoproteína de cadena sencilla con un peso molecular de 50 kDa, que es secretada por parte de las células hepáticas hacia el interior de la corriente sanguínea como un zimógeno inactivo de 406 aminoácidos. Contiene residuos de ácido 10-?-carboxi-glutámico (posiciones 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35) situados en el dominio Gla de la proteína. Los residuos Gla requieren vitamina K para su biosíntesis. Situados en el extremo C-terminal respecto del dominio Gla se encuentran dos dominios del factor de crecimiento epidérmico seguidos por un dominio de serina proteasa de tipo tripsina. Modificaciones postranslacionales adicionales del FVII abarcan la hidroxilación (Asp 63), N-(Asn145 y Asn322) así como la glicosilación de tipo O (Ser52 y Ser60).

El FVII se convierte en su forma activa FVIIa mediante la proteolisis del enlace peptídico sencillo en Arg152-Ile153, lo que conduce a la formación de dos cadenas de polipéptidos, una cadena ligera con N-terminal (17 kDa) y una cadena pesada con C-terminal (28 kDa) que se mantienen juntas mediante un puente disulfuro. En contraposición a otros polipéptidos dependientes de la vitamina K, no se ha descrito ningún péptido de activación que se separe durante la activación para el FVII. El sitio de corte Arg152-Ile153 se corresponde mediante comparación de homologías con el sitio de corte de activación con C-terminal de otros polipéptidos dependientes de la vitamina K. No obstante, como la Arg144 también puede constituir un sitio de corte de proteasa, no se puede excluir que, en contraposición con el pensamiento actual, el FVII posea un péptido de activación de 8 aminoácidos entre Arg144 y Arg152.

Para alcanzar la conformación activa del FVIIa resulta esencial la formación de un puente salino después del corte de activación entre Ile153 y Asp343. La activación del FVII se puede lograr in vitro mediante FXa, FXIIa, FIXa, FVIIa, FSAP y trombina. Mollerup y otros (Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505) informaron que también tiene lugar algo de corte en la cadena pesada en Arg290 y/o en Arg315.

El FVII se encuentra presente en el plasma en una concentración de 500 ng/ml. El 1%, por ejemplo 5 ng/ml del FVII, se encuentra presente como FVIIa. Se descubrió que la semivida plasmática del FVII era de aproximadamente 4 horas y que la del FVIIa era de aproximadamente 2 horas. Aunque la semivida del FVIIa de 2 horas es comparativamente larga para un factor de coagulación activado y, por otra parte, se encuentra más en el orden de los minutos debido a la inhibición irreversible por Serpinas como la antitrombina III, lo que, sin embargo, constituye un grave inconveniente para la utilización terapéutica del FVIIa, ya que conduce a la necesidad de múltiples inyecciones por vía i.v. o a una infusión continua para conseguir la hemostasia, lo que da como resultado un tratamiento de coste muy elevado e inconvenientes para el paciente. Como por otra parte el FVIIa tiene el potencial de utilizarse como un agente hemostático universal, hay una gran necesidad médica de desarrollar formas del FVIIa que tengan una semivida funcional más larga.

Se han hecho varios intentos para modificar el FVII:

Nicolaisen y otros (documento WO 88/10295, 25 de junio, 1987) sugieren que mediante la eliminación o la modificación de los siguientes aminoácidos, el FVII se estabilizará contra la degradación proteolítica: Lys32, Lys38, Lys143, Arg290, Arg315, Lys316, Lys341, Arg392, Arg 396, Arg 402, Ile42 y Tyr44.

Nicolaison (patente de EUA 5,580,560, 13 de noviembre, 1989) amplía el documento WO 88/10295 para incluir además mutaciones o supresiones en Arg304, Phe278 y Tyr332 para volver al FVII/FVIIa menos susceptible a la proteolisis.

Bharadwaj y otros (JBC (1996), 48 pp. 30685-30691) expresaron el Phe328Ser mutante del FVII que no activaba el FX y que no mostraba actividad amidolítica detectable.

Dickinson y otros (PNAS (1996) 93, 14379-14384) propusieron variantes del FVIIa en las que Lys157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 o Lys337 habían sido sustituidos por Ala.

