METODO PARA PURIFICAR FSH.

Un método para purificar la FSH humana recombinante o una variante de FSH que comprende las etapas de someter FSH a:

(1) cromatografía de intercambio iónico realizada con una resina de intercambio aniónico fuerte;

(2) cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados;

(2a) cromatografía de intercambio iónico realizada con una resina de intercambio aniónico débil; y

(3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)

Método para purificar FSH.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la purificación de proteínas, particularmente de la hormona estimuladora del folículo (FSH, por sus siglas en inglés "Follicle Stimulating Hormone").

Antecedentes de la invención

La hormona estimuladora del folículo (FSH) es una proteína inyectable que pertenece a la clase de gonadotrofinas. La FSH se usa en el tratamiento de la infertilidad y los trastornos reproductivos tanto en pacientes femeninos como en masculinos.

En la naturaleza, la FSH es producida por la glándula pituitaria. Para su uso farmacéutico, la FSH puede ser producida recombinantemente (rFSH), o puede ser aislada a partir de la orina en mujeres posmenopáusicas (uFSH).

La FSH se usa en pacientes femeninos en la inducción de la ovulación (OI) y en la hiperestimulación ovárica controlada (COH) para tecnologías de reproducción asistida (TRA). En un régimen de tratamiento típico para la inducción de la ovulación, a un paciente se le administra inyecciones diarias de FSH o una variante (aproximadamente de 75 a 300 UI FSH/día) durante un periodo de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12 días. En un régimen de tratamiento típico para la hiperestimulación ovárica controlada, a un paciente se le administra inyecciones diarias de FSH o una variante (aproximadamente 150-600 UI FSH/día) durante un periodo de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12 días.

La FSH también se usa para inducir la espermatogénesis en hombres que sufren de oligoespermia. Se ha logrado que un régimen que usa 150 UI de FSH 3 veces semanalmente en combinación con 2.500 UI de hCG dos veces semanalmente mejora el recuento del esperma en hombres que sufren de hipogonadismo hipogonadotrófico [Burgues et al.; "Subcutaneous self-administration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism". Grupo español de colaboración en hipogonadismo hipogonadotrófico en hombres; Hum. Reprod.; 1997, 12, 980-6].

A causa de la importancia de la FSH en el tratamiento de los trastornos de la fertilidad, la provisión de FSH de alta pureza y de alta actividad específica es deseable. El tratamiento con FSH requiere de inyecciones repetidas. Las preparaciones de FSH altamente purificadas pueden ser administradas subcutáneamente, permitiendo la autoadministración por el paciente, aumentándose así la comodidad del paciente y el cumplimiento terapéutico.

Lynch et al. "The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising hormone"; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19] describen un método para purificar la FSH de la glándula pituitaria humana. El método implica cromatografía de intercambio catiónico y aniónico y cromatografía de exclusión por tamaños. El método, según se piensa, causa que la FSH de la glándula pituitaria tenga una actividad específica de 4.990 UI (inmunoensayo)/mg, con 16 UI/mg de LH. El contenido de proteínas fue determinado por la absorción a 280 nm en peso seco o en solución (asumiendo que A²⁸⁰_{1 cm} para 1 g/l es igual a 1).

El documento WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA) describe un procedimiento para la purificación de la FSH humana urinaria que comienza con extractos urinarios llamados gonadotrofinas menopáusicas humanas (hMG). El procedimiento usa la cromatografía de intercambio iónico con resinas de intercambio aniónico débilmente básicas del tipo DEAE seguido de la cromatografía de afinidad en resinas que tienen un derivado de antraquinona como ligando. El procedimiento, según se piensa, proporciona FSH urinaria libre de LH y que tiene una actividad específica de 6.870 UI (inmunoensayo)/mg. El contenido de proteínas fue determinado asumiendo que una solución de agua de 1 mg/ml de proteína tiene una densidad óptica de 0,62 a 277 nm, en cubetas de cuarzo con una longitud de paso de 1 cm.

El documento WO 00/63248 (Instituto Massone SA) describe un procedimiento para la purificación de gonadotrofinas, incluyendo FSH, a partir de orina humana. El procedimiento implica las etapas siguientes: cromatografía de intercambio iónico con una resina fuertemente catiónica del tipo sulfopropilo, cromatografía de intercambio iónico con una resina fuertemente aniónica, y cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). Una preparación de FSH que tiene una actividad específica de 8.400 UI/mg (método de Steelman-Pohley: "Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophy"; Endocrinology; 1953, 53, 604-616) y menos de 1 UI de LH (método de ganancia de peso de la vesícula seminal en rata: Van Hell H, Matthijsen R & GA Overbeek; Acta Endocrinol, 1964, 47, 409) de actividad biológica por 75 UI de FSH, según se publica, es obtenida. El contenido de proteínas fue realizado por el método de Lowry [O. H. Lowry et al., J. Biol. Chem., 1951, 193, 265].

