Procedimiento de inmovilización de un ADN superenrollado, caracterizado por que comprende los siguientes pasos:

- el depósito de una muestra de ADN superenrollado en la superficie de una película de polímero poroso constituida por una capa delgada de una matriz tridimensional que comprende cadenas de uno o varios polímeros y un disolvente, en el que la matriz incluye intersticios que pueden contener macromoléculas como ADN, y

- la inmovilización del ADN superenrollado por difusión pasiva en dicha película de polímero poroso

Procedimiento de inmovilización del ADN superenrollado y utilización para analizar la reparación del ADN.

La invención se refiere a un procedimiento de inmovilización del ADN superenrollado y a la utilización del ADN superenrollado inmovilizado sobre un soporte, como sustrato para analizar las reacciones enzimáticas de reparación del ADN.

Los biochips se han convertido en herramientas de análisis indispensables para la investigación biomédica y el diagnóstico clínico. Estas herramientas poderosas permiten analizar simultáneamente varias decenas a varios cientos de miles de muestras, usando sondas de ADN (oligonucleótidos, ADNc, productos de amplificación por PCR) o una proteína (anticuerpos, péptidos), inmovilizados sobre un soporte.

Los biochips se preparan usando un soporte (vidrio, polipropileno, poliestireno, silicona, metal, nitrocelulosa o nylon), eventualmente modificado con una película porosa [vidrio cubierto con nylon (Atlas arrays^TM; CLONTECH); silicona cubierta con un hidrogel (Nanochip ^TM; NANOGEN), vidrio cubierto con un gel de polímero de acrilamida HydroGel^TM (PERKIN-ELMER) o de metacrilato (Solicitud de Estados Unidos 2005/0042363)].

Para inmovilizar la sonda de ADN o una proteína sobre el soporte, se han utilizado dos tipos de procedimientos.

*Deposito de sondas previamente sintetizadas e inmovilización por acoplamiento covalente o no covalente

La sonda (oligonucleótido (de 10 a 25 bases), péptido, ADNc o fragmento de amplificación por PCR (como máximo de 500 pb a 0,2 kb), proteína (anticuerpo)) se deposita generalmente sobre el soporte usando un distribuidor automático (Lemmo et al., Current Opinion in Biotechnology, 1998, 9:615-617). La sonda que está cargada también puede depositarse en la superficie de un soporte basado en microelectrodos cubierto con una capa permeable (gel de agarosa) y transportarse al interior del gel, por electroforesis (Heller et al., Electrophoresis, 2000, 21:157-164).

Además, en el caso particular de la técnica de hibridación de colonias sobre filtros (o colony-hybridization; Hana- han y Meselson, Gene, 1983, 10:63-67), las colonias bacterianas depositadas sobre un soporte se transfieren sobre un filtro de nylon o de nitrocelulosa y después se produce la lisis para liberar el ADN (plásmido o cósmido) sobre el filtro.

A continuación la sonda se inmoviliza sobe el soporte por medio de enlaces covalentes o no covalentes (hidrófobos, electroestáticos) o una combinación de ambos.

Los enlaces covalentes se forman generalmente entre los grupos funcionales reactivos de un soporte activado y los de una sonda modificada en uno de sus extremos (grupo fosfato o ácido carboxílico para la sonda y amina para el soporte, y de manera reciproca; grupo amino para la sonda e isotiocianato, aldehído o epoxi, para el soporte; Zammatero et al., Analytical Biochemistry, 2000, 208:143-150).

Cuando el soporte se cubre con una película de poliacrilamida, puede activarse por sustitución de grupos hidracida por tratamiento de hidracina. Las sondas modificadas en 3' por un grupo 3-metil-uridina se oxidan en presencia de peryodato para formar un aldehído reactivo, después éstas se depositan sobre el soporte. La reacción de los grupos aldehído de la sonda con los grupos hidracina del gel forma enlaces covalentes que inmovilizan el ADN en el gel de acrilamida (Khrapo et al., DNA sequence, 1991, 6:375-388; Yershov et al., P. N. A. S., 1996, 93: 4913-4918). También es posible inmovilizar fragmentos de ADN aminados, de longitud inferior a 500 nucleótidos, durante la polimerización del gel (Rubina et al., Anal. Biochem., 2004, 325:92-106).

Los soportes cubiertos con hidrogel permiten aumentar particularmente la capacidad de inmovilización del soporte y mejorar el medio de la sonda, la sensibilidad y el umbral de detección.

Además, la radiación con UV o con agentes acopladores homo o bi-funcionales también pueden formar enlaces covalentes entre los grupos amina de un soporte cubierto con poli-L-lisina y, o los restos de timidina del ADN (UV), o los grupos amina de una sonda modificada (glutaraldehido).

Los enlaces no covalentes comprenden principalmente interacciones electroestáticas entre el ADN y un soporte cubierto con poli-L-lisina.

*Síntesis e inmovilización de las sondas in situ

Este método que se utiliza únicamente para preparar chips de oligonucleótidos (Southern et al., Genomics, 1992, 4, 1008-1017) o de péptidos, permite realizar simultáneamente el acoplamiento covalente y la síntesis de oligonucleótidos sobre una zona que está delimitada, particularmente usando una máscara (mecánica, fotolitográfica).

Esos procedimientos permiten obtener biochips adaptados a numerosas aplicaciones de análisis genético (secuenciación, cartografía, polimorfismo, mutaciones, número de copias de genes, perfil de expresión) y analizar interacciones proteína/ligando (inmuno ensayos; interacciones entre proteínas y moléculas de ADN; ARN o pequeñas moléculas).

