Método para la determinación de la enfermedad inflamatoria intestinal.

Un método para el diagnóstico diferencial de la enfermedad inflamatoria intestinal que comprende:

determinar la proporción relativa del oligosacárido G0 mostrado mediante la fórmula (I):**Fórmula**

con respecto al oligosacárido G2 mostrado mediante la fórmula (II):**Fórmula**

donde G representa galactosa, M representa manosa, GN representa N-acetilglucosamina y F representa fucosa enla fracción de oligosacáridos de IgG en suero obtenida de un paciente con enfermedad inflamatoria intestinal o unpaciente sospechoso de padecer la enfermedad inflamatoria intestinal, y

diferenciar la enfermedad inflamatoria intestinal basándose en la proporción obtenida.

Método para la determinación de la enfermedad inflamatoria intestinal

Campo técnico La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico diferencial de la enfermedad inflamatoria intestinal. Más detalladamente, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico diferencial entre la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn en un paciente con enfermedad inflamatoria intestinal.

Antecedentes de la técnica La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) , que incluye la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU) , es una de las enfermedades incurables, y hay aproximadamente 120 mil pacientes con EII en Japón. Hoy en día, el

diagnóstico diferencial entre la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn en un paciente con EII se lleva a cabo principalmente por las características patológicas, entre las que se incluyen el aspecto específico observado mediante el enema de bario, la observación endoscópica, la presencia o ausencia de granulomas de células epitelioides, así como las características clínicas que incluyen la presencia o la ausencia de sangre en las heces y de lesiones perianales. Estos criterios requieren una endoscopia, lo que supone una gran molestia para el paciente que está siendo diagnosticado. Se ha deseado un método no invasivo y objetivo para el diagnóstico diferencial de un paciente con la enfermedad inflamatoria intestinal.

La inmunoglobulina G (de aquí en adelante, IgG) es una glucoproteína, y constituye aproximadamente el 75-85 % de las inmunoglobulinas séricas en seres humanos normales. Como se muestra en la Figura 1, la IgG es una molécula simétrica formada por dos cadenas H idénticas y dos cadenas L idénticas.

La IgG porta oligosacáridos en su fragmento Fc, y el oligosacárido desempeña un papel importante en el mantenimiento de la estructura estérica de la IgG. Además, el oligosacárido afecta a la interacción entre la IgG y el receptor Fcy o moléculas efectoras tales como complementos. Se conocen dieciséis oligosacáridos de IgG, que se muestran en la Figura 2.

En las personas sanas, las cantidades relativas entre los 16 oligosacáridos de IgG son aproximadamente constantes. Sin embargo, el equilibrio entre los oligosacáridos es específico de los pacientes con mieloma o artritis reumatoide (AR) . Por ejemplo, los pacientes con artritis reumatoide tienen niveles significativamente aumentados de inmunoglobulina G (IgG) agalactosilada en suero, que carece de la galactosa terminal en el oligosacárido de IgG. Se ha propuesto un método para el diagnóstico de la AR basado en este hallazgo (documento de no patente 1) , y se han desarrollado métodos para determinar la proporción relativa de los oligosacáridos (documento de patente 1) y para la detección de autoanticuerpos contra la IgG agalactosilada (CARF) sérica (documento de no patente 2) . Aunque CARF se correlaciona con la actividad patológica de la AR, se ha puesto de manifiesto que CARF no refleja necesariamente la cantidad de IgG agalactosilada sérica.

Se ha propuesto el diagnóstico basado en la alteración del oligosacárido de IgG para diagnosticar la afección del SIDA (documento de patente 2) , enfermedades hepáticas, hipertensión maligna, nefropatía por inmunoglobulina A y enfermedades infantiles (documento de patente 3) . Especialmente, se ha informado del aumento de la IgG 45 agalactosilada sérica en pacientes con enfermedades inflamatorias (documento de no patente 3) , y entre las enfermedades inflamatorias, el aumento de la IgG agalactosilada sérica es significativo en pacientes con enfermedades autoinmunes. Se ha sugerido que las citoquinas de la fase aguda, tales como TNF e IL-6, participan en el mecanismo de aumento de la IgG agalactosilada en un paciente con dicha enfermedad. Sin embargo, todavía no se han divulgado los detalles de dicha información. Se ha publicado que la IgG agalactosilada del suero de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa es mayor que en el suero de personas sanas. También se ha sugerido que la cantidad de IgG agalactosilada sérica se correlaciona con la proteína C reactiva (PCR) y la actividad clínica (documentos no de patente 4 y 5) . Sin embargo, estos informes se hicieron sobre la proporción de oligosacárido de IgG agalactosilada en todas las fracciones de oligosacárido de IgG en suero. Todavía no se ha publicado ningún estudio sobre la correlación de la relación entre 55 los oligosacáridos de IgG específicos y la EII.

[Documento de Patente 1] JP 8-220099 A; [Documento de Patente 2] JP 7-209301 A; [Documento de Patente 3] JP 8-82623 A; [Documento no de Patente 1] TAKARA BIO ONLINE CATALOGUE "Method for analyzing human IgG oligosaccharides using PALSTATION!"; [Documento no de Patente 2] “Package insert of PICOLUMI® CARF, a diagnosing kit for the determination serum anti-agalactosy IgG antibodies”; [Documento no de Patente 3] Thomas W. Rademacher et al., Springer Semin Immunopathol, Vol. 10, 231-249

(1998) ; [Documento no de Patente 4] R. Dube et al., Gut, Vol. 31, 431-434 (1990) ; [Documento no de Patente 5] Mae F. Go et al., J. Clin. Gastroenterol. Vol 18, 86-87 (1994) .

