LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS PARA LA MANIPULACION DE DIFERENCIACION DE CELULAS QUE INCLUYE LA FUNCION DE CONTACTO CON UNA CELULA CON UNA CANTIDAD DE UNA PROTEINA TOPORITMICA O CON UN FRAGMENTO O DERIVADO DE UNA PRIMERA PROTEINA TOPORITMICA,

CUYO FRAGMENTO O DERIVADO SEA CAPAZ DE ENLACE CON UNA SEGUNDA PROTEINA TOPORITMICA O CON UNA CANTIDAD DE UN ANTICUERPO O FRAGMENTO DE LA MISMA QUE CONTIENE EL IDIOTIPO QUE SE ENLAZA CON UNA PROTEINA TOPORITMICA, SIENDO ESTA ULTIMA EFECTIVA PARA MANIPULAR LA DIFERENCIACION DE LA CELULA CONTACTADA

Métodos para la manipulación de la diferenciación celular.

1. Introducción

La presente invención se refiere a los genes humanos Notch y Delta y a sus productos codificados. La invención también se refiere a secuencias (denominadas de aquí en adelante "secuencias adhesivas") dentro de las proteínas codificadas por genes toporrítmicos que median en la unión homotípica o heterotípica a secuencias dentro de proteínas codificadas por genes toporrítmicos. Tales genes incluyen, pero no están limitados a Notch, Delta y Serrate.

2. Antecedentes de la invención

Los análisis genéticos en Drosophila han sido extremadamente útiles para identificar la complejidad de las rutas de desarrollo y los loci interactuantes. Sin embargo, entender la naturaleza precisa de los procesos que sostienen las interacciones genéticas, requiere un conocimiento de las propiedades bioquímicas de los productos proteicos de los genes en cuestión.

Las mutaciones completas en uno cualquiera de los loci neurógenos cigóticos -- Notch (N), Delta (D1), mastermind (mam), Enhancer of Split (E(spl)), neuralized (neu) y big brain (bib) -- dan como resultado una hipertrofia del sistema nervioso a expensas de las estructuras epidérmicas ventrales y laterales. Este efecto es debido a la desviación de la ruta de las células precursoras epidérmicas a una ruta neuronal, e implica que la función de los genes neurógenos es necesaria para diversificar células dentro de la región neurógena desde un destino neuronal a un destino epitelial. Estudios que determinaban los efectos de la ablación con láser de neuroblastos embrionarios específicos, en saltamontes (Doe y Goodman 1985, Dev. Biol. 111, 206-219) han mostrado que interacciones celulares entre neuroblastos y células accesorias circundantes, sirven para inhibir que estas células accesorias adopten un destino de neuroblasto. Estas observaciones genéticas y embriológicas han conducido ambas a la hipótesis de que los productos proteicos de los loci neurógenos funcionan como componentes de un mecanismo de interacción celular necesario para el correcto desarrollo epidérmico (Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4, 95-100).

Los análisis de secuencias (Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd y col., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108; Vassin y col., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) han mostrado que dos de los loci neurógenos, Notch y Delta, parecen codificar proteínas transmembranales que abarcan la membrana de una sola vez. El gen Notch codifica una proteína de ∼300 kd (empleamos "Notch" para denominar esta proteína) con un dominio extracelular N-terminal extenso, que incluye 36 repeticiones en tándem similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF), seguidas de otras tres repeticiones ricas en cisteína, denominadas repeticiones Notch/lin-12 (Wharton y col., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd y col., 1986, Mol. Cell Biol. 6, 3094-3108; Yochem y col., 1988, Nature 335, 547-550). Delta codifica una proteína de ∼100 kd (empleamos "Delta" para denominar DLZM, el producto proteico de los transcritos cigóticos y maternos predominantes; Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) que tiene nueve repeticiones similares a EGF en su dominio extracelular (Vassin y col., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski y col., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735). Aunque se conoce poco sobre la importancia funcional de estas repeticiones, el motivo similar a EGF se ha encontrado en una variedad de proteínas, incluyendo las implicadas en la cascada de la coagulación sanguínea (Furie y Furie, 1988, Cell 53, 505-518). En particular, este motivo se ha encontrado en proteínas extracelulares tales como los factores IX y X de la coagulación sanguínea (Rees y col., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Furie y Furie, 1988, Cell 53, 505-518), en otros genes de Drosophila (Knust y col., 1987, EMBO J. 761-766; Rothberg y col., 1988, Cell 55, 1047-1059), y en algunas proteínas receptoras de la superficie celular, tales como el receptor de la trombomodulina (Suzuki y col., 1987, EMBO J. 6, 1891-1897) y el receptor de LDL (Sudhof y col., 1985, Science 228, 815-822). Se ha cartografiado un sitio de unión de proteína para el dominio de las repeticiones EGF en la trombomodulina y la uroquinasa (Kurosawa y col., 1988, J. Biol. Chem. 263, 5993-5996; Appella y col., 1987, J. Biol. Chem. 262, 4437-4440).

