PROCEDIMIENTO PARA LA CARACTERIZACION Y/O IDENTIFICACION DE MECANISMOS ACTIVOS DE SUSTANCIAS DE PRUEBA ANTIMICROBICAS.
Procedimiento para la identificación o caracterización del mecanismo activo de una sustancia antimicróbica,
que comprende los siguientes pasos:
a) Establecer espectros de referencia a través del tratamiento de determinados cultivos microbianos con sustancias de prueba, cuyo mecanismo activo es conocido, y el registro de, al menos, un espectro de grupo de espectros IR, FTIR, Raman y FT-Raman.
b) Selección respectiva de, al menos, un rango de longitud de onda de estructura igual o similar, para diferenciar las clases pertenecientes al mecanismo activo correspondiente, y clasificación de los espectros de referencia en las clases en el banco de datos de referencia, asimismo, los espectros de referencia asignados a una clase presentan una estructura igual o similar en el rango de longitud de onda seleccionado, que se diferencia de manera significativa de la estructura de los espectros de referencia de otras clases en el rango de longitud de onda seleccionado
c) tratamiento de un cultivo microbiano con la sustancia por evaluar
d) registro de, al menos, un espectro (espectro de prueba) del grupo de espectros IR, FT-IR, Raman y FT- Raman;
e) comparación del o de los espectros de prueba de d) con uno o múltiples espectros de referencia en el banco de datos de referencia,
f) Asignación de los espectros de prueba a una, dos o múltiples clases de espectros de referencia en el banco de datos de referencia e identificación o caracterización del mecanismo activo
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W0212642EP.
Solicitante: SYNTHON KG.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: KARL-CHRIST-STR. 39,69118 HEIDELBERG.
Inventor/es: SCHMITT, JURGEN, UDELHOVEN, THOMAS, SCHIFFER, GUIDO, LABISCHINSKI, HARALD.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 15 de Julio de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/18 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › Investigación o análisis de la actividad antimicrobiana de un material.
Clasificación PCT:
- C12Q1/18 C12Q 1/00 […] › Investigación o análisis de la actividad antimicrobiana de un material.
Clasificación antigua:
- C12Q1/00 C12Q […] › Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones.
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Fragmento de la descripción:
Procedimiento para la caracterización y/o identificación de mecanismos activos de sustancias de prueba antimicróbicas.
La presente invención comprende un procedimiento para la caracterización y/o identificación de mecanismos activos, especialmente, sustancias de prueba de acción antimicrobiana, mediante análisis IR (infrarrojo), FT-IR (infrarrojo por transformada de Fourier), Raman o FT-Raman (Raman por transformada de Fourier).
Estudios epidemiológicos han demostrado que las tasas de resistencia de microorganismos patógenos, por ejemplo, de gérmenes bacterianos, contra sustancias inhibidoras e inhibidores usuales en el mercado, por ejemplo, antibióticos, antimicóticos y otros agentes quimioterapéuticos, se han incrementado en el transcurso de las dos últimas décadas [Levy S.B. (2001) Antibiotic resistance: consequences of inaction. (Resistencia a antibióticos: consecuencias de la inacción. Clin Infect Dis Sep 15; 33 Suppl 3: páginas 124-9]. Para seguir garantizando también en el futuro el tratamiento terapéutico de infecciones bacterianas, en este contexto de tasas de resistencia contra antibióticos conocidos, en todo el mundo se realizan esfuerzos para identificar y desarrollar nuevos compuestos cabeza de serie (leads) para la terapia con antibióticos. Para ello, es de central importancia la investigación y el desarrollo del mecanismo activo de tales compuestos cabeza de serie antimicrobianos. Por el término mecanismo activo (información de diana -target-) se entiende, en este caso, la identificación de las rutas metabólicas hasta los procedimientos moleculares individuales que se encuentran en relación causal con el efecto antimicrobiano de un nuevo compuesto cabeza de serie. Por un lado, el conocimiento de la estructura microbiana de destino, de la diana, permite una optimización rápida y eficiente del compuesto cabeza de serie in vitro, por ejemplo, en un análisis subcelular de la diana (target-assay); por otro lado, pueden reconocerse ya tempranamente potenciales efectos secundarios toxicológicos basados en la inhibición de una diana homóloga que posiblemente también se encuentre en el huésped, en una contraprueba correspondiente. En el caso del conocimiento de la diana molecular o del dominio de la diana, se puede impedir, por otro lado, el desarrollo de una sustancia antimicróbica de prueba con mecanismo activo no selectivo (por ejemplo, acción detergente general destructora de membrana, destrucción del potencial de membrana a través de ionóforos, intercalación en ácidos nucleicos), gracias a lo cual se pueden ahorrar, entre otros, costos de investigación.
