Dermis artificial (1) obtenida a partir de plasma con plaquetas (2) y fibroblastos (3) humanos.

El plasma con plaquetas (2) se obtiene por fraccionamiento de la sangre total (4) del paciente (8) mediante centrifugación ligera, y los fibroblastos (3) humanos a partir de una biopsia de piel (5). La gelificación se consigue mediante la adición de calcio. Esta dermis artificial (1) permite un crecimiento rápido de los queratinocitos (6) sembrados en su superficie para constituir una piel artificial (7) que es fácilmente trasplantable. Se consiguen grandes superficies de dermis artificial (1) a partir de una pequeña biopsia de piel (5) y de cantidades mínimas de plasma con plaquetas (2), que al estar enriquecido en citoquinas y factores de crecimiento plaquetario potencia la proliferación de las células sembradas, tanto en su interior como en su superficie. La piel artificial (7) asi obtenida puede servir para el tratamiento de grandes quemados, úlceras cutáneas crónicas... o utilizarse, mediante el empleo de células genéticamente modificadas, como base para terapia génica

Dermis artificial y método de obtención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una dermis artificial realizada por gelificación del plasma con plaquetas, mediante la adición de calcio y en la que se siembran fibroblastos u otras células dérmicas. En la superficie de esta dermis artificial pueden sembrarse, a su vez, queratinocitos lo que la hace especialmente útil como piel artificial para el tratamiento de grandes quemados, úlceras crónicas, ensayos de susceptibilidad a diversos productos, etc. Mediante el empleo de células genéticamente modificadas puede utilizarse como base para terapia génica.

Antecedentes de la invención

La piel es un tejido compuesto por dos partes, el epitelio o parte externa y la dermis o parte interna sobre la que esta situada el epitelio. Estas dos partes se diferencian claramente por sus características, en la epidermis no existe casi tejido extracelular, mientras que en la dermis predomina claramente este componente frente a las células.

La piel es un tejido que se puede reconstruir mediante técnicas de ingeniera tisular (Parenteau N, Sci Am, 280: 83-84, 1999). En estas técnicas, en general, el componente celular se genera ex vivo mediante técnicas de cultivo celular. Estas técnicas permiten, a partir de un corto número de células extraídas de una pequeña biopsia cutánea, conseguir en un periodo de tiempo corto un gran número de células. Estas células expandidas ex vivo pueden ser empleadas en la construcción de grandes superficies de piel artificial. La matriz extracelular no puede ser producida mediante cultivo celular, sino que es previamente diseñada y fabricada fuera del organismo. La matriz extracelular tiene que ser capaz de proporcionar estructuras que faciliten la adhesión de las células dérmicas previamente cultivadas y estimular el crecimiento normal de estas células. Sobre esta matriz artificial, las células comienzan a fabricar las proteínas normales que constituyen la matriz dérmica natural y, al mismo tiempo, van degradando lentamente la estructura original, de manera que a lo largo del tiempo esta matriz artificial suministrada sea sustituida por una verdadera matriz extracelular en todo similar a la natural. Sobre esta matriz artificial se pueden sembrar las células epiteliales previamente cultivadas (queratinocitos en el caso de la piel), donde por nuevas técnicas de cultivo celular estas células son capaces de generar una estructura muy similar al epitelio normal de donde se originaron. En resumen, una de las claves en la ingeniera tisular de la piel es el diseño de matrices dérmicas que imiten lo más posible las condiciones naturales del organismo y donde las células introducidas en la misma sean capaces de iniciar un proceso complejo, cuyo fin es el desarrollar una estructura lo más similar posible a la piel natural. La otra clave importante en la ingeniera tisular de la piel es la capacidad de la matriz dérmica para facilitar el crecimiento de las células sembradas en ella. El desarrollar matrices dérmicas que fomenten el crecimiento de las células tanto dérmicas como epidérmicas, conseguiría que a partir de una mínima biopsia se puedan cultivar grandes superficies de piel artificial.

Este hecho tiene especial importancia cuando la piel artificial está destinada a tratamiento de grandes quemados en los que hay que reponer lo más rápidamente posible hasta el 90-95% de la superficie corporal total a partir de las escasas zonas de piel sana que le quedan al paciente. La escasez de matrices dérmicas capaces de generar estas amplias superficies de piel artificial a partir de mínimas biopsias, constituye una de las limitaciones que presentan muchas matrices dérmicas previamente descritas (Sheridan R and Tompkins, Burns 25:97-103, 1999).

