LA PRESENTE PETICION SE REFIERE A UNOS ORGANISMOS RECOMBINADOS QUE TIENEN GENES QUE CODIFICAN PARA UNA ACTIVIDAD DE GLICEROL 3 - FOSFATO DESHIDROGENASA Y/O GLICEROL - 3 - FOSFATASA.

DICHOS ORGANISMOS SON UTILES PARA LA OBTENCION DE GLICEROL A PARTIR DE VARIOS SUBSTRATOS CARBONADOS

Método para la producción de glicerol por organismos recombinantes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y al uso de organismos recombinantes para la producción de compuestos deseados. Más específicamente, describe la expresión de genes clonados para glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) y glicerol-3-fosfatasa (G3P fosfatasa) para la producción reforzada de glicerol.

Antecedentes

El glicerol es un compuesto muy demandado por la industria para uso en cosméticos, jabones líquidos, alimentos, productos farmacéuticos, lubricantes, soluciones anti-congelantes, y en numerosas otras aplicaciones. Los ésteres de glicerol son importantes en la industria de las grasas y del aceite.

No todos los organismos tienen una capacidad natural de sintetizar glicerol. Sin embargo, la producción biológica de glicerol es conocida para algunas especies de bacterias, algas y levaduras. Las bacterias Bacillus licheniformis y Lactobacillus lycopersica sintetizan glicerol. La producción de glicerol se encuentra en las algas halotolerantes Dunaliella sp. y Asteromonas gracilis para la protección frente a concentraciones salinas externas elevadas (Ben-Amotz et al., (1982) Experientia 38:49-52). De manera similar, diversas levaduras osmotolerantes sintetizan glicerol como medida protectora. La mayoría de las cepas de Saccharomyces producen cierta cantidad de glicerol durante la fermentación alcohólica, y esto se puede incrementar fisiológicamente mediante la aplicación de estrés osmótico (Albertyn et al., (1994) Mol. Cell.Biol. 14, 4135-4144). En los primeros años de este siglo, el glicerol se produjo comercialmente con cultivos de Saccharomyces a los cuales se añadieron reactivos de dirección, tales como sulfitos o álcalis. Por medio de la formación de un complejo inactivo, los agentes de dirección bloquean o inhiben la conversión de acetaldehído a etanol; así, los equivalentes reductores (NADH) en exceso están disponibles o "se dirigen" hacia el dihidroxiacetona fosfato (DHAP) para la reducción para producir glicerol. Este método está limitado por la inhibición parcial del crecimiento de las levaduras debido a los sulfitos. Esta limitación se puede superar parcialmente mediante el uso de álcalis que crean equivalentes de NADH en exceso mediante un mecanismo diferente. En esta práctica, los álcalis inician una desproporción de Cannizzaro para producir etanol y ácido acético a partir de dos equivalentes de acetaldehído.

El gen que codifica glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (DAR1,GPD1) ha sido clonado y secuenciado a partir de Saccharomyces diastaticus (Wang et al., (1994), J. Bact. 176:7091-7095). El gen DAR1 se clonó en un vector lanzadera y se usó para transformar E. coli, en donde la expresión produjo la enzima activa. Wang et al., anteriormente mencionado, reconoce que DAR1 está regulado por el medio osmótico celular, pero no propone cómo se podría usar el gen para incrementar la producción de glicerol en un organismo recombinante.

Se han aislado otras enzimas de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa. Por ejemplo, sn-glicerol-3-fosfato deshidrogenasa ha sido clonada y secuenciada a partir de S. cerevisiae (Larason et al., (1993) Mol. Microbiol., 10:1101, (1993)). Albertyn et al., (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 4135) enseñan la clonación de GPD1 que codifica una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa de S. cerevisiae. Al igual que Wang et al., tanto Albertyn et al. como Larason et al. reconocen la osmo-sensibilidad de la regulación de este gen, pero no sugieren cómo se podría usar el gen en la producción de glicerol en un organismo recombinante.

