PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE LA (4S)-3,4-DIHIDROXI-2,6,6-TRIMETIL-CICLOHEX-2-ENONA Y DERIVADOS DE LA MISMA CON EMPLEO DE LA FENILETANOL DEHIDROGENASA DE AZOARCUS.

Procedimiento para la obtención de derivados ópticamente activos de la (4S)-4-hidroxi-2,6,6-trimetilciclohex-2-en-1-ona de la fórmula (I)

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/062170.

Solicitante: BASF SE.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: BASF SE08265920PF 58560,67056 LUDWIGSHAFEN.

Inventor/es: HAUER, BERNHARD, BREUER, MICHAEL, ERNST, HANSGEORG, DR..

Fecha de Publicación: 10 de Junio de 2010.

Fecha Concesión Europea: 3 de Marzo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

C12P23/00 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › Preparación de compuestos que contienen un ciclo ciclohexeno con una cadena lateral insaturada de al menos diez átomos de carbono unidos por enlaces dobles conjugados, p. ej. carotenos (que contienen heterociclos C12P 17/00).
C12P7/02 C12P […] › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › que contienen un grupo hidroxilo.

Clasificación PCT:

C12N9/04 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
C12P23/00 C12P […] › Preparación de compuestos que contienen un ciclo ciclohexeno con una cadena lateral insaturada de al menos diez átomos de carbono unidos por enlaces dobles conjugados, p. ej. carotenos (que contienen heterociclos C12P 17/00).

Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la obtención de la (4S)3,4-dihidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-enona y derivados de la misma con empleo de la feniletanol dehidrogenasa de Azoarcus.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de derivados ópticamente activos de la (4S)-4-hidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-en-1-ona de la fórmula (I) y a un procedimiento para la obtención de (3S, 3'S)-astaxantina de la fórmula (III) que abarca el procedimiento que ha sido citado en primer lugar.

Como consecuencia de sus dos centros de quiralidad en la posición 3 y en la posición 3', la astaxantina (3,3'-dihidroxi-ß,ß'-carotin-4,4'-diona) puede presentarse en forma de los siguientes isómeros de configuración: (3S, 3'S), (3R, 3'R), (3S, 3'R) y (3R, 3'S). Los dos isómeros de configuración que han sido citados en último lugar son idénticos y representan una forma meso (Carotenoids Handbook, 2004, Main List Nr. 405).

Las tres formas se encuentran en fuentes naturales (Carotenoids Handbook, 2004, Main List Nr. 404, 405, 406). La síntesis química total, a partir de productos de partida racémicos, conduce a una mezcla 1:2:1 constituida por la (3S, 3'S)-astaxantina, la meso-astaxantina y la (3R, 3'R)-astaxantina (The EFSA Journal, 2005, 291, 12, Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 2004, 100, 437, Helvetica Chimica Acta, 1981, 64, 2436).

Sin embargo, el isómero con la configuración (3S, 3'S) tiene un significado especial. Este isómero es biosintetizado por las algas verdes (Haematococcus pluvialis) en forma enantiómeramente pura (J. Applied Phycology, 1992, 4, 165; Phytochemistry, 1981, 20, 2561).

La (S,S)-astaxantina de las algas verdes es empleada como complemento alimenticio con efectos positivos para la salud de los seres humanos (J. Nat. Prod., 2006, 69, 443). Por otra parte, es adecuado bloquear por completo el efecto prooxidante inconveniente del Rofecoxib (Vioxx) (J. Cardiovasc. Pharmacol., 2006, 47 Suppl 1, página 7).

Sin embargo, teniendo en consideración la baja concentración de la (S,S)-astaxantina en las algas verdes (J. Agric. Food Chem., 1998, 46, 3371), la disponibilidad de este principio activo está muy limitada. Por otra parte, el principio activo se presenta en las algas en una mezcla formada por monoésteres y por diésteres de ácidos grasos así como por la astaxantina libre, lo cual provoca un coste considerable para llevar a cabo el aislamiento y la purificación (véanse entre otras las publicaciones Phytochemistry, 20, 11, 2561 (1981); J. Applied Phycology, 4, 2, 165 (1992)). Con objeto de poner a disposición la (S,S)-astaxantina en mayores cantidades y con elevada pureza, la síntesis química total representa la tecnología elegida.