El documento de EE.UU. Nº. 5.990.288 (Musick et al.) describe un método para purificar FSH a partir de muestras biológicas, tales como glándula pituitaria humanas u orina posmenopáusica humana. El procedimiento usa la cromatografía de afinidad por ligación de tinte. El procedimiento, según se dice, da como resultado FSH de glándula pituitaria humana que tiene una actividad específica de 7.066 UI (inmunoensayo)/mg y menos de 1 UI (inmunoensayo)/mg de LH, y una FSH urinaria que tiene una actividad específica de 6.298 UI (inmunoensayo)/mg y menos de 3 UI (inmunoensayo)/mg de LH. El contenido de proteínas fue determinado por la absorción a 280 nm (asumiendo que una A²⁸⁰_{1 cm} para 1 g/l es igual a 1).

Chiba et al. [Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland; Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218] describen una técnica para purificar gonadotrofinas de glándula pituitaria canina, incluyendo FSH, usando cromatografía de afinidad de Concanavalina (Con) A, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados con Cu⁺⁺. La FSH resultante, según se publica, tiene una actividad específica de 2,17 UI/g proteína usando un ensayo radioreceptor para FSH que mide la actividad biológica y el kit de ensayo de proteína BioRad (Laboratorios BioRad CA EE.UU.) para determinar el contenido de proteínas.

El documento WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) describe un método para purificar FSH humana a partir de la orina. El procedimiento implica la inmunocromatografía con anticuerpos monoclonales inmovilizados FSH-específicos unidos a Sepharose 4B por divinil-sulfona, seguido de HPLC de fase inversa. La FSH resultante está libre de LH y otras proteínas urinarias y tiene una actividad específica de 6.200 UI/mg de polvo liofilizado (método de Steelman-Pohley). La preparación era la primera preparación de FSH que era adecuada para la administración subcutánea, debido a su pureza.

El documento EP 0475779 (Vittal Mallya Scientific Research Foundation) describe un procedimiento para la purificación de un polipéptido o una proteína que aprovecha las propiedades quelantes de la fosvitina en una cromatografía de iones metálicos.

Todavía son necesarios nuevos métodos para purificar FSH.

Sumario de la invención

Un objeto de la invención es proporcionar un nuevo método para purificar FSH recombinante o una variante de FSH.

En un primer aspecto, la invención proporciona un método para purificar FSH recombinante humana o una variante de FSH que comprende las etapas de someter FSH a:

(1) cromatografía de intercambio iónico realizada con una resina de intercambio aniónico fuerte;

(2) cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados;

(2a) cromatografía de intercambio iónico realizada usando una resina de intercambio aniónico débil; y

(3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un organigrama que muestra la purificación de rhFSH.

La figura 2 muestra el perfil de elución para la cromatografía de rhFSH cruda sobre Q Sepharose FF según se detecta por OD a 280 nm.

La figura 3 muestra el perfil de elución para la cromatografía IMAC de rhFSH parcialmente purificada según se detecta por OD a 280 nm.

La figura...

1. Un método para purificar la FSH humana recombinante o una variante de FSH que comprende las etapas de someter FSH a:

(1) cromatografía de intercambio iónico realizada con una resina de intercambio aniónico fuerte;

(2) cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados;

(2a) cromatografía de intercambio iónico realizada con una resina de intercambio aniónico débil; y

(3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).

2. El método de la reivindicación 1, en el que la resina de intercambio aniónico fuerte es Q Sepharose FF, o una resina que tenga propiedades similares.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la cromatografía de intercambio iónico (i) se realiza usando tampón borato como eluyente.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el tampón borato está a un pH de 8,5, o aproximadamente 8,5.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados se realiza con una resina que tiene grupos quelantes tridentados.

6. El método de la reivindicación 5, en el que los grupos quelantes son ácido iminodiacético.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados se realiza con Sepharose FF quelante, o una resina que tenga propiedades similares.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados se realiza con un ión metálico seleccionado de Cu²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ y Co²⁺.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados se realiza con Cu²⁺.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados se realiza usando acetato de amonio como eluyente.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el tampón acetato de amonio tiene un pH de 9, o aproximadamente 9.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la resina de intercambio aniónico débil es la resina DEAE Sepharose FF, o una resina que tenga propiedades similares.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) se realiza usando Fenil Sepharose FF HS, o una resina que tenga características similares.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la cromatografía de interacción hidrófoba se realiza usando acetato de amonio (50 mM)/sulfato de amonio (0,25 M) como eluyente.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además una etapa de cromatografía de fase inversa (4), realizada después de la etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC).

16. El método de la reivindicación 15, en el que la fase de cromatografía inversa se realiza usando Source 30 RPC como resina, o una resina que tenga características similares.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la cromatografía de fase inversa se realiza usando acetato de amonio 50 mM, pH a 7,6, o aproximadamente 7,6, con 2-propanol al 20% (v/v).

18. El método de la reivindicación 15, 16 ó 17, que comprende una etapa de ultrafiltración (5), realizada después de la etapa de cromatografía de fase inversa.

19. Un método para purificar FSH recombinante humana que comprende las etapas de someter FSH a: