METODO DE DIAGNOSTICO MOLECULAR Y TRATAMIENTO DE LA DEMENCIA CON CUERPOS DE LEWY.

Método de diagnóstico in vitro para la demencia de cuerpos de Lewy (DLB) en pacientes con sospecha clínica de inicio de demencia,

caracterizado porque comprende analizar una muestra obtenida de un paciente para determinar el nivel de expresión del gen Ubiquitina C-terminal hidrolasa L-1 (UCHL-1), donde los niveles de expresión reducidos de UCH-L1 en comparación con controles es diagnóstico de DLB

Método de diagnostico molecular y tratamiento de la demencia con cuerpos de Lewy.

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico molecular y de tratamiento de la enfermedad conocida como demencia de cuerpos de Lewy, tanto en su forma pura como en su forma común, que puede ser utilizado como criterio de diagnóstico de dichas demencias así como en la prevención y tratamiento de las mismas.

Antecedentes de la invención

En las sociedades desarrolladas el envejecimiento de la población está produciendo un incremento del número de pacientes afectados de demencia. La mayoría de estos individuos padecerán la más común de entre ellas: la enfermedad de Alzheimer (AD); pero existen toda una gama de demencias de orígenes muy diversos. Entre ellas destaca por su frecuencia la demencia con cuerpos de Lewy (DLB). La DLB designa un síndrome clínico-patológico de demencia asociado con la presencia cortical y subcortical de cuerpos de Lewy en diferentes grados, entre ellos podemos mencionar enfermedad por cuerpos de Lewy difusos, demencia senil tipo cuerpos de Lewy y también variante con cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer. La clasificación clínico-patológica de esta disfunción, a la que se ha dado en llamar demencia con cuerpos de Lewy (DLB) (McKeith IG, Galasko D, Kosaka K, et al. Consensus guidelines for the clinical and pathological diagnosis of Dementia with Lewy bodies (DLB): report on the Consortium on DLB International Workshop.Neurology 1996; 47: 1113-24.2000; 54: 1050-8) recoge también algunos rasgos que son comunes con las características de la AD y de la enfermedad de Parkinson (PD). En su conjunto, los datos clínicos de la enfermedad pueden sugerir el diagnóstico de enfermedad de cuerpo de Lewy difusa, si bien no existen pruebas diagnósticas definitivas para tal diagnóstico. EI examen neuropatológico es actualmente la única forma de diagnóstico al demostrar las alteraciones patognomónicas por sus características, localización y distribución propias de la enfermedad.

Los criterios neurológicos de diagnóstico atienden a los síntomas o signos nucleares. Así, en la valoración de la Demencia con Cuerpos de Lewy se consideran deficiencias atencionales, ejecutivas y visuoespaciales frecuentemente más severas; memoria a corto plazo relativamente mejor que en AD. En la valoración de Cognición fluctuante se evalúa un curso temporal variable de niveles alterados de atención y conciencia y el hecho de no observase el síndrome crepuscular. Otro síntoma clave es la presencia de alucinaciones visuales. Típicamente estas incluyen sujetos animados con un grado variable de penetración. En DLB, los signos extrapiramidales espontáneos son: rigidez, bradiquinesia y anormalidad en la marcha; el temblor en reposo es infrecuente. La presencia de fluctuaciones clínicas de un día a otro o de una semana a otra, especialmente al inicio, son aspectos que apoyan el diagnóstico de DLB. Un aspecto que podría mejorar la sensibilidad diagnóstica es la determinación de criterios para definir el umbral y la escala de los rasgos nucleares de los signos motores extra-piramidales y de las alucinaciones visuales. Otra limitación de los criterios actuales es el hecho de que las características sugestivas para el diagnóstico no se incluyen explícitamente en el algoritmo utilizado para determinar la naturaleza posible o probable de la DLB. Para conseguir una mayor precisión en el diagnóstico de la DLB, sería necesario acometer investigaciones sobre la utilidad de los rasgos sugestivos para el diagnóstico diferencial y la posible contribución de los trastornos del sueño (Kaufer DI. Dementia and Lewy bodies Rev Neurol. 2003 Jul 16-31;37(2):127-30. Review.).