Tsuchiya et al. divulgan un ensayo para diferenciar la IgG agalacto de la IgG glucosilada de manera normal. El porcentaje de G0 se determinó usando una columna de proteína G o la captura de IgG usando proteína G en fase 5 sólida (véase, por ejemplo, la Figura 2) . Se observó que los pacientes con enfermedad de Crohn tenían una unión a PVL mayor (IgG agalacto superior) que los pacientes normales.

Parekh et al divulgan la relación entre los pacientes enfermos (por ejemplo, con enfermedad de Crohn, véase la Figura 20) y la presencia de IgG agalacto.

Dube at al describen la ausencia de galactosa en los polisacáridos de IgG en pacientes que sufren la enfermedad intestinal (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) .

Divulgación de la invención

Problema/s por resolver mediante la invención Un objeto de la invención es proporcionar un método objetivo y no invasivo para el diagnóstico diferencial de la enfermedad inflamatoria intestinal.

Medios para resolver el/los problema/s La invención proporciona un método para el diagnóstico diferencial de la enfermedad inflamatoria intestinal que donde G representa galactosa, M representa manosa, GN representa N-acetilglucosamina y F representa fucosa en la fracción de oligosacáridos de IgG sérica obtenida de un paciente con la enfermedad inflamatoria intestinal o un paciente sospechoso de padecer la enfermedad inflamatoria intestinal; y diferenciar la enfermedad inflamatoria intestinal basándose en la proporción obtenida.

De acuerdo con el método de la presente invención, se determina la proporción de la cantidad de oligosacárido G0 representado por la fórmula (I) con respecto a la cantidad de oligosacárido G2 representado por la fórmula (II)

(G0/G2) . Cuando la proporción es superior a un valor predeterminado, al paciente se le diagnostica la enfermedad de Crohn, mientras que cuando la proporción es inferior a un valor predeterminado, al paciente se le diagnostica colitis ulcerosa.

Efecto de la invención De acuerdo con la presente invención, se hace posible el diagnóstico diferencial entre la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn en un paciente con enfermedad intestinal inflamatoria o un paciente sospechoso de padecer la enfermedad inflamatoria intestinal. El método de la presente solicitud usa sangre periférica obtenida del paciente y, por tanto, causa menores molestias al paciente que el diagnóstico diferencial convencional, que requiere la 45 observación endoscópica. Más particularmente, el método de la invención puede determinar si un paciente con enfermedad inflamatoria intestinal tiene colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. En el diagnóstico diferencial convencional entre la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn, el diagnóstico se ha llevado a cabo de una manera integral basándose en los hallazgos del enema de bario, el aspecto endoscópico, los hallazgos histológicos, incluyendo la presencia o ausencia de granulomas epitelioides, además de la presencia o ausencia de sangre en las 50 heces y de lesión perianal. De acuerdo con la presente invención, el diagnóstico diferencial entre la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn en un paciente con enfermedad inflamatoria intestinal se puede llevar a cabo usando sangre periférica obtenida del paciente al que se ha diagnosticado enfermedad inflamatoria intestinal mediante observaciones clínicas no invasivas tales como la presencia o ausencia de sangre en las heces y de lesión perianal.

El método de la presente invención puede reducir significativamente... [Seguir leyendo]

1. Un método para el diagnóstico diferencial de la enfermedad inflamatoria intestinal que comprende: determinar la proporción relativa del oligosacárido G0 mostrado mediante la fórmula (I) :

con respecto al oligosacárido G2 mostrado mediante la fórmula (II) :

donde G representa galactosa, M representa manosa, GN representa N-acetilglucosamina y F representa fucosa en la fracción de oligosacáridos de IgG en suero obtenida de un paciente con enfermedad inflamatoria intestinal o un paciente sospechoso de padecer la enfermedad inflamatoria intestinal, y diferenciar la enfermedad inflamatoria intestinal basándose en la proporción obtenida.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde al paciente se le diagnostica la enfermedad de Crohn cuando la proporción del oligosacárido G0 con respecto al oligosacárido G2 (G0/G2) es superior a un valor predeterminado basándose en las proporciones de G0/G2 determinadas en los sueros de pacientes que tienen la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa y en individuos sanos.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde al paciente se le diagnostica colitis ulcerosa cuando la proporción del oligosacárido G0 con respecto al oligosacárido G2 (G0/G2) es inferior a un valor predeterminado basándose en las proporciones de G0/G2 determinadas en los sueros de pacientes que tienen la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa y en individuos sanos.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la G0/G2 superior significa la mayor 25 gravedad de la enfermedad inflamatoria intestinal en el paciente.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la G0/G2 inferior significa el mejor pronóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal en el paciente.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende las etapas de:

1) aislar inmunoglobulina G del suero de un paciente con enfermedad inflamatoria intestinal; 2) separar oligosacáridos de la inmunoglobulina G; 3) medir la proporción relativa entre el oligosacárido G2 y el oligosacárido G0; y

4) diferenciar la enfermedad inflamatoria intestinal basándose en la proporción obtenida.

7. Un kit para llevar a cabo el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende:

1) anticuerpo contra la inmunoglobulina G (oligosacárido G0) ;

2) anticuerpo contra la inmunoglobulina G (oligosacárido G2) ; 3) soporte sólido para inmovilizar el anticuerpo contra la inmunoglobulina G (oligosacárido G0) y el anticuerpo contra la inmunoglobulina G (oligosacárido G2) en el mismo; y 4) enzima para la detección y el sustrato para la enzima.