Los antibióticos utilizados hoy en día en la terapia de humanos se caracterizan por el efecto específico sobre un metabolismo esencial para la supervivencia de la bacteria (compárese, por ejemplo, con Graefe U. (1992) Biochemie der Antibiótica (Bioquímica de los antibióticos), páginas 15-39, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, New York). La mayor cantidad de las clases conocidas de antibióticos inhibe o desregula la biosíntesis de macromoléculas bacteriales, por ejemplo, ADN (ejemplos: quinolonas, novobiocina), ARN (ejemplos: rifampicina, estreptolidigina, lipiarmicina, holomicina), proteínas (ejemplos: macrólidos/quetólidos, aminoglucosidos, tetraciclinas, oxazolidinonas) o peptidoglicano (ejemplos: ß-lactamas, fosfomicina, vancomicina, moenomicina). Otros antibióticos actúan sobre la inhibición de rutas metabólicas del metabolismo intermedio (por ejemplo, sulfonamidas y trimetoprima como inhibidores del metabolismo de C1; cerulenina como inhibidor de la biosíntesis de ácidos grasos).
Frecuentemente, el efecto antibiótico puede ser atribuido directamente a la inhibición de una enzima definida o una familia de enzimas; por ejemplo, las ß-lactamas inhiben de manera irreversible la familia de enzimas de las proteínas de enlace de la penicilina indispensables para la síntesis de las paredes celulares y finalmente, inician con ello la autólisis de la célula bacterial. En otros casos, las estructuras macromoleculares mayores, como los ribosomas -complejos de ribonucleoproteína que catalizan la traslación de ARNm en una secuencia de proteína- sirven como puntos de ataque de antibióticos (por ejemplo, macólidos) (Graefe U. (1992) Biochemie der antibiótica (Bioquímica de los antibióticos), páginas 15-39, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, New York, Russell A.D., Chopra I. (1996) Understanding Antimicrobial Action and Resistance (Comprender el efecto y la resistencia antimicrobianos), segunda edición, páginas 28-83, Ellis Horwood, London).
Según el estado actual de la técnica, para aclarar el mecanismo activo de sustancias de acción antimicrobiana se utilizan, especialmente, los siguientes métodos, individualmente o combinados:
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para la identificación o caracterización del mecanismo activo de una sustancia antimicróbica, que comprende los siguientes pasos:
2. Procedimiento acorde a la reivindicación 1, caracterizado porque la comparación e) se realiza mediante un procedimiento matemático de reconocimientos de patrones.
3. Procedimiento acorde a la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque los espectros obtenidos en el paso d) son procesados de un modo que permite el reconocimiento automático de las modificaciones y de los patrones espectrales característicos.
4. Procedimiento acorde a las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la clasificación se realiza a través de un reconocimiento de patrones, que puede clasificar simultáneamente dos o más clases.
5. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la información característica de un patrón espectral para una de las clases es almacenada en un modelo de clasificación o en forma de los pesos en redes neuronales artificiales.
6. Procedimiento acorde a las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la comparación de los espectros de prueba con los espectros de referencia se lleva a cabo a través del modelo de clasificación.
7. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el cultivo microbiano es un cultivo puro.
8. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque en el caso del mecanismo activo se trata de inhibidores de la biosíntesis de proteínas, del metabolismo del ARN o del ADN, del metabolismo de la pared celular o de lípidos, de sustancias membranotropas o intercaladores de ADN.
9. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque para la facilitación del banco de datos de referencia se utilizan mutantes del germen microbiano definidos adicionalmente, preferentemente, aquellos con una producción reducida o elevada de un gen diana o aquellos con actividad biológica limitada o incrementada a causa de mutaciones de producto y/o deleciones, asimismo, la mutación del gen diana correspondiente ajusta la interacción del producto de gen con una sustancia hipotética de referencia.
10. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la selección de rango de longitud de onda para la diferenciación de las clases (selección de longitud de ondas) se lleva a cabo a través de procedimientos estadísticos multivariados, como el análisis de variancias, análisis de covariancias, análisis factorial, por medición de distancia estadística, como la distancia Euclidiana o la distancia de Mahalanobis, o por una combinación de estos métodos con un procedimiento de optimización, como los algoritmos genéticos.
11. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque antes de la selección de longitud de ondas se lleva a cabo un procesamiento previo de los espectros de referencia para incrementar el contraste espectral, o a través de la formación de derivaciones, deconvolución, filtrado, supresión de ruidos o reducción de datos a través de la transformación wavelet o descomposición factorial.
12. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la clasificación en los espectros de referencia en las clases en el banco de datos de referencia se lleva a cabo a través de métodos matemáticos de clasificación del reconocimiento de patrones, un modelo lineal general, a través de redes neuronales artificiales, métodos de la clasificación basada en casos, de la optimización por vectores o de aprendizaje artificial, de algoritmos genéticos o de métodos de la programación evolucionaria.
13. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la clasificación en los espectros de referencia en las clases en el banco de datos de referencia se lleva a cabo a través de métodos matemáticos de clasificación del reconocimiento de patrones, como procedimientos estadísticos multivariados del reconocimiento de patrones, redes neuronales, métodos de la clasificación basada en casos, o de aprendizaje artificial, de algoritmos genéticos o de métodos de la programación evolucionaria.
14. Procedimiento acorde a la reivindicación 13, caracterizado porque se utilizan múltiples redes neuronales artificiales y modelos de clasificación.
15. Procedimiento acorde a la reivindicación 14, caracterizado porque se utilizan múltiples redes neuronales artificiales como red feed-forward con tres capas y un método de descenso de gradiente como algoritmo de aprendizaje.
16. Procedimiento acorde a las reivindicaciones 14 o 15, caracterizado porque el sistema de clasificación presenta una estructura tipo árbol, asimismo, las tareas de clasificación se descomponen en tareas parciales y los sistemas de clasificación individuales se combinan en una unidad formando un sistema de clasificación jerárquico y, a su vez, durante la evaluación se recorren automáticamente todas las etapas jerárquicas.
17. Procedimiento acorde a la reivindicación 16, caracterizado porque en el caso de los sistemas de clasificación individuales se trata de redes neuronales optimizadas para tareas especiales.
18. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque la asignación de un espectro de prueba a una, dos o múltiples clases de espectros de referencia se lleva a cabo a través de métodos matemáticos de clasificación del reconocimiento de patrones, como procedimientos estadísticos multivariados del reconocimiento de patrones, redes neuronales, métodos de la clasificación basada en casos, o de aprendizaje artificial, de algoritmos genéticos o de métodos de la programación evolucionaria.
19. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el registro de espectros IR se lleva a cabo en el área espectral de 500 a 4000 cm-1 y/o de 4000 a 10.000 cm-1.
20. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la sustancia de prueba es una sustancia inhibidora.
21. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque la concentración de la sustancia inhibidora con la cual es tratado el cultivo bacterial, se encuentra en el rango de 0,1 a 20 veces la concentración mínima para la sustancia inhibidora para la sustancias de prueba.
22. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque se registran los espectros de prueba de un cultivo microbiano que fueron tratados, respectivamente, con la misma sustancia inhibidora pero con una concentración diferente.
23. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque la medición se lleva a cabo en cubetas, cubetas de flujo y microcubetas, que son medidas en transmisión, absorción o reflexión y son adecuadas para las mediciones o mediciones de flujo automatizadas y el high-throughput-screening, o cribado ultrarrápido.
24. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque las mediciones FT-IR, IR, Raman y FT -Raman pueden ser medidas directamente en líquidos y recipientes de tratamiento y preparación de las muestras.
25. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque como cultivos celulares microbianos se implementan células procariotas o eucariotas, preferentemente, bacterias, hongos, levaduras o arqueobacterias.
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