Sin embargo, determinados análisis como los de la actividad de reparación del ADN, aplican una sonda de ADN particular, es decir un ADN circular bicatenario superenrollado (plásmido superenrollado), cuya estructura debe conservarse imperativamente durante la inmovilización del ADN sobre el soporte, y conservarse una vez se ha inmovilizado el ADN sobre el soporte. De hecho, el sustrato utilizado para analizar la reparación del ADN es un plásmido superenrollado que presenta lesiones de bases púricas o pirimidínicas (lesiones oxidativas, fotoproductos, aductos químicos), de azúcares, de la estructura de la doble hélice (puentes inter- o intracatenarios, agentes intercalados) y/o roturas, inducidas por tratamiento del plásmido por diferentes agentes genotóxicos, después de la purificación del plásmido superenrollado sobre un gradiente de sacarosa o de cesio. La purificación del plásmido superenrollado permite eliminar los plásmidos que comprenden roturas (estructura relajada). De hecho, a diferencia de otros tipos de lesiones anteriormente citadas que conservan la estructura superenrollada del ADN, las roturas destruyen la estructura superenrollada del plásmido y forman una estructura relajada. El plásmido superenrollado, no tratado (plásmido sin lesión) sirve de control. La muestra biológica a analizar se incuba en presencia de un plásmido superenrollado que comprende lesiones (plásmido lesionado) y de un nucleósido trifosfato marcado. La actividad de reparación del ADN se cuantifica después midiendo la cantidad del marcador incorporado en el plásmido lesionado, por comparación con el plásmido control.

Los sistemas de reparación contenidos en las muestras a analizar reparan las lesiones no dirigidas del ADN y particularmente las roturas (mono- o bicatenarias) aparecidas durante la inmovilización del plásmido sobre un soporte y posteriormente durante la conservación del plásmido inmovilizado sobre un soporte. De esta manera la presencia de roturas, además de las bases modificadas, produce la incorporación de marcadores parásitos que se cuantifican y enmascaran la respuesta de reparación específica de las bases. Por otro lado, las roturas inducen una relajación del plásmido y permiten de esta manera un acceso más fácil a las nucleasas del medio biológico, produciendo un aumento de la actividad de reparación del plásmido. Por último, las estructuras relajadas favorecen la puesta en marcha de la reacción de polimerización no deseada. La reparación de lesiones no dirigidas del ADN y particularmente las roturas pueden enmascarar o interferir de esta manera con la reparación de lesiones específicas. La señal específica de las lesiones estudiadas puede por tanto perderse en el ruido de fondo generado por las señales no específicas, dificultando el análisis de la reparación del ADN, es decir imposible.

La mayoría de los procedimientos de preparación de biochips no permiten inmovilizar ADN de gran tamaño que presente una estructura particular como los plásmidos (ADN circular superenrollado) conservando su integridad.

De hecho, la inmovilización del ADN superenrollado por acoplamiento no covalente sobre las laminas cubiertas con poli-L-lisina tal como describe la Solicitud de Patente FR 02 16435, no permite conservar la estructura del ADN de manera estable y los soportes que comprenden el plásmido inmovilizado deben utilizarse inmediatamente después de la inmovilización del ADN, lo que limita su utilización industrial. Las...

1. Procedimiento de inmovilización de un ADN superenrollado, caracterizado por que comprende los siguientes pasos:

- el depósito de una muestra de ADN superenrollado en la superficie de una película de polímero poroso constituida por una capa delgada de una matriz tridimensional que comprende cadenas de uno o varios polímeros y un disolvente, en el que la matriz incluye intersticios que pueden contener macromoléculas como ADN, y

- la inmovilización del ADN superenrollado por difusión pasiva en dicha película de polímero poroso.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el polímero poroso es un hidrogel de poliacrilamida.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que el hidrogel de poliacrilamida comprende del 5 al 15% de una mezcla de acrilamida: metileno bis acrilamida 50:1 a 5:1.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que el hidrogel de poliacrilamida comprende del 5 al 15% de una mezcla de acrilamida: metileno bis acrilamida 19:1.

5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la película de polímero comprende del 0,1% al 5% de adsorbente (o adsorbentes) de ADN.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que el adsorbente es un polisacárido.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que el adsorbente es agarosa.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que el adsorbente es agarosa de bajo punto de fusión.

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado por que el hidrogel de poliacrilamida comprende el 10% de una mezcla de acrilamida: metileno bis acrilamida 19:1 y el 0,8% de agarosa de bajo punto de fusión.

10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que dicho ADN superenrollado es un plásmido.

11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que dicho ADN superenrollado comprende lesiones inducidas por un agente genotóxico.

12. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que la película de polímero poroso se deposita sobre un soporte apropiado.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por que dicho soporte es una lámina de vidrio.

14. Soporte cubierto con una película de polímero poroso que comprende un ADN superenrollado inmovilizado, que puede obtenerse por el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13.

15. Soporte de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado por que se trata de una lámina de vidrio cubierta con un hidrogel de poliacrilamida que comprende un ADN superenrollado lesionado.

16. Utilización de una composición acuosa que comprende el 10% de una mezcla de acrilamida: metileno bis acrilamida 19:1 y el 0,8% de agarosa de bajo punto de fusión para inmovilizar el ADN superenrollado.

17. Utilización de un ADN superenrollado inmovilizado en una película de polímero poroso tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, como sustrato para analizar la reparación del ADN.