Método de obtención de anticuerpos anti-hHDC y aplicaciones de los mismos.

La presente invención proporciona un método para la obtención de anticuerpos, mono y/o policlonales, que interaccionan frente a la histidina descarboxilasa humana (hHDC), así como los polinucleótidos y polipéptidos necesarios para llevarlo a cabo. Del mismo modo, los usos de los mencionados anticuerpos, así como los kits de diagnóstico de los que formen parte también son objeto de la presente invención

Método de obtención de anticuerpos anti-hHDC y aplicaciones de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención proporciona un método para la obtención de anticuerpos específicos frente a la histidina descarboxilasa humana (hHDC), así como los polinucleótidos y polipéptidos necesarios para llevarlo a cabo. Del mismo modo, los usos de los mencionados anticuerpos, así como los kits de diagnostico de los que formen parte también son objeto de la presente invención.

Estado de la técnica

En las células de mamíferos, la forma activa de la histidina descarboxilasa (HDC) (E.C. 4.1.1.22, según la clasificación de la Unión Internacional de Bioquímica) es una proteína homodimérica de aproximadamente 110 kDa, muy minoritaria (menos de 0.001% del contenido proteico celular), cuya actividad depende de piridoxalfosfato o PLP. La HDC cataliza el paso de L-histidina a histamina mediante la descarboxilación de la primera, y se expresa con actividad apreciable en un reducido grupo de tipos celulares: algunas células del sistema nervioso central y periférico, algunos leucocitos - basófilos, mastocitos, macrófagos -, epitelios digestivos, y algunos tipos de neuronas y células cancerosas desdiferenciadas.

Estudios recientes con ratones que tienen anulada la expresión de la histidina descarboxilasa (ratones knock-out)(Hiroshi Ohtsu et al. 2003, Biochemical and Biophysical Research Communications 305 (2003) 443-447 New functions of histamine found in histidine decarboxylase) indican que la histamina está implicada en procesos tales como la maduración de los mastocitos, la reabsorción de la médula ósea, la transmisión sinóptica de los tipos neuronales, y la progresión e invasión de tejidos cancerosos (Schneider et al (2002) Trends Immunol. 23: 255-263; Ohtsu & Watanebe (2002) Biochem. Biophys. Res. Comun. 305: 443-447; Fitzpartick et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6027-6032). La HDC está, por lo tanto, implicada en multitud de procesos inflamatorios, cancerosos y en diversas neuropatías.

Es bien sabido que la HDC, especialmente la HDC humana (hHDC), muestra una gran inestabilidad tanto in vivo como en extractos libres de células, lo cual dificulta considerablemente su purificación y caracterización. Hasta el momento, la única posibilidad que existe para caracterizar estructuralmente la enzima se basa en generar modelos tridimensionales mediante aproximaciones bioinformáticas (Moya-García et al. BioEssays (2005) 27: 57-63). La proteína nativa no se obtuvo a partir de tejidos de mamíferos hasta 1984, (Taguchi et al. (1984) J. Biochem, 259: 5214-5221), cuando se purificó parcialmente tras ocho pasos de purificación obteniéndose un total de 940 microgramos de HDC a partir de 400 g de hígado fetal de rata.

Años mas tarde, Ohmori y colaboradores (Ohmori et al. (1990) J. Biochem. 107: 834-839) purificaron a homogeneidad la enzima HDC de ratón a partir de 9 x 10¹⁰ células mastocíticas de ratón P-815 recogidas del líquido ascítico de 250 ratones previamente inoculados con 4,5 millones de células/ratón. En este caso, y tras nueve pasos de purificación, sólo se obtuvieron 15 microgramos de HDC.

En 1991, Zahnow y colaboradores (Zahnow et al. (1991) DNA Seq. 1: 395-400) obtuvieron la secuencia del mensajero de la hHDC, y en 1994, Yatsunami y colaboradores (Yatsunami et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 1554-1559) aislaron 24 Kb del gen humano localizado en el cromosoma 15.

En mamíferos, los cDNAs aislados que codifican para HDC dan lugar a un péptido primario de entre 74 y 77 KDa muy inestable, que esta presente en un porcentaje muy minoritario en las células productoras de histamina. Este péptido primario sufre un proceso de proteólisis parcial, a partir del cual se genera el monómero nativo de HDC de 53-57 KDa que forma parte de la proteína activa. Péptidos de menor tamaño que suelen detectarse en extractos de células de mamíferos, son productos de la digestión de la enzima activa que posee una vida media muy corta (2-4 horas) y es sustrato de distintos sistemas proteolíticos (Moya-García et al. (2005) BioEssays 27: 57-63).

Se sabe que el producto primario de la traducción de la HDC no es activo, ya que el extremo carboxilo impide la recepción del sustrato, por lo que la enzima debe perder, al menos, 5-10 KDa de su extremo carboxilo para poder ser activa. Con versiones recombinantes del enzima purificada, la máxima actividad se obtiene con HDC de mamíferos que conservan su secuencia primaria desde el residuo 69 al 515, y poseen un peso molecular aproximado de 50 KDa (Engel et al. (1996) Biochem. J. 320: 365-368; Olmo et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267: 1527-1531; Fleming et al. (2004) Biochem. J. 381: 769-778).

