PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE G-CSF HUMANO BIOLOGICAMENTE ACTIVO A PARTIR DE CUERPOS DE INCLUSION.

Procedimiento de obtención de G-CSF humano biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión,

comprendiendo dicho procedimiento los pasos siguientes:

a) Solubilización del G-CSF contenido en los cuerpos de inclusión con un tampón de solubilización que contiene un agente desnaturalizante y glutationa reducida;

b) Replegamiento del G-CSF mediante dilución de la preparación de solubilización con un tampón de replegamiento que contiene glutationa reducida y oxidada en cantidades equimolares; y

c) Purificación del G-CSF replegado mediante al menos un paso de cromatografía

Procedimiento de obtención de G-CSF humano biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión.

La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de G-CSF humano biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión, o sea de los llamados Inclusion Bodies, que está caracterizado por el hecho de que en la solubilización del G-CSF se usa como agente reductor glutationa reducida y para el replegamiento del G-CSF se usa como sistema redox una mezcla de glutationa reducida y glutationa oxidada.

El G-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos) pertenece al grupo de los factores estimuladores de colonias que regulan la diferenciación y proliferación de células precursoras hematopoyéticas y la activación de neutrófilos. Debido a estas propiedades el G-CSF ha encontrado aplicación en varios sectores médicos, como p. ej. en la reconstitución de las poblaciones normales de células de la sangre tras quimioterapia o irradiación, o bien para la estimulación de la respuesta inmune frente a patógenos infecciosos. Además se le usa para el tratamiento de determinadas leucemias (Bronchud et al. (1987) Br. J. Cancer 56: 809-813; Morstyn et al. (1988) Lancet 1: 667-672) y en trasplantes de médula ósea.

Debido a las múltiples posibilidades de aplicación que hay para el G-CSF, el mismo debe estar disponible en cantidades suficientemente grandes. Gracias a la primera descripción de la secuencia de DNA del G-CSF en el año 1986 fue posible la fabricación por tecnología genética. El primer preparado de G-CSF, que fue fabricado a partir de G-CSF recombinante, fue homologado en 1991 en Alemania y es fabricado y comercializado con el nombre comercial de Neupogen® por la firma Amgen.

La proteína G-CSF contiene un único sitio de O-glicosilación, no influenciando la glicosilación de la proteína a la estabilidad y actividad de la proteína. Por consiguiente es posible fabricar el G-CSF recombinante mediante el uso de adecuados vectores de expresión tanto en células bacterianas como en células de mamífero. A la forma no glicosilada de G-CSF de células bacterianas se la denomina filgrastim y su producción está descrita entre otros sitios en la EP-A-0 237 545, y en cambio a la forma glicosilada del G-CSF de células de mamífero se la denomina lenograstim, cuya producción ha sido descrita p. ej. en la EP-A-0 169 566.

Se prefiere la producción en células procarióticas a la producción en células de mamífero, puesto que pueden usarse sistemas de expresión y condiciones de cultivo más sencillos. Un problema que surge frecuentemente en la fabricación de proteínas recombinantes en células procarióticas es sin embargo la formación de agregados intracelulares difícilmente solubles de formas desnaturalizadas de la proteína expresada, que son los llamados cuerpos de inclusión, que presentan en parte una estructura secundaria y pueden encontrarse en el citoplasma de las células bacterianas.

La formación de estos cuerpos de inclusión conduce a que tras el aislamiento de los cuerpos de inclusión las proteínas tengan que ser solubilizadas y renaturalizadas mediante centrifugación a velocidad moderada con ayuda de agentes adecuados, para conservar su configuración activa. Además la reacción de concurrencia entre una transformación de la proteína desnaturalizada en el correcto intermedio de plegamiento y una agregación de varias moléculas de proteína constituye un importante factor que limita la producción de proteína renaturalizada.

En el estado de la técnica han sido ya descritos varios procedimientos con los cuales una proteína contenida en cuerpos de inclusión puede ser transformada en su forma activa.

La EP-A-0 512 087 describe un procedimiento de solubilización y renaturalización de proteína desnaturalizada donde la proteína es tratada con un tampón de Tris que presenta una concentración de al menos 400 mmoles/l de base Tris o de una sal de Tris.

En la EP-A-0 719 860 se describe el aislamiento y la purificación de G-CSF, donde el G-CSF es solubilizado y oxidado en presencia de un agente desnaturalizante y de un agente oxidante tal como sulfato de cobre, que cataliza la oxidación con aire, antes de ser retirado el agente desnaturalizante y de someter al G-CSF a una cromatografía de intercambio iónico. Este procedimiento conduce a que las de aproximadamente un 70% de las moléculas de G-CSF sean oxidadas adoptando la correcta forma monómera, si bien es cierto que un tercio de los grupos tiol no es convertido en la forma deseada. Adicionalmente la eficiencia de la oxidación con aire depende de la superficie y es por consiguiente difícil de controlar.

La EP-B-0 364 926 describe un procedimiento de activación de proteínas biológicamente activas expresadas en procariotas y producidas por tecnología genética mediante solubilización y subsiguiente reactivación, aplicándose una concentración de proteína de 1 a 1000 mg/ml y efectuándose una diálisis entre la solubilización y la reactivación. Además de la costosa ejecución, una desventaja principal de este procedimiento es la de que debido a la diálisis entre la solubilización y la reactivación no pueden evitarse pérdidas de rendimiento de producción.

