Una composición de matriz extracelular para revestir una superficie en la que el pH de la composición se encuentra entre 7,

8 y 8,5, comprendiendo la composición - una matriz extracelular; y - al menos un componente exógeno que se escoge en el grupo formado por fibronectina presente en concentraciones de 5 mg/ml a 20 mg/ml de la composición, heparina presente en concentraciones de 200 mg/ml a 800 mg/ml de la composición y laminina presente en concentraciones de 1 mg/ml a 10 mg/ml de la composición

Campo del invento

En general el presente invento se refiere a una composición de matriz extracelular y a un sistema de cultivo celular que permiten evaluar los efectos de estimuladores potenciales

o inhibidores sobre varios cultivos celulares.

Antecedentes del invento

La recogida de células procedentes de tejidos para su mantenimiento y propagación in vitro mediante cultivos celulares constituye una importante herramienta en investigación médica y bioquímica. El cultivo tisular es una técnica o proceso de proliferación y/o de apoyo del metabolismo de tejidos o células procedentes de organismos (plantas o animales) en un entorno nutritivo sometido a una formulación concreta. Una vez que se ha procedido al aislamiento mediante disociación discreta del tejido, se incuban las células en un medio nutritivo capaz de contribuir al desarrollo de las funciones vitales. Salvo pocas excepciones, es necesario que las células se unan a un substrato con el fin de desarrollar las funciones metabólicas normales, proliferar y dividirse. En el tejido, el substrato que proporciona el apoyo para la proliferación celular es bien la membrana basal o bien la matriz intersticial. Las membranas basales no sólo actúan como estructuras físicas de andamiaje y filtros moleculares, sino también como reguladores de fase sólida de varios procesos celulares, incluyendo la unión, motilidad y la diferenciación. Las membranas basales también pueden modular la proliferación celular actuando como reservas para los factores de crecimiento y prolongando su semivida in vivo.

La membrana basal es una tipo específico de matriz extracelular y está formada principalmente por laminina y colágeno de tipo IV. Los cuatro componentes principales de la matriz, característicos de las matrices basales, incluyen laminina, colágeno IV, entactina, nidógeno y proteoglucanos de sulfato de heparan (HSPG). Las membranas basales también contienen un número de factores de crecimiento, tales como EGF, IGF-1, PDGF, TGF-beta, VEGF y bFGF. Ejemplos de matrices extracelulares derivadas de membranas basales disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, gel de ECM de Sigma-Aldrich ó Matrigel® de Becton, Dickinson & Company, que se extrae del tumor de ratón EnglebrethHolm-Swarm (EHS). Este tumor de ratón es rico en proteínas de la membrana basal. A temperatura ambiente, la Matriz Matrigel® da lugar a la formación de gel con el fin de generar membrana basal reconstituida y resulta similar en estructura, composición, propiedades físicas y capacidad para retener las características funcionales típicas de las membranas basales in vivo.

La matriz Matrigel® contribuye a la diferenciación de muchos tipos celulares, incluyendo las células endoteliales, células epiteliales, neuronas y hepatocitos. Cuando se colocan células endoteliales sobre placas de Matrigel®, las células dejan de proliferar y exhiben elevada motilidad y comunicación célula-célula. Además, las células se alinean y forman una red tridimensional de estructuras en forma de tubo o de conducto. Se ha utilizado la formación de estas estructuras como modelo en la diferenciación de células endoteliales, así como también la etapa final de cascada angiogénica.

La utilización de Matrigel® en los ensayos de formación de tubos de células endoteliales es una de las principales aplicaciones in vivo de la matriz Matrigel®. En estos ensayos, se mide el alcance de la longitud del tubo de las células endoteliales y se emplea como indicador de la formación de tubo en las células endoteliales. Sobre la diferenciación típica de células de matriz extracelular, la formación de tubos celulares puede tener lugar incluso en ausencia de factores de crecimiento añadidos de forma exógena, debido a la presencia de factores de crecimiento en la matriz. Esto ha limitado la aplicación de la matriz extracelular a estudios que implican efectos inhibidores. En particular, ha resultado difícil estudiar efectos estimuladores ya que la formación de tubo de fondo es demasiado elevada. Como resultado de ello, de momento los ensayos de formación de tubo no han resultado suficientemente sensibles para los estudios de estimulación.