A los inconvenientes derivados de las propiedades bioquímicas de HDC (inestabilidad, adhesión, etc.) hay que añadir que las células que expresan la enzima se encuentran generalmente dispersas y en minoría entre otros tipos celulares productores de histamina (médula ósea, sangre, epitelios, estómago, cerebro). En el caso de la hHDC, se suman las dificultades de accesibilidad a tejidos frescos, por lo que la obtención de anticuerpos frente a dicha enzima se convierte en una empresa extremadamente ardua.

En la solicitud de patente española ES 2 135 350 se desarrolla un método para obtener anticuerpos anti-HDC frente a proteínas recombinantes, que reconocen la HDC de ratón pero no lo hacen con la versión humana de la enzima.

La solicitud de PCT de número de publicación WO-98/30593, detalla la obtención de anticuerpos policlonales específicos contra hHDC que han sido utilizados en el desarrollo de ensayo de detección de cáncer; dicha publicación, detalla un método para obtener anticuerpos que reaccionan frente a regiones de hHDC distintas a las que son reconocidas por los anticuerpos cuya obtención describe la presente solicitud.

Por último, cabe mencionar que en 1995 Kimio Yatsunami y colaboradores (Yatsunami et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 (51): 30813-30817) desarrollaron anticuerpos monoclonales (AcM) frente a hHDC usando como inmunógeno un péptido conservado en las secuencias de HDC de humano (residuos 218-232), ratón (residuos 225-239), y rata (residuos 221-235). Dicho AcM sólo reconocía HDC en estado desnaturalizado.

Los anticuerpos anti-HDC comerciales, en general, sólo detectan HDC de rata (ES 2 135 350, Dartsch et al. (1999) Histochem J. 31: 507-14), y si reconocen a la hHDC, lo hacen en su estado desnaturalizado. Por estas razones, es imprescindible poseer AcM que reconozcan a la hHDC en su conformación activa para estudiar al enzima y analizar su participación en procesos patológicos en los que pudiera estar implicada, tales como degeneraciones neurológicas (esquizofrenia, trastornos de la memoria, etc.), procesos alérgicos, degeneración de epitelios digestivos (ulcera gástrica, síndrome de Crohn, etc), algunos tipos de cáncer (cáncer de colon, leucemias blastocíticas y mastocítica), etc.

Descripción de la invención

Anticuerpo: a lo largo de la descripción, este término hará referencia tanto a anticuerpos monoclonales como policlonales.

Fragmentos del polinucleótido: a lo largo de la descripción, este término hará referencia todos aquellos fragmentos de SEQ ID 1 capaces de codificar para un polipéptido para la generación de anticuerpos específicos frente a hHDC.

Fragmentos del polipéptido: a lo largo de la descripción este término, hará referencia todos aquellos fragmentos de SEQ ID 2 capaces de producir anticuerpos específicos frente a hHDC.

Fragmentos de anticuerpos: a lo largo de la descripción, este término hará referencia a todos aquellos fragmentos de anticuerpos capaces interaccionar frente a SEQ ID 2 y fragmentos de la misma, donde dichos fragmentos comprenden las regiones variables Vh y/o Vl.

Como se ha indicado anteriormente, la secuencia de hHDC se conoce desde hace una década, y como resultado de los estudios realizados para llevar a cabo la presente invención, se han podido deducir fragmentos polipeptídicos que ha de conservar la enzima para mantener su actividad; este hecho ha permitido realizar análisis bioinformáticos de comparación entre las secuencias codificantes de HDC de rata y humana, y predecir qué epítopos de la proteína activa poseían mayor potencial inmunogénico para desarrollar anticuerpos frente a hHDC. A partir de este estudio se eligió...

1. Polinucleótido, capaz de codificar un polinpéptido capaz de generar de anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a hHDC, cuya secuencia es elegida del grupo:

2. Polipéptido, según la reivindicación 1, capaz de generar anticuerpos específicos frente a hHDC y cuya secuencia es elegida del grupo:

3. Anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a hHDC, en donde dichos anticuerpos interaccionan específicamente frente cualquiera de los polipéptidos de la reivindicación 2.

4. Uso de cualquiera de los polipéptidos según la reivindicación 2 para la generación de anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a hHDC.

5. Uso según la reivindicación 4 en donde los anticuerpos o fragmentos de los mismos son obtenidos por técnicas de generación de hibridomas.

6. Uso según la reivindicación 4 en donde los anticuerpos o fragmentos de los mismos son obtenidos por la tecnología de "phage display".

7. Uso según la reivindicación 4 en donde los anticuerpos o fragmentos de los mismos son obtenidos por inmunización de mamíferos no humanos.

8. Uso de los anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 3, para la elaboración de un medicamento.

9. Uso de los anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 3, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la degeneración neurológica.

10. Uso de los anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 3, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la anafilaxis y/o procesos alérgicos.

11. Uso de los anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 3, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento la degeneración de epitelios digestivos.

12. Uso de los anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 3, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer.

13. Uso de los anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 3, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de procesos infecciosos.

14. Uso de los anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 3 para el diagnóstico in vitro de enfermedades.

15. Kit de diagnóstico que comprende la utilización de anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 3.