En la EP-A-0 219 874 se describe un procedimiento de activación de proteínas eucarióticas producidas por tecnología genética mediante expresión en procariotas, en el cual las proteínas son solubilizadas bajo condiciones desnaturalizantes y reductoras antes de separar el agente reductor/desnaturalizante y de reactivar las proteínas bajo condiciones oxidantes. Así pues, también en este procedimiento tiene lugar entre la solubilización y la reactivación un paso de separación que va ligado a pérdidas de rendimiento de producción.

Por último describe la WO 01/87925 un procedimiento de solubilización y replegamiento de una proteína insoluble donde la proteína insoluble es solubilizada tratándola con un agente desnaturalizante, un agente reductor y un agente bloqueador de cisteína y replegándola a continuación mediante la reducción de las concentraciones del agente desnaturalizante y del agente reductor. Un ejemplo que se ocupa del replegamiento y de la solubilización de G-CSF utiliza para la solubilización urea y cisteína o DTT (DTT = ditiotreitol) y para el replegamiento sulfato de cobre.

La finalidad de la presente invención es la de presentar un procedimiento de obtención de G-CSF humano biológicamente activo con el cual pueda obtenerse G-CSF con un alto nivel de pureza y de rendimiento mediante un procedimiento lo más sencillo posible, no debiendo tener lugar entre la solubilización y el replegamiento adicionales pasos de procesamiento, y en particular separación alguna del agente reductor, sino debiendo producirse el replegamiento mediante dilución del tampón de solubilización. Esta y otras finalidades son alcanzadas mediante el procedimiento que se indica en la reivindicación 1. Se describen en las reivindicaciones dependientes formas de realización preferidas.

La invención se refiere con ello a un procedimiento de obtención de G-CSF humano biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión, comprendiendo dicho procedimiento los pasos siguientes:

a) Solubilización del G-CSF contenido en los cuerpos de inclusión con un tampón de solubilización que contiene un agente desnaturalizante y glutationa reducida en cantidades equimolares;

b) Replegamiento del G-CSF mediante dilución de la preparación de solubilización con un tampón de replegamiento que contiene glutationa reducida y oxidada; y

c) Purificación del G-CSF replegado mediante al menos un paso de cromatografía.

Una ventaja de este procedimiento es la de que el agente reductor no es separado después de la solubilización, sino que permanece en la solución de proteína. Gracias al hecho de que se evita un costoso paso de separación, pueden limitarse las pérdidas de producción de la proteína recombinante. Esto se hace posible ante todo gracias al hecho de que tanto en el tampón de solubilización como en el tampón de replegamiento está contenida glutationa reducida.

En una forma de realización preferida, en cuanto al paso de cromatografía que es al menos uno se trata de una cromatografía de intercambio catiónico.

Con el procedimiento según la invención se obtiene un rendimiento de producción de G-CSF recombinante de un 25-35%, referido a la proteína total en el solubilizado determinada según el método de Bradford. Referido a la cantidad de met-G-CSF en el solubilizado...

1. Procedimiento de obtención de G-CSF humano biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión, comprendiendo dicho procedimiento los pasos siguientes:

a) Solubilización del G-CSF contenido en los cuerpos de inclusión con un tampón de solubilización que contiene un agente desnaturalizante y glutationa reducida;

b) Replegamiento del G-CSF mediante dilución de la preparación de solubilización con un tampón de replegamiento que contiene glutationa reducida y oxidada en cantidades equimolares; y

c) Purificación del G-CSF replegado mediante al menos un paso de cromatografía.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde el agente desnaturalizante es guanidina-HCl.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, donde la concentración de guanidina-HCl es de 4,0 a 8,0 moles/l.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde la concentración de glutationa reducida en el tampón de solubilización es de 10 a 200 mmoles/l.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde el tampón de solubilización contiene además un formador de quelatos.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde por gramo de cuerpos de inclusión se usan de 4 a 20 ml de tampón de solubilización.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde entre la solubilización y el replegamiento no se efectúa separación alguna del tampón de solubilización.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde el tampón de replegamiento contiene un aditivo seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de arginina, urea y guanidina-HCl en una concentración que promueve el replegamiento.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, donde el aditivo es urea.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 o 9, donde el tampón de replegamiento contiene urea en una concentración de 1,5 a 4,5 moles/l.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde la concentración de glutationa reducida y oxidada es respectivamente de 0,2 a 10 mmoles/l.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde la concentración de proteína que se aplica para el replegamiento es de menos de 2000 µg/ml.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde el replegamiento se produce a 4ºC por espacio de al menos tres horas.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde en cuanto al paso de cromatografía que es al menos uno se trata de una cromatografía de intercambio iónico.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, donde en cuanto a la cromatografía de intercambio iónico se trata de una cromatografía de intercambio catiónico.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, donde la preparación de plegamiento es acidificada antes de la cromatografía de intercambio catiónico.

17. Procedimiento según la reivindicación 15 o 16, donde la elución del G-CSF se efectúa a un valor pH de 4,0-6,0.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde después del replegamiento pero antes del paso de cromatografía que es al menos uno se efectúa una filtración en lecho profundo.