De este modo, es objeto del presente invento proporcionar una composición de matriz extracelular modificada procedente de membrana basal reconstituida para reducir la formación de tubo de fondo, en ausencia de factores de crecimiento añadidos, mediante alteración de la estructura de la matriz y/o mediante secuestro o bloqueo de la accesibilidad que los factores de crecimiento tienen a las células en el seno de la composición.

Otro objeto del presente invento es proporcionar un sistema de cultivo celular que permita la evaluación directa de estimuladores potenciales de angiogénesis, así como también de inhibidores de sus efectos sobre la formación de tubos celulares en células endoteliales y otros tipos de células. También resultaría beneficioso proporcionar un sistema de ensayo para estudiar los mecanismos de acción de estos agentes estimuladores e inhibidores.

De manera adicional, un objeto del presente invento es proporcionar un sistema de ensayo que sea rápido y rentable y que aumente de forma considerable el intervalo dinámico de señal.

Sumario del invento

El presente invento se refiere a una composición de matriz extracelular reconstituida y modificada y a un sistema de cultivo celular que permiten evaluar los efectos potenciales de estimuladores y/o inhibidores sobre varios cultivos celulares. En algunas realizaciones, la composición de matriz extracelular es una composición de membrana basal reconstituida y modificada. La composición del invento incluye una matriz extracelular; y al menos un componente exógeno que se escoge entre: heparina, fibronectina y laminina. Se puede ajustar el pH de la composición a un pH básico. Las composiciones de matriz extracelular proporcionadas en la presente memoria resultan útiles para revestir superficies, tal como la superficie de un substrato de cultivo celular. Los substratos revestidos pueden emplearse, por ejemplo, en sistemas de ensayo de formación de tubos celulares endoteliales.

En algunas realizaciones, el presente invento proporciona una composición de matriz extracelular que incluye una matriz extracelular; y fibronectina exógena y heparina, presentando la composición un pH básico, en la que la matriz extracelular tiene una concentración de alrededor de 10 mg/ml, la fibronectina exógena está presente en concentraciones de alrededor de 5 mg/ml a alrededor de 20 mg/ml y la heparina exógena está presente en concentraciones de alrededor de 200 mg/ml a alrededor de 800 mg/ml.

Además, en algunas realizaciones, el presente invento proporciona una composición de matriz extracelular que incluye una matriz extracelular; y laminina exógena, presentando la composición un pH básico, en la que la matriz extracelular tiene una concentración de alrededor de 10 mg/ml y la laminina exógena está presente en concentraciones de alrededor de 1 mg/ml a alrededor de 10 mg/ml.

Otro aspecto del presente invento va destinado a sistemas de cultivo celular que emplean las composiciones del invento proporcionadas en la presente memoria en forma de composiciones de revestimiento para substrato. El sistema incluye un substrato; y un revestimiento que lo cubre de una composición de revestimiento que incluye una matriz extracelular; y al menos un componente exógeno que se escoge entre heparina, fibronectina y laminina. El substrato puede ser un substrato de cultivo celular constituido por cualquier número de materiales poliméricos, vidrio, metal y filtros micro-porosos, por ejemplo.

Además, el presente invento proporciona un método de preparación de las composiciones del invento. El método incluye: proporcionar una matriz extracelular; y combinar la matriz extracelular proporcionada con al menos un componente exógeno que se escoge entre heparina, fibronectina y laminina. El método puede incluir además ajustar el pH de la composición a un pH básico y/o añadir cloruro sódico a la composición.