Se ha sido descrito un conjunto intrigante de interacciones entre mutaciones de Notch y Delta (Vassin y col., 1985, J. Neurogenet. 2, 292-308; Shepard y col., 1989, Genetics 122, 429-438; Xu y col., 1990, Genes Dev., 4, 464-475). Numerosos estudios genéticos (resumidos en Alton y col., 1989, Dev. Genet. 10, 261-272) han indicado que las dosis génicas de Notch y Delta en relación la una con la otra, son cruciales para el desarrollo normal. Una reducción del 50% de la dosis de Delta en un fondo Notch de tipo silvestre, provoca una extensión de las venas de las alas creando un "delta" en la base (Lindsley y Grell, 1968, Publication Number 627, Washington, D.C., Carnegie Institute of Washington). Un fenotipo similar es causado por un incremento del 50% de la dosis de Notch en un fondo Delta de tipo silvestre (un fenotipo de "confluencia"; Welshons, 1965, Science, 150, 1122-1129). Este fenotipo Delta se suprime parcialmente mediante una reducción de la dosis de Notch. Un trabajo reciente en nuestros laboratorios, ha mostrado que interacciones letales entre alelos que se correlacionan con alteraciones en las repeticiones similares a EGF en Notch, se pueden recuperar reduciendo las dosis de Delta (Xu y col., 1990, Genes Dev. 4, 464-475). Xu y col., (1990, Genes Dev. 4, 464-475) encontraron que mutaciones completas en Delta o mam suprimen las interacciones letales entre combinaciones heterocigotas de ciertos alelos Notch, conocidas como las mutaciones Abruptex (Ax). Los alelos Ax están asociados con mutaciones sin sentido dentro de las repeticiones similares a EGF del dominio extracelular de Notch (Kelley y col., 1987, Cell 51, 539-548; Hartley y col., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417).

Notch se expresa en los procesos axonales durante el crecimiento de neuronas embrionarias (Johansen y col., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440; Kidd y col., 1989, Genes Dev. 3, 1113-1129).

Un estudio ha mostrado que ciertos alelos Ax de Notch pueden alterar gravemente los datos de la ruta axonal durante el crecimiento neuronal sensitivo en los discos imaginales, aunque no se conoce hasta la fecha si la expresión de Notch aberrante es la responsable de este defecto en el axón mismo o en el epitelio a lo largo del cual crece (Palka y col., 1990, Development 109, 167-175).

3. Sumario de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos de los genes Notch y Delta humanos, y a secuencias de aminoácidos de sus proteínas codificadas, así como a fragmentos de las mismas que contienen un determinante antigénico o que son funcionalmente activos. La invención también se refiere a fragmentos (denominados en esta memoria "fragmentos adhesivos"), y a sus secuencias, de las proteínas ("proteínas toporrítmicas") codificadas por genes toporrítmicos que median en la unión homotípica o heterotípica a proteínas toporrítmicas. Los genes toporrítmicos, tal y como se emplean en esta memoria, se refieren a los genes Notch, Delta y Serrate, así como a otros miembros de la familia Delta/Serrate que se pueden identificar, por ejemplo, mediante métodos descritos en la Sección 5.3, más abajo. También se describen análogos y derivados de los fragmentos adhesivos que conservan actividad de unión. Se describen adicionalmente anticuerpos para Notch humana y para fragmentos adhesivos.

En realizaciones específicas, el fragmento adhesivo de Notch es el fragmento que comprende la secuencia de Notch más homóloga a las repeticiones 11 y 12 similares a EGF de Notch de Drosophila; el fragmento adhesivo de Delta que media en la unión heterotípica, es el fragmento que comprende la secuencia más homóloga a los aminoácidos 1-230 de Delta de Drosophila; el fragmento adhesivo de Delta que media en la unión homotípica, es el fragmento que comprende la secuencia más homóloga a los aminoácidos...