Nelsestuen (documento WO 99/29767, 23 de octubre, 1997) modificó el dominio Gla mediante la introducción de mutaciones puntuales de forma que se mejorase su afinidad hacia las membranas fosfolipídicas, lo que dio como resultado de ese modo un FVIIa modificado con actividad específica mejorada. Las mutaciones puntuales propuestas eran en Pro10, Gly11, Arg28 y Lys32.

Nelsestuen (documento WO 00/66753, 29 de abril, 1999) modificó el dominio Gla mediante la introducción...

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la preparación de un polipéptido modificado dependiente de la vitamina K que comprende la modificación del péptido de activación de un primer polipéptido dependiente de la vitamina K de forma que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida aumentada en comparación con el primer polipéptido dependiente de la vitamina K en el que el péptido de activación no se ha modificado, procedimiento en el que la proteína dependiente de la vitamina K se selecciona entre un listado compuesto por factor VII, factor IX, factor X, protrombina y sus formas activadas, proteína S, proteína C y proteína Z y

a. en el que el péptido de activación modificado comprende, como mínimo, parte de la secuencia de aminoácidos de un segundo polipéptido dependiente de la vitamina K y

b. en el que la citada parte de la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K es

i.como mínimo, 3 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FVII, ii.como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FX, o iii.como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FIX a condición de que se excluya el péptido QSFNDFTR, o iv.como mínimo, 8 aminoácidos contiguos del péptido de activación de la protrombina, o v.como mínimo, un tramo de aminoácidos contiguos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K que tiene una longitud de, como mínimo, 15% de la longitud total de la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K, en el que el segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto por proteína Z y proteína S.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la semivida plasmática del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K es mayor que la del primer polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 y 2, en el que la modificación comprende la sustitución de, como mínimo, dos aminoácidos del péptido de activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K.

4. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la citada parte del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K consta de, como mínimo, 8 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K.

5. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la modificación comprende la sustitución del péptido de activación completo del primer polipéptido dependiente de la vitamina K con el péptido de activación completo del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K, al tiempo que se preserva la especificidad de activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K.

6. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la modificación comprende (i) la eliminación del sitio de corte entre la cadena ligera y el péptido de activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K o (ii) la eliminación del sitio de corte entre el péptido de activación y la cadena pesada del primer polipéptido dependiente de la vitamina K.

7. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la forma activada del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida plasmática aumentada en comparación con la forma activada del polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K.

8. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la forma activada del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida plasmática aumentada en comparación con la forma activada del polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K y en el que el péptido de activación modificado del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K se libera después de la activación del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K.

9. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la forma del zimógeno del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida plasmática aumentada en comparación con la forma del zimógeno del polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K y en el que el péptido de activación modificado del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K se libera después de la activación del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K.

10. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la forma activada del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida plasmática aumentada en comparación con la forma activada del polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K y en el que el péptido de activación modificado del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K después de la activación del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K permanece unido de forma covalente a la cadena ligera o a la cadena pesada del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K.

11. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la forma del zimógeno del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida plasmática aumentada en comparación con la forma del zimógeno del polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K y en el que el péptido de activación modificado del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K después de la activación del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K permanece unido de forma covalente a la cadena ligera o a la cadena pesada del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K.

12. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el primer polipéptido dependiente de la vitamina K es el factor VII o el VIIa humano.

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 18 y el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 19.

14. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el primer polipéptido dependiente de la vitamina K es la proteína C humana y en el que la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 18 y el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 19.

15. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que el primer polipéptido dependiente de la vitamina K es el factor IX humano y en el que el péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K tiene la secuencia de aminoácidos tal como la que se muestra en el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 19.