Desde el punto de vista histopatológico, los signos diferenciales para un diagnóstico de DLB es la presencia de cuerpos de Lewy en el cortex y el tronco del encéfalo, aunque en ocasiones se detectan presencia de neuritas de Lewy, placas seniles corticales, signos de taupatía o cambios espongiformes (K.A. Jellinger, Morphological substrates of mental dysfunction in Lewy body disease. An update. J Neurol Transm Suppl 59 (2000), pp. 185-21). Como se ha mencionado, las características de las lesiones (cuerpos y neuritas de Lewy), su localización (en neuronas procesos neuronales) y su distribución (difusa en el tranco del encéfalo, amígdala, núcleo basal de Meynert y corteza cerebral) son específicos de la enfermedad.

Pirim et al. (1998) Int. J. Neuro. Res. 95:33-42 muestra que los anticuerpos contra la hidrolasa de ubiquitina carboxiterminal muestra reactividad con cuerpos de Lewy cortical junto con las neuronas y las neuritas bulbosas de cerebros con la enfermedad de Alzheimer y con la enfermedad de cuerpos de Lewy.

Lowe et al. (1990) J. Path. 161:153-60 demostró que la hidrolasa de ubiquitina c-terminal puede ser detectada en distintas formas de cuerpos de inclusión, incluyendo los cuerpos de Lewy corticales.

Nishikawa et al. (2003) Biochem. Biophys Res. Comm. 304:176-83 examina la cinética de las enzimas salvajes y las variantes I93M y S18Y de UCH-L1 con la finalidad de intentar descifrar una potencial relación junto con la enfermedad de Parkinson.

Un estudio reciente señala una incidencia clínica de DLB de 26/100.000 casos anuales, con una tasa máxima para el intervalo de edad 80-84 años de 68,6/100.000 casos anuales. Esto implica una tasa menor frente a la AD, que en un trabajo previo fue de 93/100.000 casos anuales pero mayor que la demencia fronto-temporal (FTD), que se estimó en 14/100.000 casos anuales. El mismo estudio detecta una predominancia masculina de la DLB descrita en la literatura, con un porcentaje de varones con DLB respecto a AD que fue de 63,2% frente a 23,1%. En este estudio deben considerarse diversas limitaciones metodológicas ya que se trata de un estudio con una muestra hospitalaria de pacientes no representativos de la población general. Además, debe tenerse en cuenta que la sensibilidad insuficiente de los criterios clínicos actuales puede producir la infraestimación de las tasas reales, lo cual hace suponer que la incidencia en la población general es ligeramente superior. (S. López-Pousa, J. Garre-Olmo, A. Turon-Estrada, E. Gelada-Batlle, M. Lozano-Gallego, M. Hernández-Ferrándiz, V. Morante- Munoz, J. Peralta-Rodríguez, M.M. Cruz-Reina Incidencia clínica de la demencia por cuerpos de Lewy. REV NEUROL 2003; 36 (8): 715-720).

La etiología de la enfermedad es desconocida y los mecanismos moleculares de su progresión también. No obstante, la característica histopatológica fundamental de esta enfermedad, la acumulación de cuerpos de Lewy han empezado por aportar algunas de las primeras pistas o indicaciones. Los cuerpos de Lewy son depósitos proteicos compuestos básicamente de depósitos proteicos insolubles cuyos componentes principales son la a-sinucleina, la ubiquitina y la presencia de proteínas ubiquitinadas. Todos ellos son componentes de un sistema subcelular llamado Sistema UPS (Ubiquitina-proteasoma) que es responsable de la degradación fisiológica de proteínas citoplasmáticas que son defectuosas o se encuentran en exceso (Herschko A, Ciechanover A (1998) The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67: 425-479). El malfuncionamiento de este sistema ha sido asociado como una de las causas implicadas en el origen o desarrollo de ciertas enfermedades neuro-degenerativas como AD, PD, la enfermedad de Huntington (HD) o la esclerosis amiotrófica lateral (ALS) (Petrucelli L & Dawson TM. Mechanism of neurodegenerative disease: role of the ubiquitin proteasome system. Ann Med. 2004;36(4):315-20). (Tran PB, Miller RJ. Aggregates in neurodegenerative disease: crowds and power? Trends Neurosci. 1999 May;22(5): 194-7).

