EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS USANDO PARTICULAS DE DIAMETRO PEQUEÑO MAGNETICAMENTE RESPONDEDORAS.
Un procedimiento para unir de forma reversible al menos una molécula de ácido nucleico,
que comprende:
(i) crear una mezcla en un contenedor, en el que la mezcla comprende una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, al menos una partícula magnéticamente respondedora que tiene un diámetro de aproximadamente 0,1 µm a aproximadamente 0,3 µm, y un resto; y
(ii) proporcionar la mezcla con un pH ácido, de modo que se alteran las propiedades de carga superficial de la al menos una partícula respondedora magnéticamente; en el que la alteración en las propiedades de carga superficial de la al menos una partícula respondedora magnéticamente es tal que la al menos una molécula de ácido nucleico pasa a unirse de forma inespecífica a la al menos una partícula magnéticamente respondedora para formar un complejo
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E05103113.
Solicitante: BECTON, DICKINSON AND COMPANY.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 1 BECTON DRIVE,FRANKLIN LAKES, NEW JERSEY 074.
Inventor/es: COLLIS, MATTHEW P., FORT,THOMAS L.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 19 de Abril de 2005.
Fecha Concesión Europea: 18 de Noviembre de 2009.
Clasificación PCT:
- C12N15/10 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Clasificación antigua:
- C12N15/10 C12N 15/00 […] › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
- C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
Fragmento de la descripción:
Extracción de ácidos nucleicos usando partículas de diámetro pequeño magnéticamente respondedoras.
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad bajo 35 U.S.C.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a tecnología de comunicación de pluralidad está dirigida a composiciones y procedimientos para extraer sustancias de una muestra. Más particularmente, la presente invención está dirigida a composiciones y procedimientos para extraer ácidos nucleicos de muestras mediante unión reversible con partículas de diámetro pequeño respondedoras magnéticamente.
Antecedentes de la invención
En la discusión siguiente se describirán ciertos artículos y procedimientos para fines básicos e introductorios. Nada de lo contenido en la presente memoria descriptiva debe interpretarse como una "admisión" de la técnica anterior. El solicitante se reserva expresamente el derecho de demostrar, cuando sea adecuado, que los artículos y procedimientos a los que se hace referencia en la presente memoria descriptiva no constituyen técnica anterior bajo las condiciones reglamentarias aplicables.
El aislamiento y/o separación de ácidos nucleicos es un trabajo necesario en muchos procedimientos diagnósticos y bioquímicos. Entre las técnicas conocidas para conseguir este objetivo se incluyen la lisis de materiales biológicos para liberar los ácidos nucleicos contenidos en los mismos, seguido por la eliminación o separación de al menos una porción del ácido nucleico.
El ácido nucleico se puede separar y/o eliminar mediante una serie de diferentes técnicas. Una de estas técnicas implica la unión reversible del ácido nucleico a partículas magnéticas. Las patentes de EE.UU. Nº 5.973.138 y 6.433.160, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad, también son ilustrativos de las técnicas de separación que utilizan partículas respondedoras magnéticamente.
Aunque dichas técnicas generalmente son eficaces, todavía queda mucho por mejorar. Por ejemplo, la aplicación de un campo magnético a las partículas magnéticas descritas en lo que antecede puede hacer que las partículas se "agrupen" juntos. Se cree que este agrupamiento se debe a la atracción magnética residual retenida por las partículas después de eliminar el campo magnético. Este fenómeno requiere la aplicación de un procedimiento de "desmagnetización" para eliminar el agrupamiento de las partículas.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona composiciones y técnicas que son eficaces en prevenir el agrupamiento o agregación de partículas respondedoras magnéticamente, de modo que se evita la necesidad de un procedimiento de desmagnetización.
De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para unir de forma reversible al menos una molécula de ácido nucleico, que comprende: crear una mezcla en un contenedor, en la que la mezcla comprende la muestra, al menos una partícula respondedora magnéticamente, y un resto; y proporcionar la mezcla con un pH inferior a aproximadamente 7,0, de modo que se alteran las propiedades de carga superficial de al menos una partícula magnéticamente respondedora. La alteración en las propiedades de carga superficial de al menos una partícula respondedora magnéticamente hace que al menos una molécula de ácido nucleico se una de forma inespecífica a al menos una partícula respondedora magnéticamente para formar un complejo. Preferentemente, la al menos una partícula respondedora magnéticamente está sin recubrir, sin tratar, carece de modificación en la superficie y tiene un diámetro de aproximadamente 0,1 µm a aproximadamente 0,3 µm.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la unión reversible de al menos una molécula de ácido nucleico, que comprende: (i) crear una mezcla en un contenedor, en la que la mezcla comprende una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, al menos una partícula respondedora magnéticamente que tiene un diámetro de aproximadamente 0,1 µm a aproximadamente 0,3 µm, y un resto; (ii) proporcionar la mezcla con un pH ácido, de modo que se alteran las propiedades de carga superficial de al menos una partícula magnéticamente respondedora, en la que la alteración en las propiedades de carga superficial de al menos una partícula respondedora magnéticamente hace que la al menos una molécula de ácido nucleico se una de forma inespecífica a la al menos una partícula respondedora magnéticamente para formar un complejo; (iii) aplicar un campo magnético al complejo; (iv) eliminar el resto de la mezcla del contenedor mientras se aplica el campo magnético al complejo; (v) eluir la al menos una molécula de ácido nucleico de la al menos una partícula respondedora magnéticamente; y (vi) reaplicar el campo magnético a la al menos una partícula respondedora magnéticamente eluida, de modo que se separa la al menos una partícula respondedora magnéticamente de la al menos una molécula de ácido nucleico.
