INMUNIZACION MEDIADA POR BACTERIOFAGOS.

Una formulación que comprende una partícula de bacteriófago lambda,

P1, T, Mu, fd, M13 o filamentoso, cuya superficie no se ha modificado para comprender péptidos/proteínas exógenos en la superficie del fago, diseñado para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos de células eucarióticas específicas, y, por lo tanto, un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo la partícula del bacteriófago una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido que es capaz de expresarse y presentarse en la superficie de una célula que presenta antígeno de un organismo bajo el control de un promotor eucariótico, para usar en la provocación de una respuesta inmune profiláctica y/o terapéutica contra el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico exógeno, en un organismo

Inmunización mediada por bacteriófagos.

La presente invención se refiere a formulaciones que comprenden un bacteriófago modificado por ingeniería genética para expresar una proteína/péptido inmunogénico, así como los usos del bacteriófago modificado.

La vacunación genética es una nueva y prometedora técnica en la que se usa ácido nucleico como el material de vacuna (para una revisión véase Leitner y col. 2000. Vaccine 18: 765 - 777). Por el contrario, las vacunas tradicionales requieren el uso de microbios patogénicos o sus componentes antigénicos. Hay tres clases de vacunas "tradicionales": atenuadas, de virus muertos/de subunidades y recombinantes. Las vacunas atenuadas son microorganismos vivos con patogenicidad reducida y son por lo general las vacunas más efectivas. No obstante, estas pueden producir complicaciones si el agente de la vacuna crece descontroladamente o revierte a una forma más patogénica. Las vacunas de virus muertos o de subunidades requieren múltiples inyecciones, con lo que aumenta el coste y se generan problemas logísticos, y pueden contener microbios no completamente muertos. Las vacunas recombinantes en las que un antígeno de un organismo patogénico se modifica por ingeniería genética en un vector no patogénico pueden ser efectivas pero las dificultades en la consecución de la expresión del antígeno en una conformación nativa limita con frecuencia la eficacia.

Para ser efectivas las vacunas necesitan proporcionar una dosis suficiente de antígeno para periodos de tiempo suficientemente prolongados para inducir una respuesta secundaria (memoria). Esto representa un problema para las vacunas tradicionales; las vacunas de ADN/ARN, no obstante, pueden producir de forma efectiva copias de antígenos patogénicos durante prolongados periodos de tiempo e inducir así respuestas de MHC de clase I y II, como se observa con vacunas vivas. Sin embargo las vacunas de ADN aún tienen que desarrollar todo su potencial. A pesar de desencadenar una respuesta inmune humoral (anticuerpo) medible, muchas vacunas de ADN muestran poca eficacia cuando se exponen al organismo infectivo (Beard, CW & Mason, PW. 1998. Nature Biotech. 16: 1325).

En la actualidad no está claro el mecanismo por el que el ácido nucleico se introduce en células del huésped e induce una respuesta inmune. La técnica más simple es administrar el ADN como una inyección soluble, normalmente administrada por vía intramuscular. Otras dos técnicas de uso común son la técnica de "pistola génica", en la que se precipita ADN sobre partículas de oro diminutas que son forzadas dentro de las células con una corriente de helio, o transfección mediada por liposomas, en la que se recubre ADN con lípido cargado positivamente para formar un complejo que funde con la membrana de la célula huésped. Se cree que las células que rodean el sitio de inmunización recogen el ADN, expresan el(los) antígeno(s) codificado(s), y son reconocidos como "extraños" por las células que presentan antígeno (AP) del sistema inmune, que luego proceden a activar células T y B desencadenando una respuesta inmune frente al antígeno.

Las limitaciones parecerían ser: (1) la expresión es relativamente ineficiente y no específica, expresándose la mayor parte del ADN en células no AP; (2) la expresión de antígenos extraños en células no AP conduciría eventualmente a la muerte de esa célula debido a su reconocimiento como "infectada" por parte del sistema inmune del huésped, acortando así la respuesta inmune potencial; y (3) el ADN/ARN desnudo es altamente sensible a la acción de nucleasas. Es probable que la mayor parte del ácido nucleico usado para inmunización se degrade poco después de la inmunización.