En la literatura han sido descritas diversas síntesis de la (S,S)-astaxantina. Una estrategia consiste en la disociación de los productos precursores racémicos en los antípodas ópticos, para lo cual se han empleado las sales diastereómeras (Helvetica Chimica Acta, 1981, 64, 2447) o los ésteres diastereómeros (Helvetica Chimica Acta, 1981, 64, 2419). También se ha informado sobre la disociación microbiana del racemato de los productos precursores racémicos. En estos procedimientos es especialmente inconveniente el que el enantiómero, que conduciría a la (R,R)-astaxantina no puede ser empleado o bien únicamente puede ser recuperado de una manera muy costosa.

Otra estrategia de síntesis consiste en el acceso a los elementos estructurales de la síntesis enantiómeramente puros por medio de procedimientos microbianos o bien enzimáticos (Helvetica Chimica Acta, 1978, 61, 2609, Helvetica Chimica Acta, 1981, 64, 2405). Puesto que estos elementos estructurales presentan un estado de oxidación demasiado bajo, tuvieron que ser transformados en síntesis con muchas etapas para dar los productos precursores de la (S,S)-astaxantina.

La publicación WO 2006/039685 describe, por un lado, en el esquema II una hidrogenación enantioselectiva en dos etapas de la cetoisoforona para dar un diol con 9 átomos de carbono enantiómeramente puro, a partir del cual se accede a los productos precursores de la (S,S)-astaxantina tras una reoxidación de un grupo hidroxi de conformidad con el procedimiento descrito en la publicación Helv. Chim. Acta,1978 61, 2609, en una síntesis que abarca múltiples etapas. Por otra parte, la publicación WO 2006/039685 describe una hidrogenación por transferencia catalítica enantioselectiva de un enoléter con 9 átomos de carbono de la fórmula (IIa) para dar el correspondiente alcohol enantiómeramente puro de la fórmula (Ia).

Como catalizadores para la hidrogenación han sido descritos metales con ligandos quirales, preferentemente catalizadores de rutenio con aminas ópticamente activas a título de ligandos. El inconveniente de este procedimiento consiste en que se emplea un derivado O-protegido de un producto intermedio industrial de la fórmula (IIb),

lo cual requiere un coste adicional para la síntesis. Por otra parte los catalizadores ópticamente activos necesarios son muy costosos de tal manera, que su empleo queda dificultado en los procedimientos industriales desde el punto de vista económico.

De igual modo, se ha descrito la reducción biocatalítica de un enol con 9 átomos de carbono de la fórmula (IIb) con levaduras. Sin embargo, en este caso se obtuvo únicamente un exceso en enantiómeros del 65%, lo cual hace que este proceso no pueda ser empleado en procedimientos industriales. (Helv. Chim. Acta, 1981, 64, 2447).

En principio se sabe que las dehidrogenasas son adecuadas como biocatalizadores para la obtención de compuestos hidroxi ópticamente activos. Se trata de biocatalizadores perfectamente caracterizados que han sido empleados ya en una serie de procesos industriales (Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 788, Tetrahedron, 2004, 60, 633, Chiral catalysis-asymmetric hydrogenation supplement to Chemistry Today, 2004, 22, 26, Current Opinion in Chemical Biology, 2004, 8, 120, Organic Process Research & Development, 2002, 6, 558, Tetrahedron: Asymmetry, 2003, 14, 2659, Chiral catalysisasymmetric hydrogenation supplement to Chemistry Today, 2004, 22, 43).

Se describe en la publicación WO 2005/108590 un procedimiento para la obtención de determinados alcanoles ópticamente activos, tal como, por ejemplo, el (1S)-3-metilamino-1-(2-tienil)-propan-1-ol o el (1S)-3-cloro-1-(2-tienil)-propan-1-ol, por medio de una reducción enzimática de la cetona correspondiente. No se ha tratado la extensión en la que puede ser aplicado el enzima utilizado para la reducción de cetonas estructuradas de otra manera.