Breve descripción de la figura
Las características anteriores y de otro tipo, aspectos y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción, las reivindicaciones adjuntas y las formas de realización ejemplo que se muestran en las figuras, que se describen brevemente a continuación. Debe observarse que, a menos que se especifique lo contrario, elementos similares tienen los mismos números de referencia.
La Fig. 1 es una ilustración esquemática de una forma de realización de un procedimiento realizado de acuerdo con los principios de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
Los principios de la presente invención se describirán con más detalle mediante la siguiente discusión de ciertas formas de realización ilustrativas y por referencia a la figura anterior.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, "ácido nucleico" significa ácido desoxirribonucleico (ADN), ribonucleico (ARN) o cualquier modificación natural o sintética de los mismos, así como combinaciones de los anteriores.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, "muestra" significa cualquier sustancia que contiene ácido nucleico, incluidas, entre otras, sangre, plasma, suero, orina, aspirados de médula ósea, líquido cefalorraquídeo, tejido, células, heces, saliva, secreciones orales, secreciones nasales, lavado bronquial, pelo, fluidos cervicales, fluidos vaginales, semen, esputo y fluidos linfáticos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, "partícula magnéticamente respondedora" significa una partícula a la que se puede impartir un momento magnético o, de otro modo, que se puede mover bajo la acción de un campo magnético. Entre dichas partículas se incluyen hidróxido férrico, óxido ferrosoférrico, sulfuro de hierro y cloruro de hierro.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, "unido de forma inespecífica" significa que el mecanismo de unión no se produce a través de un receptor, agente de captura, o similares, que se acoplaría de forma selectiva únicamente con un agente específico.
Las partículas magnéticamente respondedoras de la presente invención pueden estar sin recubrir, sin tratar y/o carecer de cualquier tipo de modificación en la superficie. Las partículas magnéticamente respondedoras de la presente invención se unen de forma inespecífica al ácido nucleico, es decir se unen al mismo de forma inespecífica en ciertas condiciones.
El solicitante ha descubierto que cuando están en un entorno ácido, las partículas magnéticamente respondedoras se unirán de forma reversible a los ácidos nucleicos. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, el solicitante cree que un entorno ácido aumenta la naturaleza electropositiva de las partículas, de modo que se incrementa la unión de las partículas a los ácidos nucleicos electronegativos.
Como se ha indicado anteriormente, de acuerdo con otra forma de realización, preferentemente las partículas magnéticamente respondedoras de la presente invención están sin recubrir, sin tratar y/o carecen de modificación en la superficie. Por tanto, las partículas se unen de modo inespecífico a los ácidos nucleicos. Por tanto, las partículas son útiles en la presente invención y el hierro puede ser un óxido de hierro de formas tales como hidróxido...
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para unir de forma reversible al menos una molécula de ácido nucleico, que comprende:
- (i) crear una mezcla en un contenedor, en el que la mezcla comprende una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, al menos una partícula magnéticamente respondedora que tiene un diámetro de aproximadamente 0,1 µm a aproximadamente 0,3 µm, y un resto; y
- (ii) proporcionar la mezcla con un pH ácido, de modo que se alteran las propiedades de carga superficial de la al menos una partícula respondedora magnéticamente;
en el que la alteración en las propiedades de carga superficial de la al menos una partícula respondedora magnéticamente es tal que la al menos una molécula de ácido nucleico pasa a unirse de forma inespecífica a la al menos una partícula magnéticamente respondedora para formar un complejo.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la al menos una partícula magnéticamente respondedora está sin recubrir, sin tratar y carece de modificación de superficie.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa (i) comprende añadir la al menos una partícula magnéticamente respondedora al contenedor, añadiendo un agente de lisis al contenedor, añadiendo la muestra al contenedor, y mezclando.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la al menos una partícula magnéticamente respondedora comprende una partícula de óxido de hierro.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la al menos una partícula magnéticamente respondedora tiene un diámetro de aproximadamente 0,3 µm.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende la etapa de aplicar un campo magnético al complejo.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, que además comprende la etapa adicional de eluir la al menos una molécula de ácido nucleico de la al menos una partícula magnéticamente respondedora.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la etapa de eluir comprende añadir una solución tampón al contenedor.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, que además comprende la etapa de volver a aplicar un campo magnético a la al menos una partícula magnéticamente respondedora eluida, de modo que se separa la al menos una partícula magnéticamente respondedora de la al menos una molécula de ácido nucleico.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, que además comprende al menos uno de PCR, SDA, tSDA, 3SR, NASBA, Qß, LCR y TMA.
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