El documento WO 98/05344 describe un procedimiento para la liberación de genes exógenos usando un vector bacteriófago en el que el vector bacteriófago se ha visto modificado para incluir en su superficie un ligando que se une a un receptor en una célula diana. Por lo general se pretende que se usen los vectores descritos para aplicaciones de terapia génica donde los vectores se dirigen a tipos específicos de células. También se hace mención al uso de los vectores bacteriófagos modificados para liberar péptidos antigénicos.

El documento US 5.736.388 describe bacteriófagos lamboides modificados para liberación de moléculas de ácido nucleico en células eucarióticas en las que el bacteriófago se ha visto modificado por incorporación de proteínas de fibra de cola mutante o por incorporación de ligandos para receptores de células eucarióticas.

El documento US 6.054.312 se refiere a partículas de fago filamentosas que muestran un ligado en su superficie, siendo el ligando una proteína de fusión con una proteína de la cápsida del fago, conjugada de forma covalente con partículas de fago, o complejada con partículas de fago modificadas.

El documento WO 99/55720 también describe fagos que se han modificado para mostrar externamente una proteína de direccionamiento heteróloga para uso en liberación direccionada de genes.

Sin embargo, las patentes/solicitudes de patente anteriormente citadas describen todas ellas la modificación de la superficie del fago, de modo que permita la liberación dirigida de ácido nucleico a células específicas, por lo general para fines de terapia génica.

De Berardinis y col (Nature Biotechnology 2000, vol. 18 pág. 873) muestran la inducción de una respuesta de células T fuerte por medio de bacteriofagos de ADN que muestran epitopes de VIH incorporados en la proteína de envoltura principal.

Una serie de documentos (Ishiura, M. y col, Molec. And Cell. Biol., páginas 607 - 616, 1982; Aujame, L. y col., Biotechniques, 28 páginas 1202 - 1213, 2000; Horst, J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 72, páginas 3531 - 3535, 1975; Jkayama y Dery, Molec. y Cell. Biol. 5, páginas 1136 - 1142, 1985; y Srivatsan, E. y col, 38, páginas 227 - 234, 1984) se refieren al uso de fagos para transfectar células de mamífero cultivadas y expresar proteínas en su interior. Sin embargo, no hay sugerencia alguna de que se podrían aplicar in vivo, o usarse en el desarrollo de vacunas.

Es un objeto de la presente invención solventar y/o mitigar al menos una de las desventajas anteriormente citadas.

En un primer aspecto la presente invención proporciona una formulación como se define en la reivindicación 1.

A diferencia de las divulgaciones previas, véanse por ejemplo los documentos WO 98/05344, US 5.736.388, US 6.054.312 y WO 99/55720, se tiene que apreciar que el bacteriófago de superficie de la presente invención no se ha modificado para comprender péptidos/proteínas exógenas (es decir péptidos/proteínas no presentes normalmente) en la superficie del fago, diseñado para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos específicos de células. Se debe entender por lo tanto que la superficie del bacteriófago se puede modificar para comprender péptidos/proteínas exógenas no diseñadas para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos específicos de células.

Los presentes inventores han observado que el bacteriófago que no se ha visto modificado para comprender péptidos o ligandos de fijación de diana en la superficie de la partícula de bacteriófago son recogidos por células AP. Así pues, se plantea que el bacteriófago usado de acuerdo con la presente invención sea reconocido como "extraño" y por lo tanto se procese de forma habitual por parte de un sistema inmune del huésped. Además modificando el genoma del bacteriófago para incluir ácido nucleico exógeno capaz de codificar un péptido/proteína extraño, que se trata se de un péptido/proteína normalmente no presente en un huésped mamífero seleccionado, se desencadena una respuesta inmune para esta proteína extraña. Por tanto, el ácido nucleico que codifica el péptido/proteína extraño se expresa (en una célula que presenta antígeno u alguna otra) y se presenta en la superficie de la célula AP. Se tiene que observar que la respuesta inmune puede ser una respuesta inmune humoral (es decir, de anticuerpo) y/o respuesta inmune celular.

