ESTA INVENCION SE REFIERE A ORGANISMOS RECOMBINADOS QUE TIENEN GENES QUE CODIFICAN PARA ACTIVIDADES DE GLICEROL - 3 - FOSFATO DESHIDROGENASA,

DE GLICEROL - 3 - FOSFATASA, DE GLICEROL DESHIDRATASA Y DE 1,3 - PROPANEDIOL OXIDOREDUCTASA. ESTOS ORGANISMOS SON UTILES PARA LA PRODUCCION DE 1,3 - PROPANEDIOL A PARTIR DE VARIOS SUBSTRATOS CARBONADOS

Método para la producción de 1,3-propanodiol mediante organismos recombinantes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y al uso de organismos recombinantes para la producción de compuestos deseados. Más específicamente, describe la expresión de genes clonados de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) y de glicerol-3-fosfatasa (G3P fosfatasa), glicerol deshidratasa (dhaB), y 1,3-propanodiol oxidorreductasa (dhaT) para la producción incrementada de 1,3-propanodiol.

Antecedentes

1,3-propanodiol es un monómero que tiene utilidad potencial en la producción de fibras de poliéster y en la preparación de poliuretanos y compuestos cíclicos.

Se conocen varias rutas químicas para el 1,3-propanodiol. Por ejemplo, el óxido de etileno puede convertirse en 1,3-propanodiol sobre un catalizador en presencia de fosfina, agua, monóxido de carbono, hidrógeno y un ácido, mediante hidratación catalítica en fase de solución de acroleína seguida de reducción, o a partir de hidrocarburos tales como glicerol, hecho reaccionar en presencia de monóxido de carbono e hidrógeno sobre catalizadores con átomos del grupo VIII de la tabla periódica. Aunque es posible generar 1,3-propanodiol por estos métodos, son costosos y generan corrientes residuales que contienen contaminantes medioambientales.

Se ha conocido desde hace más de un siglo que el 1,3-propanodiol puede producirse en la fermentación del glicerol. Se han descubierto cepas bacterianas capaces de producir 1,3-propanodiol, por ejemplo, en los grupos Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Ilyobacter, Klebsiella, Lactobacillus, y Pelobacter. En cada caso estudiado, el glicerol se convierte en 1,3-propanodiol en una secuencia de reacción enzimática catalizada en dos etapas. En la primera etapa, una deshidratasa cataliza la conversión de glicerol en 3-hidroxipropionaldehído (3-HP) y agua (Ecuación 1). En la segundo etapa, 3-HP es reducido a 1,3-propanodiol por una oxidorreductasa asociada a NAD⁺ (Ecuación 2).

El 1,3-propanodiol no se metaboliza posteriormente y, como resultado, se acumula a una concentración elevada en el medio. La reacción completa consume un equivalente reductor en forma de un cofactor, dinucleótido reducido de ß-nicotinamida adenina (NADH), que se oxida a dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD⁺).

La producción de 1,3-propanodiol a partir de glicerol se realiza generalmente en condiciones anaerobias utilizando glicerol como única fuente de carbono y en ausencia de otros aceptores exógenos reductores equivalentes. En estas condiciones, por ejemplo, en cepas de Citrobacter, Clostridium, y Klebsiella, opera una ruta paralela para el glicerol que en primer lugar implica la oxidación de glicerol a dihidroxiacetona (DHA) mediante una glicerol deshidrogenasa asociada a NAD⁺ (o NADP⁺) (Ecuación 3). El DHA, tras la fosforilación hasta dihidroxiacetona fosfato (DHAP) mediante una DHA quinasa (Ecuación 4), está disponible para la biosíntesis y para intervenir en la generación de ATP a través, por ejemplo, de la glucolisis.

A diferencia de la ruta del 1,3-propanodiol, esta ruta puede proporcionar carbono y energía a la célula y produce NADH en vez de consumirlo.

En Klebsiella pneumoniae y Citrobacter freundii, los genes que codifican las actividades funcionalmente relacionadas de la glicerol deshidratasa (dhaB), 1,3-propanodiol oxidorreductasa (dhaT), glicerol deshidrogenasa (dhaD), y dihidroxiacetona quinasa (dhaK) están incluidos en el regulón dha. Los regulones dha de Citrobacter y Klebsiella se han expresado en Escherichia coli y se ha demostrado que convierten el glicerol en 1,3-propanodiol.