Existen varios modelos de dermis artificiales. Algunos de los modelos previamente utilizados se describen sucintamente:

La fibrina y/o los geles realizados tras la coagulación de las proteínas del plasma Humano han sido utilizados como vehículo para trasplantar células cutáneas previamente expandidas in vitro (Sadaki I, JP10277143). La fibrina puede ser también utilizada como base dérmica destinada a la producción de grandes superficies de piel cultivada (Meana et al, Burns 24: 621-630, 1998). En el interior de los geles de fibrina los fibroblastos sembrados son capaces de crecer. Al mismo tiempo estos fibroblastos se comportan como auténticos inductores del crecimiento de los queratinocitos, de forma que sembrando un número muy limitado de queratinocitos cultivados sobre un gel de fibrina y fibroblastos se obtiene en 8-12 días de cultivo un epitelio confluente estratificado que remeda el epitelio humano normal. Esta capacidad de los geles de fibrina para que las células epiteliales se desarrollen ha sido utilizada en otro modelo de piel artificial (Meana et al, P9701533). Además la fibrina puede utilizarse en presencia de otros componentes que aumenten la rigidez de la misma y faciliten su uso como soporte dérmico (Meana A, P9601684). Esta capacidad de los geles de fibrina y fibroblastos para conseguir grandes superficies de piel artificial a partir de una mínima biopsia cutánea no la presentan los modelos basados en dermis artificiales de composición diferente. La explicación a este hecho es que los geles basados en fibrina imitan más el mecanismo fisiológico de reparación de heridas (Martin P, Science 276: 75-81,1997).

Sin embargo, la fabricación de la matriz dérmica a base de concentrados de fibrina es solamente una imitación del proceso fisiológico. El verdadero coágulo de fibrina que se forma como parte del mecanismo de defensa y reparación tisular, se realiza a expensas del plasma sanguíneo En la fracción extracelular de la sangre existen múltiples proteínas, una de ellas, el fibrinógeno, es el precursor soluble de la fibrina, principal proteína, aunque no única del coágulo. La extravasación del plasma tras la agresión de un tejido es una de las maneras de desencadenar toda la cascada de la coagulación. Cuando la agresión se produce y los productos tisulares entran en contacto con la sangre, se activa la denominada vía extrínseca de la coagulación, el resultado final es la activación del precursor inactivo de la trombina presente en el plasma, esta trombina inicia la conversión de fibrinógeno en fibrina y más tarde en fibrina insoluble que unida a células sanguíneas forman parte del coágulo de fibrina, el primer eslabón para la cura y posterior reparación de la lesión producida en el organismo (Singer y Clark, N Engl J Med, 341:738-746, 1999). De las células que intervienen en la formación del coágulo hay que destacar las plaquetas, estas células son un importante reservorio de citoquinas, sustancias responsables del inicio de la respuesta celular en el proceso de reparación final de las heridas. Las plaquetas también intervienen en el desarrollo del coágulo de fibrina en el interior de los vasos, es la llamada vía intrínseca de la coagulación,...

1. Un método para obtener dermis artificial que comprende los pasos de:

2. El método de la reivindicación 1, donde los fibroblastos son añadidos en la concentración inicial de entre 500 y 4000 fibroblastos por cm².

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el método comprende el paso de sembrar el gel con queranocitos.

4. El método de la reivindicación 3, donde los queranocitos se cultivan durante 8 a 12 días en el gel, o hasta que los queranocitos son preconfluentes o confluentes, produciendo piel artificial.

5. El método de cualquier reivindicación precedente, donde la concentración final de fibrinógeno en el gel es de entre 0.4 y 2 mg/ml.

6. El método de cualquier reivindicación precedente, donde el plasma, las plaquetas, los fibroblastos y los queranocitos se obtienen del mismo individuo.

7. Una dermis artificial que comprende un gel de plasma humano gelificado, plaquetas y fibroblastos dermales humanos cultivados.

8. Una dermis artificial según la reivindicación 7, donde los fibroblastos son fibroblastos homólogos o fibroblastos autólogos.

9. Una dermis artificial según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que comprende queranocitos.

10. Una piel artificial, donde la dermis artificial según la reivindicación 9 comprende además un epitelio estratificado.

11. Una piel artificial según la reivindicación 10, que comprende una parte superior de células epiteliales estratificadas y una parte inferior que consiste de una matriz extracelular densamente poblada con fibroblastos.

12. Una dermis artificial o piel de cualquier reivindicación anterior para uso en terapia.

13. La dermis artificial o piel según la reivindicación 12, donde el plasma con plaquetas y/o queranocitos provienen del paciente en el que la dermis artificial o piel será usada.