Los procedimientos descritos para la introducción de ambos centros de quiralidad en uno de los productos precursores para la síntesis de la S,S'-astaxantina o bien son complejos y abarcan múltiples etapas o bien no son económicos de tal manera, que estos procedimientos parece que son poco adecuados para una realización a escala industrial.

La tarea de la presente invención consistía en desarrollar un procedimiento sencillo y económicamente eficiente, a partir de productos de partida industrialmente disponibles, para la obtención de un producto intermedio ópticamente activo, en forma lo más enantiómeramente pura posible, para la síntesis de la (S,S')-astaxantina, que pudiese ser integrado sin problemas en la síntesis total industrial existente de la astaxantina "racémica" (Carotenoids Vol.2, 1996, 259; Pure and Applied Chemistry, 2002, 74, 2213).

Esta tarea se resuelve por medio de un procedimiento para la obtención de derivados ópticamente activos de la (4S)-4-hidroxi-2,6,6-trimetil-ciclohex-2-en-1-ona de la fórmula (I)

en la que

R¹ significa hidrógeno, alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, arilalquilo con 7 hasta 14 átomos de carbono, un metal alcalino M¹ o un fragmento de un metal alcalinotérreo M² _1/2 o (M²)⁺ X^-, donde M significa Li, Na, K, Rb o Cs y M² significa Mg, Ca, Sr o Ba y X^- significa un anión cargado de manera sencilla,

que comprende...

Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la obtención de derivados ópticamente activos de la (4S)-4-hidroxi-2,6,6-trimetilciclohex-2-en-1-ona de la fórmula (I)

en la que

R¹ significa hidrógeno, alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, arilalquilo con 7 hasta 14 átomos de carbono, un metal alcalino M¹ o un fragmento de un metal alcalinotérreo M²_1/2 o (M²)⁺X^-, donde M significa Li, Na, K, Rb o Cs y M² significa Mg, Ca, Sr o Ba y X^- significa un anión cargado de manera sencilla,

que comprende una etapa de reacción,

en la que se incuba en un medio, que contiene un derivado de la trimetil-ciclohex-2-en-1,4-diona de la fórmula (II),

en la que

R² es igual o diferente de R¹ y significa hidrógeno, alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, arilalquilo con 7 hasta 14 átomos de carbono, un metal alcalino M¹ o un fragmento de metal alcalinotérreo M²_1/2 o (M²)⁺X^-, donde M¹ significa Li, Na, K, Rb o Cs y M² significa Mg, Ca, Sr o Ba y X^- significa un anión cargado de manera sencilla,

por incubación de un enzima (E), que tiene una secuencia de polipéptidos, que es o bien

(i) la SEQ ID NO: 2, o bien (ii) en la que hasta el 25% inclusive de los restos de los aminoácidos están modificados con respecto a la SEQ ID NO: 2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de los mismos y que presenta todavía al menos el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO: 2,

en presencia de equivalentes de reducción, reduciéndose por vía enzimática el compuesto de la fórmula (II) para dar el compuesto de la fórmula (I), y los equivalentes de reducción, que son consumidos en el transcurso de la reacción son regenerados de nuevo por medio de la conversión de un agente reductor (RM) para dar el correspondiente producto de la oxidación (OP) con ayuda del enzima (E) o con otro enzima (E²) y, de manera opcional, el producto de la oxidación (OP) se elimina, al menos en parte, del medio de la reacción o del equilibrio de la reacción, y se aísla el producto (I) formado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el enzima es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos según la SEQ ID NO:1 o de un equivalente funcional de la misma.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se emplea como agente reductor (RM) un compuesto orgánico, que contiene al menos una función alcohol primaria o secundaria CH(OH), especialmente el isopropanol o la glucosa.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se lleva a cabo la conversión del compuesto de la fórmula (II) en presencia de un microorganismo, que se elige entre las bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Rhodococcaceae, Rhodocyclaceae y Nocardiaceae.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el microorganismo es un microorganismo recombinante, que está transformado con un constructo de ácido nucleico, que codifica un enzima de conformidad con la definición de la reivindicación 1.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que R¹ en la fórmula (I) significa hidrógeno, metilo o sodio, de manera especial significa hidrógeno o sodio.

