CON EL OBJETIVO DE MEJORAR LA PRECISION Y REPRODUCTIBILIDAD DE LA MEDIDA DE GLUCANO-{BE} MEDIANTE UN METODO DE INYECCION DE CORRIENTE QUE UTILIZA UN CALCOFLUOR,

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN METODO EN EL QUE SE COLOCA, ENTRE EL PUERTO DE INYECCION DE LA MUESTRA Y EL DETECTOR DE ESTE SISTEMA, UNA COLUMNA DE FILTRADO DE UN GEL QUE TIENE UN VOLUMEN DE INTERSTICIO EXTERIOR DE LAS PARTICULAS DEL GEL QUE NO SUPERA EL DE VOLUMEN DE LOS EFLUENTES DE LA COLUMNA EN UN CIERTO PERIODO DE TIEMPO, Y UN VOLUMEN DEL CONTENIDO DE LA COLUMNA EL CUAL ES 10 VECES O MAS EL TAMAÑO DEL VOLUMEN DE LA INYECCION DE LA MUESTRA

Método de determinación de ß-(D)-glucano.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un método para medir ß-(1,3)(1,4)-D-glucano (a continuación en el presente documento denominado ß-glucano) y, más precisamente, a un método para medir el ß-glucano que está en diversos cereales tales como cebada, etc., y en malta, mosto, cerveza, etc.

Antecedentes de la técnica

El calcoflúor, que se representa mediante la siguiente fórmula estructural, es un compuesto fluorescente que se une específicamente a ß-glucano para tener un mayor grado de intensidad de fluorescencia debido a la unión. Jørgensen et al. de Carlsberg Co. en Dinamarca han notificado un método de inyección en flujo usando este compuesto (Carlsberg Res. Commun., vol. 53, págs. 277-285, 1998; Analytica-EBC, 3.11.2).

Algunos otros investigadores también han notificado un método de inyección en flujo que usa calcoflúor basándose en el mismo principio (Journal of the Institute of Brewing, vol. 95, pág. 327, 1989; Journal of the Institute of Brewing, vol. 93, pág. 396, 1987). Recientemente, Tecator Co. en Suecia y Fiatron Co. en EE.UU han comercializado un sistema de inyección en flujo comercial que usa calcoflúor (Journal of American Society of Brewing Chemists, vol. 93, pág. 396, 1987).

Éstos son todos sistemas aplicados a partir del sistema mostrado en la figura 1 o la figura 2, en el que un flujo de una muestra o una disolución que contiene una muestra se mezcla con un flujo de una disolución de reactivo preparada disolviendo 8~35 mg/litro de calcoflúor en un tampón de tris o glicina (pH de 8 a 10) mediante el cual el calcoflúor se une al ß-glucano en la muestra, usando un tubo adecuado, y el aumento en la intensidad de fluorescencia del compuesto así unido se mide usando un detector de fluorescencia.

Para determinar el contenido en ß-glucano en la muestra tal como mosto, cerveza, etc. mediante estos métodos, se usa como patrón una disolución que contiene una concentración conocida de ß-glucano purificado extraído de cebada.

Sin embargo, se notificó que tales métodos de inyección en flujo convencionales que usan calcoflúor implican fluctuación de los valores medidos debido a los efectos de los azúcares en el mosto de muestra o del etanol en la cerveza, que también varían dependiendo de las condiciones de medición tales como volumen de inyección de muestra y volumen vacío de la zona de mezclado, dando como resultado una variación en el contenido en ß-glucano incluso en una muestra idéntica.

Además, recientemente se encontró que los componentes de menor peso molecular (sacáridos, etanol, etc.), que tienen un efecto inhibidor sobre la reacción de fluorescencia del calcoflúor, están presentes en el mosto o la cerveza, y se encontró que los contenidos de tales componentes en el mosto o la cerveza varían dependiendo de la especie y la cantidad de las maltas empleadas.

Es obvio que las sustancias mencionadas anteriormente, que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor tales como sacáridos, etanol, etc., provocan errores en la medición del contenido en ß-glucano en el mosto o la cerveza, mediante los métodos de inyección en flujo convencionales que usan calcoflúor.

Por consiguiente, es esencial establecer un sistema que no pueda verse afectado por sacáridos, etanol y sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor en una muestra que va a medirse con el fin de mejorar la precisión de la medición de ß-glucano, y se desea que se desarrolle tal sistema.

Por tanto, un objetivo de la presente invención es mejorar la precisión y reproducibilidad de la medición de ß-glucano mediante los métodos de inyección en flujo que usan calcoflúor, por medio del establecimiento del sistema y la condición de medición en los que se emplea una columna de filtración en gel corta, para permitir que el ß-glucano de alto peso molecular que tiene un peso molecular de 10.000 o superior, se haga pasar a través sin que se retenga en el soporte de columna, mientras que los sacáridos de bajo peso molecular, el etanol y las sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor, se retienen por las partículas de gel, como soporte de columna, durante un periodo de varios segundos a varias decenas de segundos, por lo que se logra la elución a medida que se separa del ß-glucano.