Se conocen procedimientos biológicos para la preparación de glicerol. La gran mayoría de productores de glicerol son levaduras, pero se sabe también que ciertas bacterias, otros hongos y algas producen glicerol. Tanto las bacterias como las levaduras producen glicerol convirtiendo la glucosa u otros carbohidratos a través de la ruta de fructosa-1,6-bisfosfato en la glucolisis o mediante la ruta de Embden Meyerhof Parnas, mientras que determinadas algas convierten el dióxido de carbono disuelto o el bicarbonato en los cloroplastos en compuestos intermedios de 3 carbonos del ciclo de Calvin. En una serie de etapas, el compuesto intermedio de 3 carbonos, ácido fosfoglicérico, se convierte en gliceraldehído 3-fosfato que puede interconvertirse fácilmente en su isómero ceto, dihidroxiacetona fosfato y por último en glicerol.

De manera específica, las bacterias Bacillus licheniformis y Lactobacillus lycopersica sintetizan glicerol, y se halla la producción de glicerol en las algas halotolerantes Dunaliella sp. y Asteromonas gracilis para la protección contra concentraciones salinas externas elevadas (Ben-Amotz et al., Experientia 38, 49-52, (1982)). De manera similar, diversas levaduras osmotolerantes sintetizan glicerol como medida protectora. La mayoría de las cepas de Saccharomyces producen cierta cantidad de glicerol durante la fermentación alcohólica, y esto se puede incrementar fisiológicamente mediante la aplicación de estrés osmótico (Albertyn et al., Mol. Cell. Biol. 14, 4135-4144, (1994)). Anteriormente en este siglo, la producción comercial de glicerol se llevaba a cabo mediante el uso de cultivos de Saccharomyces en los que se añadían "reactivos de dirección" tales como sulfitos o álcalis. Por medio de la formación de un complejo inactivo, los agentes de dirección bloquean o inhiben la conversión de acetaldehído a etanol; así, los equivalentes reductores (NADH) en exceso están disponibles o "se dirigen" hacia el DHAP para la reducción para producir glicerol. Este método está limitado por la inhibición parcial del crecimiento de las levaduras debido a los sulfitos. Esta limitación se puede superar parcialmente mediante el uso de álcalis que crean equivalentes de NADH en exceso mediante un mecanismo diferente. En esta práctica, los álcalis inician una desproporción de Cannizzaro para producir etanol y ácido acético a partir de dos equivalentes de acetaldehído.

El gen que codifica la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (DAR1, GPD1) se ha clonado y secuenciado a partir de S. diastaticus (Wang et al., J. Bact. 176, 7091-7095, (1994)). El gen DAR1 se clonó en un vector transportador y se usó para transformar E. coli, en donde la expresión produjo la enzima activa. Wang et al. (anteriormente mencionado) reconoce que DAR1 está regulado por el medio osmótico celular, pero no propone cómo se podría usar el gen para incrementar la producción de 1,3-propanodiol en un organismo recombinante.

Se han aislado otras enzimas de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa: por ejemplo, la sn-glicerol-3-fosfato deshidrogenasa se ha clonado y secuenciado a partir de S. cerevisiae (Larason et al., Mol. Microbiol. 10, 1101, (1993)) y Albertyn et al., (Mol. Cell. Biol. 14, 4135, (1994)) enseña la clonación de GPD1 que codifica una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa de S. cerevisiae. Como Wang et al. (anteriormente mencionado), tanto Albertyn et al. como Larason et al. reconocen la osmo-sensibilidad de la regulación de este gen, pero no sugieren cómo se podría usar el gen en la producción de 1,3-propanodiol en un organismo recombinante.

Como con G3PDH, la glicerol-3-fosfatasa se ha aislado a partir de Saccharomyces cerevisiae, y se ha identificado que la proteína está codificada por los genes GPP1 y GPP2 (Norbeck et al., J. Biol. Chem. 271, 13875 (1996)). Al igual que los genes que codifican G3PDH, parece que GPP2 es osmosensible.

Aunque se conocen métodos biológicos tanto de producción de glicerol como de 1,3-propanodiol, no se ha demostrado nunca que el procedimiento completo pueda realizarse mediante un solo organismo recombinante.

Ni...