El ácido nucleico exógeno se refiere a un polinucleótido de origen no natural que es capaz de ser expresado en forma de un péptido o proteína heterólogo, que se trata de un péptido o proteína que no se expresa normalmente o se expresa a niveles biológicamente significativos en un bacteriófago de origen natural. El péptido o proteína expresado se expresa a un nivel suficiente para facilitar una respuesta inmune en un huésped al...

1. Una formulación que comprende una partícula de bacteriófago lambda, P1, T, Mu, fd, M13 o filamentoso, cuya superficie no se ha modificado para comprender péptidos/proteínas exógenos en la superficie del fago, diseñado para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos de células eucarióticas específicas, y, por lo tanto, un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo la partícula del bacteriófago una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido que es capaz de expresarse y presentarse en la superficie de una célula que presenta antígeno de un organismo bajo el control de un promotor eucariótico, para usar en la provocación de una respuesta inmune profiláctica y/o terapéutica contra el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico exógeno, en un organismo.

2. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso como una vacuna.

3. La formulación de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 que es capaz de provocar una respuesta inmune celular y/o humoral.

4. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para usar en la vacunación contra un virus, bacterias, hongos, levadura, protozoos, helmintos, insectos o encefalopatías espongiformes transmisibles.

5. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para usar en la provocación de una respuesta inmune contra una célula cancerígena por medio de la expresión de un antígeno específico de células cancerígenas.

6. La formulación de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que el bacteriófago comprende reguladores de transcripción y/o traducción para facilitar la expresión del polipéptido.

7. La formulación de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende un promotor eucariótico, tal como CMV, SV40, timidina quinasa o promotor RSV.

8. La formulación de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende el ácido nucleico exógeno bajo control de un promotor constitutivo y un promotor controlable.

9. La formulación de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que el bacteriófago es capaz de expresar copias simples o múltiples de un péptido o una pluralidad de polipéptidos.

10. La formulación de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que el bacteriófago es abortivo para el crecimiento lítico en la flora bacteriana natural del huésped mamífero seleccionado.

11. La formulación de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que además comprende inhibidores de catabolismo enzimático lisosomal/endosomal y/o señales de localización nuclear.

12. La formulación de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que además comprende una cantidad del polipéptido que es expresado por el bacteriófago.

13. La formulación de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que el bacteriófago se ha modificado para expresar un polipéptido en la superficie de la partícula del fago, no estando diseñado dicho polipéptido para dirigir el fago a los receptores en la superficie de los tipos de células eucarióticas específicas.

14. La formulación de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que el ácido nucleico exógeno también codifica un polipéptido capaz de aumentar la respuesta inmune.

15. La formulación de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que además comprende un adyuvante.

16. La formulación de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que el bacteriófago está asociado a un vehículo.

17. La formulación de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para usar en la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad en un humano o animal.

18. Uso de una partícula de bacteriófago lambda, P1, T, Mu, fd, M13 o filamentoso, cuya superficie no se ha modificado para comprender péptidos/proteínas exógenos en la superficie del fago diseñado para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos de células eucarióticas específicas, comprendiendo la partícula del bacteriófago una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido que es capaz de expresarse y presentarse en la superficie de una célula que presenta antígeno de un organismo bajo el control de un promotor eucariótico, para la preparación de un medicamento para provocar una respuesta inmune profiláctica y/o terapéutica contra el polipéptido exógeno expresado en un organismo.

19. Una partícula de bacteriófago lambda, P1, T, Mu, fd, M13 o filamentoso, cuya superficie no se ha modificado para comprender péptidos/proteínas exógenos en la superficie del fago, diseñado para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos de células eucarióticas específicas, comprendiendo la partícula del bacteriófago una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido que es capaz de expresarse y presentarse en la superficie de una célula que presenta antígeno de un organismo bajo el control de un promotor eucariótico, para usar en la provocación de una respuesta inmune profiláctica y/o terapéutica contra el polipéptido exógeno expresado codificado en un organismo.

20. Uso de una partícula de bacteriófago de acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 19 en la que la respuesta inmune es para vacunar el organismo.