Además, otro objetivo en la presente invención es la optimización del tamaño de columna para lograr un tiempo de análisis equivalente a aquél en el análisis sin tal columna (varios minutos (preferiblemente 3 minutos) o más corto).

Un método para medir ß-glucano mediante un sistema de inyección en flujo que usa calcoflúor según la presente invención emplea un método en el que se hace pasar un flujo de muestra a través de una columna de filtración en gel, mediante el cual es posible que tras inyectar la muestra en el flujo de un eluente, un objetivo de análisis, concretamente, ß-glucano de alto peso molecular que tiene un peso molecular de 10.000 o superior, se eluya en el plazo de 1 minuto, mientras que se retarda la elución de los componentes de bajo peso molecular tales como maltosa, etanol y sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor, en relación con la elución del ß-glucano de alto peso molecular, separando de ese modo el ß-glucano de los componentes que provocan una fluctuación de los valores medidos, y la muestra que se hizo pasar así a través de la columna se midió entonces mediante un detector de fluorescencia.

Tal como se mencionó anteriormente, la presente invención es un método para medir ß-glucano en el que se coloca una columna de filtración en gel entre el orificio de inyección de muestra y el detector en el sistema, caracterizándose dicha columna porque el volumen del intersticio fuera de las partículas de gel (volumen inicial) no es mayor que el volumen del fluido eluido de la columna en el plazo de 1 minuto a la velocidad de flujo empleada, y el volumen de contenido de la columna (el volumen del intersticio fuera de las partículas de gel más el volumen del disolvente dentro de las partículas de gel (volumen interno)) que corresponde al volumen del eluente con el que se eluye de la columna la sustancia de bajo peso molecular que migra a la red de las partículas de gel, es 10 veces o más, mayor que el volumen de inyección de muestra, logrando de ese modo que el ß-glucano de alto peso molecular objetivo de análisis no migre a la red de las partículas de gel, sino pueda eluirse fácilmente de la columna cuando se hace pasar el eluente, en el volumen igual al volumen total del intersticio de las partículas de gel, a través del intersticio de las partículas de gel.

Cuando el volumen de contenido de la columna mencionado anteriormente es menor que el volumen de inyección de muestra, no puede lograrse una separación satisfactoria entre el ß-glucano de alto peso molecular, que tiene un peso molecular de 10.000 o superior, y los sacáridos de bajo peso molecular, el etanol y las sustancias que dificultan la reacción de fluorescencia del calcoflúor.

Descripción de la invención

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para medir ß-glucano mediante un sistema de inyección en flujo que usa calcoflúor, según la reivindicación 1.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un sistema convencional para medir el contenido en ß-glucano mediante un método de inyección en flujo que usa calcoflúor.

La figura 2 muestra otro sistema convencional para medir el contenido en ß-glucano mediante un método de inyección en flujo que usa calcoflúor.

La figura 3 muestra un sistema que emplea una columna de filtración en gel para medir el contenido en ß-glucano mediante un método de inyección en flujo que usa calcoflúor.

La figura 4 muestra otro sistema que emplea una columna de filtración en gel para medir el contenido en ß-glucano mediante un método de inyección en flujo que usa calcoflúor.

La figura 5 muestra los efectos del volumen vacío en la zona de reacción en el método según la presente invención.

La figura 6 muestra los efectos del volumen de inyección de muestra en el método según la presente invención.

Tal como se muestra en las figuras, se proporcionan en el sistema un fluido de reacción de calcoflúor 1, una bomba...

1. Método para medir ß-(1,3)(1,4)-D-glucano mediante un sistema de inyección en flujo que usa calcoflúor, en el que una columna de filtración en gel (9), que tiene un volumen del intersticio fuera de las partículas de gel que no es mayor que el volumen de efluente de la columna en el plazo de 1 minuto a la velocidad de flujo empleada y un volumen de contenido de la columna que es 10 veces o más mayor que el volumen de inyección de muestra, se coloca entre el puerto de inyección de muestra (3) y el detector (6) en dicho sistema, en el que las partículas de gel tienen un peso molecular de exclusión limitante de 4.000 a 300.000, de modo que permite que el ß-glucano de alto peso molecular atraviese la columna (9) en el plazo de 1 minuto sin que se retenga en las partículas de gel rellenadas en la columna (9), mientras que se retarda la elución de los componentes de bajo peso molecular.

2. Método para medir ß-(1,3)(1,4)-D-glucano según la reivindicación 1, en el que agua destilada (8) a la que se ha inyectado una muestra, se hace pasar a través de la columna (9) y entonces se mezcla en un flujo de un fluido (1) que contiene calcoflúor y que tiene una composición adecuada para la reacción de fluorescencia del calcoflúor.

3. Método para medir ß-(1,3)(1,4)-D-glucano según la reivindicación 1 ó 2, en el que se mantiene la zona alrededor del dispositivo durante la medición a una temperatura constante predeterminada.