Construcción peptídica dendrimérica para la prevención de la fiebre aftosa en animales.

Esta construcción es una de fórmula (I) en donde: T es un péptido que comprende la secuencia SEC ID NO: 1 ó un fragmento de la misma; B es un péptido que comprende la secuencia SEC ID NO: 2 ó un fragmento de la misma; X es un grupo acilo unido al extremo N-terminal de B; n es 3 ó 4; y L corresponde a un núcleo de lisinas de fórmula (II) en donde W es un grupo conector; Z1-Z4 son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan del grupo que consiste en cisteína y OH, con la condición que al menos tres de los grupos Z1 a Z4 sean cisteína; enlazándose B al núcleo de lisinas por su extremo C-terminal y T enlazándose a dicho núcleo por su extremo N-terminal

Construcción peptídica dendrimérica para la prevención de la fiebre aftosa en animales.

Esta invención se relaciona con el campo de la veterinaria en general y específicamente con la inmunología y la síntesis química. En particular, la presente invención se refiere a una construcción peptídica dendrimérica, a un procedimiento para su preparación así como a las aplicaciones derivadas de su uso como inmunógeno.

Estado de la técnica anterior

El virus de la fiebre aftosa (también abreviado como VFA, en inglés "foot-and-mouth disease virus", FMDV) es un picornavirus que produce una enfermedad altamente transmisible y devastadora en el ganado doméstico, principalmente en vacas, ovejas y cerdos.

En los animales el virus penetra por el epitelio (puede ser por la boca o las vías respiratorias). Llega a la sangre y provoca fiebre en los primeros días para posteriormente aparecer vesículas en boca, morro, espacios interdigitales, pezones, mamas y zonas de piel fina en general; las vesículas se rompen dejando un afta o erosión que luego se cubre de piel. Las heridas o aftas se suelen infectar por bacterias y esto dificulta mucho la curación y el restablecimiento de los animales. Las infecciones secundarias pueden dar lugar a mamitis, desprendimiento de la pezuña, etc., que complican y comprometen la supervivencia del animal. Si no hubiera infecciones secundarias, la enfermedad por sí misma no causaría tantas bajas.

La partícula del VFA contiene una cadena de RNA de polaridad positiva de unos 8.500 nucleótidos, que se encuentra incluida en la cápside icosaédrica compuesta por 60 copias de cada una de las cuatro proteínas virales VP1-4. El RNA genómico codifica una única poliproteína a partir de la cual se generan las diferentes proteínas virales, mediante procesamiento proteolítico debido a la acción de diferentes proteasas virales, entre las que se incluyen nueve proteínas no-estructurales (NSP) maduras. Cada una de estas NSP, así como algunos de sus polipéptidos precursores, están implicados en funciones importantes para el ciclo de multiplicación vírico en las células infectadas. El VFA presenta una elevada variabilidad genética y antigénica, que se refleja en la existencia de siete serotipos y numerosas variantes.

Por otro lado, ha sido caracterizada en detalle la estructura antigénica del VFA, tal como es reconocida por linfocitos B. El principal epítopo B considerado como el principal inmunógeno del virus (contra el que van la mayoría de anticuerpos, especialmente los neutralizantes), localizado en uno de los motivos estructurales definidos en la superficie de la cápside, es continuo e inmunodominante (sitio A) y se sitúa en el bucle G-H, en torno a las posiciones 140-160 de la proteína VP1 (cfr. Bittle J.L. et al., "Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence", Nature 1982, vol. 298, pp. 30-33). Dicho epítopo ha sido utilizado como inmunógeno en diversos estudios (cfr. Brown F., "New approaches to vaccination against foot-and-mouth disease", Vaccine 1992, vol. 10(14), pp. 1022-1026). En 1986, DiMarchi y colaboradores (cfr. DiMarchi et al., "Protection of cattle against foot-and-mouth disease by synthetic peptides", Science 1986, vol. 232, pp. 639-641) obtuvieron protección frente al desafío viral, en vacas inmunizadas con un péptido en el que los residuos 140-160 de la proteína VP1 se sintetizaron colinealmente con los residuos de las posiciones 200-213 de la misma proteína. Sin embargo, trabajos posteriores empleando un número significativo de animales mostraron limitaciones en la protección inducida por este epítopo peptídico en hospedadores naturales del VFA (cfr. Barteling S.J, "Possibilities and limitations of synthetic peptide vaccines", Adv. Biotechnol. Processes. 1988, vol. 10, pp. 25-60).

Se han identificado además, varios epítopos T celulares reconocidos por linfocitos de cerdos infectados con el VFA, en proteínas no estructurales (cfr. Blanco E. et al., "Immunodominant T Cell epitopes in non-structural polypeptides of Foot-and-mouth Disease Virus", Journal of Virology 2001, vol. 75, pp. 3164-3174). Entre ellos, el epítopo T de la proteína 3A[21-35] , sintetizado colinealmente con el epítopo B de VP1 [137-156], fue capaz de estimular eficientemente linfocitos de un animal infectado e inducir niveles significativos de actividad neutralizadora del virus in vitro, específica de serotipo.

Por un lado, el problema de la infección provocada por el virus de la fiebre aftosa, que ha causado tanta alarma sanitaria, es que es muy contagiosa. Los animales infectados liberan virus por la saliva (además suele haber salivación abundante en esta enfermedad), en la orina y en las heces; al romperse las vesículas, éstas liberan también virus de su interior. También la leche y la carne contienen virus. Todo ello hace que lo que está en contacto con el animal se contamine fácilmente: suelo, útiles, vehículos, carne, etc. Además, en determinadas condiciones, el virus es muy resistente. Todo esto hace que sea muy fácil la transmisión de la enfermedad al personal que trata a los animales. Por tanto, es necesario tomar estrictas medidas de precaución, para evitar el contagio y dispersión de ésta enfermedad que, aunque no es peligrosa para el hombre, sí que puede ocasionar grandes pérdidas económicas.