WO 9950300 A1 describe un método de diagnóstico de sinucleopatías en pacientes, que comprende detectar sinucleínas seleccionadas en una muestra biológica obtenida de un paciente. También describe un método para el tratamiento de sinucleopátías en pacientes que sufren desórdenes neurodegenerativos, que comprende modular la producción de seleccionadas y/o la formación de inclusiones filamentosas intracitoplasmáticas glioales y neuronales de sinucleínas seleccionadas en estos pacientes.

Uno de los elementos de este Sistema UPS (Ubiquitina-proteasoma) responsable de la degradación fisiológica de proteínas citoplasmáticas que son defectuosas es la UCHL-1 (Ubiquitina C-terminal hidrolasa -1), una tiol-proteasa responsable de hidrolizar los enlaces peptídicos de los complejos proteicos unidos a la glicina carboxiterminal de la ubiquitina que conllevan a la destrucción regulada de proteínas sobrantes en el citoplasma...

1. Método de diagnóstico in vitro para la demencia de cuerpos de Lewy (DLB) en pacientes con sospecha clínica de inicio de demencia, caracterizado porque comprende analizar una muestra obtenida de un paciente para determinar el nivel de expresión del gen Ubiquitina C-terminal hidrolasa L-1 (UCHL-1), donde los niveles de expresión reducidos de UCH-L1 en comparación con controles es diagnóstico de DLB.

2. El método de diagnóstico in vitro según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra a analizar es ARN o proteína.

3. El método de diagnóstico in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la muestra analizada y cuantificada es la proteína codificada por el gen UCH-L1.

4. El método de diagnóstico in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la muestra es aislada de células de tejido nervioso obtenidas por biopsia o cualquier otro método de extracción.

5. El método de diagnóstico in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la muestra es aislada de células neuroendocrinas periféricas obtenidas por biopsia o cualquier otro método de extracción.

6. El método de diagnóstico in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la muestra es aislada a partir de fluidos biológicos como líquido cefalorraquídeo, suero u orina.

7. El método de diagnóstico in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se realiza una detección mediante una amplificación por PCR, SDA o cualquier otro método de amplificación de cDNA que permita una estimación cuantitativa de los niveles de transcripto de UCH-L1.

8. El método de diagnóstico in vitro según cualquiera de las reivindicación 1 a 6, caracterizado porque se lleva a cabo una detección por biochips de DNA realizados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo.

9. El método de diagnóstico in vitro según cualquiera de las reivindicación 1 a 6, caracterizado porque se lleva a cabo una detección por biochips de DNA realizados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo.

10. El método de diagnóstico in vitro según cualquiera de las reivindicación 1 a 6, caracterizado porque se lleva a cabo una detección por análisis de cantidad de proteína presente realizado mediante Western-blot, análisis mediante "protein-chip" utilizando anticuerpos específicos contra UCH-L1 o mediante perfiles proteicos realizados por espectrometría de masas o por cualquier otro mecanismo que permita una estimación cuantitativa de los niveles de proteína UCH-L1.

11. Vector de expresión que comprende un gen que codifica la forma S18Y de UCH-L1 para el uso en detener o revertir la progresión de demencia de cuerpos de Lewy que producen un incremento de los niveles de la enzima UCH-L1.

12. Método de análisis de compuestos para identificar agentes terapéuticos basados en su aptitud para incrementar los niveles de UCH-L1 para detener o revertir la progresión de demencia de cuerpos de Lewy.

13. El método de la reivindicación 12, donde los compuestos son promotores específicos de la transcripción del gen de UCH-L1.