La presente invención se refiere a un procedimiento para producir 3,

4-dihidroxi-L-fenilalanina (a partir de ahora L-dopa) a partir de L-tirosina, utilizando como catalizador una enzima tirosinasa obtenida a partir de un microorganismo, concretamente la tirosinasa NP_518458 obtenida de la bacteria Ralstonia solanacearum. El procedimiento propuesto por la presente invención, permite la acumulación de todo el L-dopa formado, evitando la desventaja de la oxidación no deseada del L-dopa que se va formando y, por tanto, la pérdida de producto que se produce con el uso de otras tirosinasas descritas en el Estado de la Técnica

Procedimiento de obtención de L-dopa a partir de L-tirosina utilizando la enzima tirosinasa NP_518458 de la bacteria Ralstonia solanacearum.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (a partir de ahora L-dopa) a partir de L-tirosina, utilizando como catalizador una enzima tirosinasa obtenida a partir de un microorganismo, concretamente la tirosinasa NP_518458 obtenida de la bacteria Ralstonia solanacearum.

Estado de la técnica

La 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (a partir de ahora L-dopa) se utiliza para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Se sabe que el L-dopa está presente en la cáscara y en las semillas de la planta Vicia faba, haba de donde se puede obtener por extracción. El L-dopa se puede obtener por síntesis a partir de productos intermedios como la vainillina y la tirosina.

El L-dopa también se produce bioquímicamente utilizando L-tirosina y tirosinasa, o con otros sustratos y ß-tirosinasa producida por un microorganismo como se describe después. La L-tirosina es uno de los aminoácidos esenciales y se produce a escala comercial por extracción de sustancias naturales y enzimáticamente.

Katsuji Haneda, Shiro Watanabe, y Isao Takeda son los autores de "Synthesis of L-3,4-Dihydroxyphenylalanine from L-Tyrosine by Microorganisms" publicado en Applied Microbiology, 22, 721-722 (1971) en el que describen que L-dopa puede ser sintetizada eficientemente a partir de L-tirosina en condiciones ácidas (pH de 2 a 5) a partir de especies de hongos Aspergillus, concretamente la A. chevalier y la A. oryzae sin necesidad de cofactores, mientras que a un pH neutro o alcalino, la L-tirosina se descompone en otros metabolitos y el L-dopa no se acumula.

En la patente GB 1268721 (Ajinomoto Co., Inc.), publicada el 29 de marzo de 1972, se describe un proceso para producir L-dopa o sus derivados, que comprende la reacción de catecol y uno o más aminoácidos seleccionados entre cisteína, S-alquil_p-cisteína (donde alquil_p- significa un grupo alquilo pequeño, con uno o dos átomos de carbono, normalmente metil o etil), cistina, serina y alanina, y/o una sal de dichos aminoácidos, en un medio acuoso en presencia de ß-tirosinasa como catalizador; dicha beta-tirosinasa se produjo por cultivo de uno de los microorganismos seleccionado entre los género siguientes: Escherichia, Aerobacter, Erwinia, Citrobacter, Pseudomonas, Bacillus, Xanthomonas y Proteus. Los mismos autores, en la patente US 3791924 (Ajinomoto Co., Inc.), publicada el 12 de febrero de 1974, describen un método para la obtención de L-dopa por medio de la acción de una ß-tirosinasa producida por el cultivo de microorganismos seleccionados entre los género Citrobacter, Proteus, Pseudomonas, Aerobacter, Salmonella, Erwinia, Paracolobactrum o Alcaligenes, con un compuesto que puede ser: catecol, fenol y resorcina, con a) uno o más aminoácidos seleccionados entre cisteína, S-alquil_p-cisteina (grupo alquilo pequeño), cistina, serina y alanina, o con b) amonio y un segundo compuesto del grupo que consiste en ácido pirúvico, oxalacético, malico, fumarico, glioxílico y láctico, en un medio acuoso a un pH entre 4 y 11.

En las patentes EP 0618299 Al y EP 0636695 Al (ambas solicitadas por Ajinomoto Co., Inc) publicadas respectivamente el 01.04.1993 y 21.07.1994, se describen métodos para la producción de L-dopa a partir de catecol, ácido piruvico y iones amonio, o catecol y L-serina, en presencia de 13-tirosinasa producida por Erwinia herbicola. El método de la EP 0618299 Al se caracteriza porque utiliza el cultivo obtenido después de una incubación adicional durante 6 a 24 horas después de que el cultivo de las células alcance la fase estacionaria, mientras que el pH se mantiene entre 7 y 8,3. Y el método de la EP 0636695 Al se caracteriza porque la última parte del periodo de la reacción se lleva a cabo a una temperatura menor de 25ºC con la condición de que existan cristales anhidros de L-dopa en la mezcla de reacción, mientras que el L-dopa se forma y precipita en forma de cristales anhidros, los cuales se obtienen de la mezcla.