Como con G3DPH, la glicerol-3-fosfatasa se ha aislado a partir de Saccharomyces cerevisiae, y se ha identificado que la proteína está codificada por los genes GPP1 y GPP2 (Norbeck et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:13875). Al igual que los genes que codifican G3DPH, parece que GPP2 está osmóticamente inducido.

No existe técnica conocida que enseñe que la producción de glicerol a partir de organismos recombinantes con G3PDH/G3P fosfatasa se exprese junto o por separado. Tampoco existe técnica conocida que enseñe que la producción de glicerol a partir de cualquier organismo de tipo salvaje con estas dos actividades de enzima no requiere aplicar un cierto estrés (una sal o un osmolito) a la célula. Eustace ((1987), Can. J. Microbiol., 33:112-117)) enseñan conseguir la producción de glicerol mediante técnicas de ADN recombinante. Por técnicas de cultivo selectivas, estos investigadores crearon una cepa de levadura hibridada que producía glicerol a niveles más altos que las cepas parentales; sin embargo, la actividad de G3PDH permanecía constante o era ligeramente más baja.

Nevoight et al. (Yeast 12:1331-1337, 1996) describe que la sobre-expresión de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa en Saccharomyces cerevisiae se puede combinar con un nivel incrementado de fosfatasas para la producción de glicerol.

Un microorganismo capaz de producir glicerol en condiciones fisiológicas es industrialmente deseable, en especial cuando el propio glicerol será utilizado como un sustrato in vivo como parte de una vía catabólica o biosintética más compleja que podría ser perturbada por el estrés osmótico o la adición de agentes de dirección.

Por lo tanto, el problema a resolver es cómo dirigir el flujo de carbono hacia la producción de glicerol mediante la adición o el refuerzo de determinadas actividades enzimáticas, en especial G3PDH y G3P fosfatasa que catalizan, respectivamente, la conversión de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) en glicerol-3-fosfato (G3P) y luego en glicerol. Este procedimiento no ha sido descrito previamente para un organismo recombinante y requería el aislamiento de genes que codifiquen las dos enzimas y su expresión subsiguiente. Una dificultad sorprendente y no anticipada con la que se topó era la toxicidad de G3P fosfatasa al hospedante que requería un control cuidadoso de sus niveles de expresión para evitar la inhibición del crecimiento.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para la producción de glicerol a partir de un organismo recombinante, que comprende:

(i) transformar una célula de E.coli con una casete de expresión, que comprende:

(a) un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y

(b) un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa;

(ii) cultivar la célula de E.coli de (i) en presencia de al menos una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y sustratos de un solo carbono, con lo que se produce glicerol; y

(iii) recuperar el glicerol. La glucosa es la fuente de carbono más preferida.

La invención proporciona, además, células hospedantes de E. coli transformadas, que comprenden:

(a) un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente; y

(b) un gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato fosfatasa.

Breve descripción de depósitos biológicos y listado de secuencias

La solicitante hizo los siguientes depósitos biológicos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del Proceso de Patentes:

"ATCC" se refiere al depositario internacional American Type Culture Collection situado en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 EE.UU. La denominación se refiere al número de registro del material depositado.

La solicitante ha proporcionado 23 secuencias en conformidad con las Normas para la Representación Estándar de Secuencias de Nucleótidos y Aminoácidos en Solicitudes de Patente (Anexos I y II a la Decisión del Presidente de la EPO, publicados en el Suplemento nº 2 a OJ EPO, 12/1992) y con 37 C.F.R. 1.821-1.825 y Apéndices A y B (Requisitos para Descripciones de Solicitud que Contienen Secuencias de Nucleótidos y/o Aminoácidos).

Descripción...

1. Un método para la producción de glicerol a partir de un microorganismo recombinante, que comprende:

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fuente de carbono es glucosa.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADH-dependiente o una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa NADPH-dependiente codifica la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO: 10.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el gen que codifica una enzima de glicerol-3-fosfato fosfatasa codifica la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO 13 o SEQ ID NO:14.

5. Una célula hospedadora transformada de E.coli, que comprende:

6. Una célula hospedadora de E. coli transformada de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el gen que codifica una enzima de glicerol-3-fosfato fosfatasa codifica la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO 13 o SEQ ID NO:14.