16. Polipéptido modificado dependiente de la vitamina K que comprende un péptido de activación modificado, en el que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida aumentada en comparación con el polipéptido dependiente de la vitamina K en el que el péptido de activación no se ha modificado, procedimiento en el que la proteína dependiente de la vitamina K se selecciona entre un listado compuesto por factor VII, factor IX, actor X, protrombina y sus formas activadas, proteína S, proteína C y proteína Z y

a. en el que el péptido de activación modificado comprende, como mínimo, parte de la secuencia de aminoácidos de un segundo polipéptido dependiente de la vitamina K y

b. en el que la citada parte de la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K es

i.como mínimo, 3 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FVII, o ii.como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FX, o iii.como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FIX a condición de que se excluya el péptido QSFNDFTR, o iv.como mínimo, 8 aminoácidos contiguos del péptido de activación de la protrombina, o v.como mínimo, un tramo de aminoácidos contiguos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K que tiene una longitud de, como mínimo, el 15% de la longitud total de la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K, en el que el segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto por proteína Z y proteína S.

17. Polipéptido modificado dependiente de la vitamina K según la reivindicación 16, en el que la parte del péptido de activación de los polipéptidos diferentes dependientes de la vitamina K consta de, como mínimo, 8 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del polipéptido diferente dependiente de la vitamina K.

18. Polipéptido modificado dependiente de la vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, en el que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto por factor VII humano modificado, factor IX humano modificado y proteína C humana modificada.

19. Polipéptido modificado dependiente de la vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K es el factor VII humano modificado en el que, como mínimo, se han sustituido dos aminoácidos del péptido de activación con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 18 y por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 19.

20. Polipéptido modificado dependiente de la vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K es proteína C humana modificada en la que, como mínimo, se han sustituido dos aminoácidos del péptido de activación con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 18 y por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 19.

21. Polipéptido modificado dependiente de la vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K es el factor IX modificado en el que el péptido de activación se ha sustituido con la secuencia de aminoácidos tal como la que se muestra en el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 19.

22. Polipéptido modificado dependiente de la vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que la semivida del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K se incrementa en, como mínimo, 50% en comparación con el polipéptido dependiente de la vitamina K correspondiente en el que no se ha modificado el péptido de activación.

23. Polipéptido modificado dependiente de la vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en el que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una estabilidad aumentada en comparación con el polipéptido dependiente de la vitamina K correspondiente en el que no se ha modificado el péptido de activación.

24. Polipéptido modificado dependiente de la vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, que tiene actividad coagulante.

25. Polipéptido modificado dependiente de la vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizado por que

i. la forma activada del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K no comprende el péptido de activación modificado y

ii. la forma del zimógeno del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida aumentada en comparación con la forma del zimógeno del polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K.

26. Polipéptido modificado dependiente de la vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizado por que

i. la forma activada del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K comprende el péptido de activación modificado y

ii. la forma activada del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida aumentada en comparación con la forma activada del polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K.

27. Polinucleótido que codifica un polipéptido modificado dependiente de la vitamina K según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26.

28. Plásmido o vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 27.

29. Plásmido o vector, según la reivindicación 28, que es un vector de expresión.

30. Vector, según la reivindicación 28, que es un vector de transferencia para su utilización en terapia génica humana.

31. Célula huésped que comprende un polinucleótido según la reivindicación 27 o un plásmido o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 excepto células embrionarias humanas y células germinales humanas.

32. Procedimiento para la producción de un polipéptido modificado dependiente de la vitamina K, que comprende:

- el cultivo de células huésped, según la reivindicación 31, bajo condiciones tales que se exprese el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K y

- opcionalmente la recuperación del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K de las células huésped o del medio de cultivo.

33. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido modificado dependiente de la vitamina K según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, un polinucleótido según la reivindicación 27, o un plásmido o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30.

34. Utilización de un polipéptido modificado dependiente de la vitamina K según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, de un polinucleótido según la reivindicación 27, de un plásmido o de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, o de una célula huésped según la reivindicación 31 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno de la coagulación sanguínea.

35. Utilización, según la reivindicación 34, en la que el trastorno de la coagulación sanguínea es hemofilia A.

36. Utilización, según las reivindicaciones 34 ó 35, en la que el tratamiento comprende terapia génica humana.


 

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Utilización diagnóstica de un polipéptido de fusión que comprende una proteína vírica y un enzima MGMT, del 15 de Abril de 2020, de INSTITUT PASTEUR: Utilización in vitro de un polipéptido de fusión que comprende una proteína vírica y i) el enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT, EC 2.1.1.63) o un homólogo […]

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