Otro aspecto del presente invento va destinado a un método de preparación del sistema de cultivo celular del invento. Este método incluye proporcionar una composición de matriz extracelular que incluye una matriz extracelular y al menos un componente exógeno que se escoge entre heparina, fibronectina y laminina; y aplicar la composición al substrato. El método además incluye incubar la composición aplicada para permitir su polimerización.

Las composiciones...

1. Una composición de matriz extracelular para revestir una superficie en la que el

pH de la composición se encuentra entre 7,8 y 8,5, comprendiendo la composición -una matriz extracelular; y -al menos un componente exógeno que se escoge en el grupo formado por

fibronectina presente en concentraciones de 5 mg/ml a 20 mg/ml de la composición, heparina presente en concentraciones de 200 mg/ml a 800 mg/ml de la composición y laminina presente en concentraciones de 1 mg/ml a 10 mg/ml de la composición.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la matriz extracelular comprende un extracto de proteína de membrana basal.

3. La composición de la reivindicación 1, que además comprende un tampón Tris a una concentración suficiente para tamponar dentro de intervalo de pH básico.

4. La composición de la reivindicación 3, en el que el tampón Tris se encuentra presente en una concentración de 0,01 M a 0,05 M de la composición.

5. La composición de la reivindicación 1, que además comprende cloruro sódico.

6. La composición de la reivindicación 5, en el que el cloruro sódico se encuentra presente a una concentración de 0,03 M a 0,15 M de la composición.

7. La composición de la reivindicación 1, en la que la matriz extracelular está presente en una concentración de 10 mg/ml de la composición.

8. La composición de la reivindicación 1 que comprende una matriz extracelular; y fibronectina exógena y heparina, en la que la matriz extracelular presenta una concentración de 10 mg/ml, la fibronectina está presente en concentraciones de 5 mg/ml a 20 mg/ml y la heparina está presente en concentraciones de 200 mg/ml a 800 mg/ml.

9. Un sistema de cultivo celular que comprende: un substrato; y un revestimiento sobre él de composición de matriz extracelular como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. El sistema de la reivindicación 9, en el que el substrato se escoge en el grupo formado por membranas de celulosa, policarbonato poroso, politetrafluoroetileno poroso, membranas de nailon, filtros de vidrio, polietilentereftalato poroso, polimetilpentano, polipropileno, polietileno y sus combinaciones.

11. Un método para preparar la composición de matriz extracelular para revestir una superficie que comprende:

(a) proporcionar una matriz extracelular; y

(b) combinar la matriz extracelular proporcionada con al menos un componente

exógeno que se escoge en el grupo formado por fibronectina presente en concentraciones de 5 mg/ml a 20 mg/ml de la composición, heparina presente en concentraciones de 200 mg/ml a 800 mg/ml de la composición y laminina presente en concentraciones de 1 mg/ml a 10 mg/ml de la composición; y

(c) ajustar el pH de la composición a un pH de entre 7,8 y 8,5.

12. El método de la reivindicación 11 que comprende además añadir cloruro sódico a la composición.

13. Un método de preparación de un sistema de cultivo celular que comprende:

(a) proporcionar la composición de matriz extracelular como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;

(b) aplicar la composición al substrato; y

(c) incubar la composición aplicada para permitir su polimerización.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la incubación se lleva a cabo a una temperatura de 22ºC a 37ºC.

15. El método de la reivindicación 13, en el que la composición comprende además un tampón Tris a una concentración suficiente para tamponar dentro del intervalo de pH básico.

16. El método de la reivindicación 13, en el que la composición comprende además cloruro sódico.

17. El método de la reivindicación 13, en el que el substrato se escoge en el grupo formado por membranas de celulosa, policarbonato poroso, politetrafluoroetileno poroso, membranas de nailon, filtros de vidrio, polietilentereftalato poroso, polimetilpentano, polipropileno, polietileno y sus combinaciones.