En el documento US 5,837,504 (Xun et al.), publicada el 17 de noviembre de 1998, se reivindica un método para producir L-dopa a partir de L-tirosina que comprende a) la oxidación de la L-tirosina añadiendo dicha tirosina y un sustrato a una suspensión de células para generar NADH, formándose una mezcla de reacción; y b) incubando dicha mezcla de reacción durante un tiempo con el consumo de oxigeno molecular y NADH para producir el L-dopa. La suspensión de células se prepara a partir de una de las bacterias del grupo formado por E. coli W, E. coli S17? y E. coli DH1 que expresan la actividad 4-hidroxifenilacetato 3-hidroxilasa. El sustrato consiste en moléculas pequeñas de ácidos o alcoholes orgánicos y sus combinaciones.

En el documento de patente WO 2004/015094 A1 (DSM IP ASSETS B.V. y DMS BIOTECH GMBH), publicado el 19 de febrero de 2004, mencionan que en el proceso de US 5,837,504 al tener lugar las fermentaciones en medio acuoso, el L-dopa se oxida formando productos de polimerización marrones o negros, y que su objetivo es proporcionar un proceso de producción fermentativa en el que el L-dopa obtenido sea estable. El L-dopa se produce por fermentación aeróbica de un microorganismo recombinante que posee actividad de L-tirosina-3- hidroxi-mono-oxigenasa y la ruta metabólica: glicólisis, ruta del fosfato pentosa, ruta del aminoácido aromático, o de sus derivados, que comprende: a) fase de crecimiento y fase de producción, en la que se produce L-dopa en el medio de fermentación, y b) fase de finali-zación, en la que L-dopa se produce a partir de una fuente de carbono y el pH es de 1 a 7 al menos en esta última fase.

Los autores de la presente solicitud, durante el estudio de genes que putativamente codifican polifenol oxidaras (PPOs) en bacterias interaccionando con plantas en general y con microbios patógenos en particular pensaron que existe una conexión entre la capacidad de los microorganismos de expresar las actividades de las PPOs y la infección. Para examinar esta posibilidad eligieron la Ralstonia solanacearum como modelo apropiado para ver si esas actividades realmente se expresan en los microorganismos, ya que este organismo cuyo genoma se ha secuenciado, es una bacteria patógena que causa que plantas como la patata y el tomate se marchiten y mueran. Dichos autores encontraron que al menos tres genes se expresan y las proteínas muestran actividad PPO (Applied and Enviromental Microbiology, 71, 6808-6815; 2005). Continuando con los estudios de las actividades de las PPO producidas por la R. solanacearum (FEBS Journal, 273, 257-270; 2006), los autores de la presente solicitud han encontrado de forma sorprendente que de las dos PPOs que actúan como tirosinasas, con números de acceso NP_519622 y NP_518458, su actividad es distinta. La NP_519622 es una enzima con una clara preferencia de oxidación de o-difenoles no carboxilados y solo posee una actividad monofenolasa residual, comportándose como una catecol oxidasa. Al contrario que todas las tirosinasas hasta ahora estudiadas, y de forma inesperada se ha encontrado que la NP_518458 posee una mayor actividad como monofenolasa que o-difenolasa, es decir, que posee una actividad de tirosina hidroxilasa (TH) mayor que de dopa oxidasa (DO), y además su actividad inicial no depende apenas de la presencia de un cofactor L-dopa.

La presente invención, por tanto, se refiere a un procedimiento de obtención de L-dopa a partir de L-tirosina utilizando la enzima tirosinasa NP_518458 (denominada a partir de ahora por su número de acceso) procedente de la Ralstonia solanacearum, procedimiento mejorado en relación a los existentes ya que la tirosinasa NP_518458 de R. solanacearum tiene una actividad hidroxilante muy efectiva y permite la acumulación de todo el L-dopa formado, lo cual no ocurre en las tirosinasas descritas en el estado de la técnica. La principal desventaja del uso de otras tirosinasas es precisamente la oxidación no deseada del dopa que se va acumulando, con la consiguiente pérdida del producto deseado y por tanto económica.

Descripción de la invención

Para una eficiente expresión de la enzima, y teniendo en cuenta además que se trata de un patógeno bacteriano, el gen que codifica esta enzima será amplificado utilizando como molde DNA genómico de Ralstonia solanacearum GMI1000 y utilizando cebadores adecuados con sitios de restricción que...

1. Procedimiento de producción de 3,4-dihidroxifenil-L-alanina a partir de L-tirosina, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa c) tiene lugar aun pH entre 2 y 7.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que la etapa c) tiene lugar a un pH entre 4 y 6.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa c) tiene lugar a un pH 5.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa c) tiene lugar a temperatura no superior a 37ºC.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa c) tiene lugar de 25ºC a 30ºC.

7. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6 en el que se añade EDTA como agente quelante en concentraciones inferiores a 0.1 mM.

8. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7 en el que hay presente algún agente reductor.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7 en el que el agente reductor es el ácido ascórbico.

10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9 en el que se añada SDS como agente estimulador de la tirosinasa a una concentración entre 0.01% y 0.1%.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 10 en el que se añada SDS como agente estimulador de la tirosinasa a una concentración del 0.05%.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que se excluye la adición de L-Dopa como cofactor.