1. Un método para la producción de 1,3-propanodiol a partir de un organismo recombinante que comprende:

(i) transformar un organismo hospedador adecuado con uno o más casetes de transformación, cada uno de los cuales comprende al menos uno de

(a) un gen que codifica una actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa;

(b) un gen que codifica una actividad de glicerol-3-fosfatasa;

(c) genes que codifican una actividad de deshidratasa;

(d) un gen que codifica una actividad de 1,3-propanodiol oxidorreductasa,

en donde todos los genes (a)-(d) se introducen en el microorganismo hospedador;

(ii) cultivar el organismo hospedador transformado en condiciones adecuadas en presencia de al menos una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, o un sustrato de un carbono, por lo cual se produce 1,3-propanodiol; y

(iii) recuperar el 1,3-propanodiol.

2. El método de la Reivindicación 1, en el que el organismo hospedador adecuado se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos filamentos.

3. El método de la Reivindicación 2, en el que el organismo hospedador adecuado se selecciona del grupo de géneros que consiste en Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces y Pseudomonas.

4. El método de la Reivindicación 3, en el que el organismo hospedador adecuado se selecciona del grupo que consiste en E. coli, Klebsiella spp. y Saccharomyces spp.

5. El método de la Reivindicación 1, en el que el organismo hospedador transformado es Saccharomyces spp. transformado con un casete de transformación que comprende los genes dhaB1, dhaB2, dhaB3, y dhaT, en el que los genes se integran de manera estable en el genoma de Saccharomyces spp.

6. El método de la Reivindicación 1, en el que el organismo hospedador transformado es Klebsiella spp. transformado con un casete de transformación que comprende los genes glicerol-3-fosfato deshidrogenasa 1 (GPD1) y glicerol-3-fosfatasa 2 (GPP2).

7. El método de la Reivindicación 1, en el que la fuente de carbono es glucosa.

8. El método de la Reivindicación 1, en el que el gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa se selecciona del grupo que consiste en los genes que corresponden a las secuencias de aminoácidos proporcionadas en SEQ ID NO: 11, en SEQ ID NO: 12, y en SEQ ID NO: 13, y las secuencias de aminoácidos abarcan las sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran la función de la enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa.

9. El método de la Reivindicación 1, en el que el gen que codifica una enzima glicerol-3-fosfatasa se selecciona del grupo que consiste en los genes que corresponden a las secuencias de aminoácidos proporcionadas en SEQ ID NO: 33 y en SEQ ID NO: 17, y las secuencias de aminoácidos abarcan las sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran la función de la enzima glicerol-3-fosfatasa.

10. El método de la Reivindicación 1, en el que el gen que codifica una actividad de glicerol-3-fosfatasa es una enzima glicerol quinasa que corresponde a la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO: 18, y la secuencia de aminoácidos abarca las sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran la función de la enzima glicerol quinasa.

11. El método de la Reivindicación 1, en el que los genes que codifican una enzima deshidratasa comprenden dhaB1, dhaB2 y dhB3, y los genes corresponden respectivamente a las secuencias de aminoácidos proporcionadas en SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, y SEQ ID NO:36, y las secuencias de aminoácidos abarcan las sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran la función de la enzima deshidratasa.

12. El método de la Reivindicación 1, en el que el gen que codifica una enzima 1,3-propanodiol oxidorreductasa corresponde a una secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:37, y la secuencia de aminoácidos abarca las sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran la función de la enzima 1,3-propanodiol oxidorreductasa.

13. Una célula hospedadora transformada que comprende:

(1) un gen heterólogo que codifica una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa que corresponde a la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:11;

(2) un gen heterólogo que codifica una enzima glicerol-3-fosfatasa que corresponde a la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:17;

(3) un gen heterólogo que codifica la subunidad a de la enzima glicerol deshidratasa que corresponde a la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:34;

(4) un gen heterólogo que codifica la subunidad ß de la enzima glicerol deshidratasa que corresponde a la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:35;

(5) un gen heterólogo que codifica la subunidad ? de la enzima glicerol deshidratasa que corresponde a la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:36; y

(6) un gen heterólogo que codifica la enzima 1,3-propanodiol oxidorreductasa que corresponde a la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO:37,

las secuencias de aminoácidos respectivas de (1)-(6) abarcan las sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran la función de las enzimas de los genes (1)-(6),

por lo que la célula hospedadora transformada produce 1,3-propanodiol con al menos un sustrato seleccionado del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, y polisacáridos, o a partir de un sustrato de un carbono.