1. Un método para la manipulación de la diferenciación de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con una proteína Notch humana, estando codificada dicha proteína Notch humana por un primer ácido nucleico que se puede obtener a partir de ADN humano o de ADNc y que se puede hibridar con un segundo ácido nucleico que consiste en la secuencia de Notch humana o su complemento, contenida en (a) el plásmido hN3k, tal y como se ha depositado en la ATCC y con el número de orden asignado 68609, o (b) el plásmido hN5k, tal y como se ha depositado en la ATCC y con el número de orden asignado 68611, proteína la cual es capaz de unirse a una proteína Delta o es capaz de unirse a un anticuerpo específico de la proteína Notch humana, con la condición de que los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia, no se reivindiquen.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína Notch humana comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 23 o la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 24.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína Notch humana comprende la secuencia de aminoácidos de Notch codificada por la secuencia de ADN humana de Notch contenida en el plásmido hN3k tal y como se ha depositado en la ATCC y con el número de orden asignado 68609; o codificada por la secuencia de ADN humana de Notch contenida en el plásmido hN5k tal y como se ha depositado en la ATCC y con el número de orden asignado 68611.

4. Un método para la manipulación de la diferenciación de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con una proteína que es un fragmento de una proteína Notch humana, proteína Notch humana la cual está codificada por un primer ácido nucleico que se puede obtener a partir de ADN humano o de ADNc y que se puede hibridar con un segundo ácido nucleico que consiste en la secuencia de Notch humana, o su complemento, contenida en (a) el plásmido hN3k tal y como se ha depositado en la ATCC y con el número de orden asignado 68609; o (b) el plásmido hN5k tal y como se ha depositado en la ATCC y con el número de orden asignado 68611, proteína la cual es capaz de unirse a una proteína Delta o es capaz de unirse a un anticuerpo específico de la proteína Notch humana, en donde el fragmento es capaz de unirse a una proteína Delta o es capaz de unirse a un anticuerpo específico de la proteína Notch humana, con la condición de que los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia, no se reivindiquen.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el fragmento de la proteína Notch humana comprende:

el dominio extracelular de la proteína;

el dominio intracelular de la proteína;

los dominios extracelular y transmembranal de la proteína;

la región que contiene las repeticiones cdc10 de la proteína;

las repeticiones homólogas al factor de crecimiento epidérmico (EGF) de la proteína; o

las repeticiones Notch/lin-12 de la proteína.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el fragmento de la proteína Notch humana consiste en:

el dominio extracelular de la proteína;

el dominio intracelular de la proteína;

los dominios extracelular y transmembranal de la proteína.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el fragmento comprende la porción de la proteína Notch humana con la mayor homología con las repeticiones similares a EGF 11 y 12 de la secuencia de Notch de Drosophila, descrita en la Figura 8 (SEQ ID NO: 1).

8. Un método para la manipulación de la diferenciación de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con una proteína quimérica que comprende una proteína Notch humana o un fragmento de la misma unido a una secuencia de una proteína heteróloga, proteína Notch humana la cual está codificada por un primer ácido nucleico que se puede obtener a partir de ADN humano o de ADNc y que se puede hibridar con un segundo ácido nucleico que consiste en la secuencia de Notch humana, o su complemento, contenido en (a) el plásmido hN3k tal y como se ha depositado en la ATCC y con el número de orden asignado 68609; o (b) el plásmido hN5k tal y como se ha depositado en la ATCC y con el número de orden asignado 68611, proteína la cual o su fragmento es capaz de unirse a una proteína Delta o es capaz de unirse a un anticuerpo específico de la proteína Notch humana, con la condición de que los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia, no se reivindiquen.

9. Un método para la manipulación de la diferenciación de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que contiene el idiotipo del anticuerpo, anticuerpo el cual se une a una proteína Notch humana o a un fragmento de la proteína Notch humana, proteína Notch humana la cual está codificada por un primer ácido nucleico que se puede obtener a partir de ADN humano o de ADNc y que se puede hibridar con un segundo ácido nucleico que consiste en la secuencia de Notch humana, o su complemento, contenida en (a) el plásmido hN3k tal y como se ha depositado en la ATCC y con el número de orden asignado 68609; o (b) el plásmido hN5k tal y como se ha depositado en la ATCC y con el número de orden asignado 68611, proteína Notch humana la cual o el fragmento de la proteína Notch humana es capaz de unirse a una proteína Delta o es capaz de unirse a un anticuerpo específico de la proteína Notch humana, con la condición de que los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia, no se reivindiquen.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo se une a la porción adhesiva de la proteína Notch humana.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo se une al dominio extracelular de la proteína Notch humana.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la proteína Notch humana está purificada.

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde el fragmento de la proteína Notch humana está purificado.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la proteína quimérica está purificada.