7. Procedimiento para la obtención de (3S, 3'S)-astaxantina que comprende un procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes como una etapa de reacción de la síntesis total de la (3S, 3'S)-astaxantina.

8. Empleo de un enzima (E) con una secuencia de polipéptidos

i. SEQ ID NO: 2 o ii. en la que hasta el 25% inclusive de los restos de aminoácidos está modificado con respecto a la SEQ ID NO:2 por medio de una deleción, de una inserción, de una substitución o de una combinación de las anteriores y que presenta todavía, al menos, el 50% de la actividad enzimática de la SEQ ID NO:2,

para la obtención de un compuesto de la fórmula (I).

9. Empleo según la reivindicación 8, en el que el compuesto de la fórmula (I) se convierte en otras etapas de la reacción para dar (3S, 3'S)-astaxantina de la fórmula (III).

Patentes similares o relacionadas:

Procedimiento de enriquecimiento en carotenoides y en proteínas de la biomasa de microalgas, del 29 de Abril de 2020, de Corbion Biotech, Inc: Procedimiento de enriquecimiento en carotenoides y en proteínas de una biomasa de microalga del género Chlorella cultivada en heterotrofia, que comprende el […]

Métodos para ajustar los niveles de producción de carotenoides y composiciones en géneros de Rhodosporidium y Rhodotorula, del 15 de Abril de 2020, de TEMASEK LIFE SCIENCES LABORATORY LIMITED: Un método para ajustar el nivel de producción y la composición de carotenoides en un huésped fúngico que comprende: (a) manipular genéticamente […]

Uso de nucleasas termófilas para degradar ácidos nucleicos, del 23 de Octubre de 2019, de DSM IP ASSETS B.V.: Un procedimiento para la producción de biomasa que comprende un compuesto biológico seleccionado del grupo que consiste en fitoeno, licopeno, beta-caroteno, alfa-caroteno, […]

UNA CEPA POLIPLOIDE DE HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS CON MAYOR PRODUCTIVIDAD DE ASTAXANTINA, del 4 de Julio de 2019, de UNIVERSIDAD DE CONCEPCION: La presente tecnología corresponde a una cepa poliploide de Haematococcus pluvialis depositada en el Banco Español de Algas (BEA) bajo […]

Procedimiento de extracción sin disolvente, del 1 de Mayo de 2019, de DSM IP ASSETS B.V.: Un procedimiento para obtener lípido que contiene un ácido graso altamente insaturado omega-3 a partir de microorganismos, que comprende: (a) lisar células de los microorganismos […]

MÉTODO DE CULTIVO AL EXTERIOR U "OUTDOOR" DE LA MICROALGA MURIELLOPSIS SP. PARA PRODUCIR BIOMASA CON ALTO CONTENIDO EN LUTEÍNA Y BAJO CONTENIDO EN METALES QUE TIENE BUENAS PROPIEDADES ANTIOXIDANTES Y ÚTIL PARA PREPARAR ALIMENTO ANIMAL O DE CONSUMO HUMANO, del 18 de Abril de 2019, de UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA: La presente invención se relaciona con el área de la biotecnología. En particular, la invención ser refiere a un método para la producción de antioxidantes […]

Procedimiento de cultivo celular desacoplado, del 20 de Marzo de 2019, de FERMENTALG: Procedimiento de producción de biomasa de células de organismos unicelulares eucariotas capaces de crecer mediante el uso de la luz y una fuente de carbono orgánico, […]

Composiciones estables y biodisponibles de isómeros de licopeno para la piel y el cabello, del 19 de Marzo de 2019, de INDENA S.P.A.: Un método para fabricar una composición estable enriquecida en cis-licopeno (isómeros Z) por calentamiento continuo prolongado en un solvente de un material que contiene […]