Actualmente, el control de la fiebre aftosa se lleva a cabo, fundamentalmente, mediante el empleo de vacunas basadas en el virus inactivado. Tanto la infección por VFA como la inmunización basada en estas vacunas inducen, habitualmente, altos niveles de anticuerpos circulantes específicos que se correlacionan con la protección frente al virus homólogo y virus antigénicamente relacionados.

Por otro lado, a pesar de los avances realizados en los últimos años, las vacunas conocidas y utilizadas hasta hoy presentan limitaciones, como son el requerimiento de una cadena de frío para preservar su estabilidad, la necesidad de revacunaciones periódicas, el riesgo de liberación de virus infeccioso durante su producción, y su carácter no-marcador, es decir la dificultad para distinguir serológicamente animales infectados de aquéllos que han sido vacunados.

Estas limitaciones llevan a la búsqueda de inmunógenos alternativos y seguros.

Explicación de la invención

Los inventores de la presente invención han diseñado una construcción peptídica dendrimérica la cual administrada a los animales, y en particular a los cerdos, genera una respuesta del sistema inmune que resulta efectiva, proporcionando una protección total contra el virus de la fiebre aftosa.

Así, en un primer aspecto la presente invención se refiere a una construcción peptídica dendrimérica de fórmula (I):

(I)(X-B)_n-L-T

donde

T es un péptido que comprende la secuencia SEC ID NO: 1;

B es un péptido que comprende la secuencia SEC ID NO: 2;

X es un grupo acilo el cual está unido al extremo N-terminal del péptido B;

n es 3 ó 4; y

L corresponde a un núcleo de lisinas de fórmula (II)

enlazándose el péptido B al núcleo de lisinas por su extremo C-terminal al residuo de cisteína y el péptido T enlazándose a dicho núcleo de lisinas por su extremo N-terminal.

La secuencia SEC ID NO: 1 corresponde al epítopo T de la proteína no estructural 3A (residuos 21-35) del VFA.

La secuencia SEC ID NO: 2 corresponde al epítopo B de la proteína de la cápside VP1 (residuos 136-153) del VFA, también denominado sitio antigenico A.

En la presente invención por "grupo conector" se entiende una unidad bifuncional que permite durante la síntesis de la construcción peptídica dendrimérica unir el péptido B al núcleo de lisinas (a través de Z₁-Z₄),...

1. Construcción peptídica dendrimérica de fórmula (I):

(I)(X-B)_n-L-T

donde

T es un péptido que comprende la secuencia SEC ID NO: 1;

B es un péptido que comprende la secuencia SEC ID NO: 2;

X es un grupo acilo el cual está unido al extremo N-terminal del péptido B;

n es 3 ó 4; y

L corresponde a un núcleo de lisinas de fórmula (II)

enlazándose el péptido B al núcleo de lisinas por su extremo C-terminal al residuo de cisteína y el péptido T enlazándose a dicho núcleo de lisinas por su extremo N-terminal.

2. Construcción según la reivindicación 2, donde

T es un péptido de secuencia SEC ID NO: 1, y

B es un péptido de secuencia SEC ID NO: 2.

3. Construcción según la reivindicación 1, donde X es acetilo.

4. Construcción según la reivindicación 1, donde W es un grupo -(CH₂)_n-CO-, siendo n un número entero comprendido entre 1 y 3.

5. Construcción según la reivindicación 4, donde W es -CH₂CO-.

6. Construcción según la reivindicación 1, donde L representa:

donde cada cisteína está unida al grupo conector CH₂CO a través de su cadena lateral mediante un enlace tioéter.

7. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene la fórmula (III):

donde

T es un péptido de secuencia SEC ID NO:1;

B es un péptido de secuencia SEC ID NO: 2; y

X es acetilo.

8. Procedimiento de preparación de una construcción peptidica dendrimérica definida en cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende la reacción de ligación de un péptido de fórmula (IV):

con un péptido de fórmula (V),

(V)X-B-Cys

donde

Cl es cloro, y

T, X, W y B se definen en cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

y donde la reacción de ligación se lleva a cabo en presencia de un agente caotrópico y a un pH comprendido entre 8 y 9.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, donde la reacción se lleva a cabo a un pH de 8.5.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, donde el agente caotrópico es hidrocloruro de guanidinio.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8-10, donde el péptido de fórmula (V) se encuentra en un exceso molar respecto el péptido de fórmula (IV) comprendido entre 3 y 5.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8-11, donde la reacción se lleva a cabo además en presencia de un agente reductor.

13. Procedimiento según la reivindicación 12 donde el agente reductor es tris-carbetoxietilfosfina.

14. Construcción peptidica dendrimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para utilizar como inmunógeno.

15. Composición veterinaria que comprende una cantidad efectiva de al menos una construcción peptídica dendrimérica definida en cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

16. Composición según la reivindicación 15, que comprende cantidades adecuadas de al menos un adyuvante para su administración en forma de vacuna.

17. Uso de una construcción peptídica dendrimérica definida en cualquiera de las reivindicaciones 1-7 como inmunógeno.

18. Uso de una construcción peptídica dendrimérica definida en cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la fabricación de un medicamento destinado a la prevención de la fiebre aftosa en un animal.

19. Uso según la reivindicación 18, donde el animal es un cerdo.