Una proteína aislada que comprende un complejo de factor de crecimiento semejante a insulina I (IGF-I) y proteína 3 de unión al factor de crecimiento semejante a insulina (IGFBP-3),

teniendo dicha proteína una pureza de al menos un 96% como se mide por CM-HPLC analítica

Complejos rhIGF-I/rhIGFBP-3 purificados y procedimiento de fabricación de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden complejos ultrapuros de factor de crecimiento semejante a insulina I y proteína-3 de unión a factor de crecimiento semejante a insulina, y a procedimientos para fabricarlas.

Descripción de la técnica relacionada

IGF-I/IGFBP-3 es un complejo proteico de factor de crecimiento semejante a insulina-I ("IGF-I") y proteína-3 de unión a factor de crecimiento semejante a insulina ("IGFBP-3"). IGF-I es un pequeño polipéptido con fuerte homología estructural y funcional con la pro-insulina. Como tal, el IGF-I induce muchos de los efectos fisiológicos de la insulina.

Pueden usarse complejos IGF-I/IGFBP-3 para el tratamiento de una amplia serie de trastornos (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº 5.681.818, 5.723.441, 5.948.757, 6.015.786, 6.017.885, 6.025.332, 6.025.368, 6.514.937 y 6.518.238). En individuos sanos, el IGF-I puede encontrarse dentro de la circulación sanguínea unido a otras proteínas. Por ejemplo, el IGF-I se encuentra con frecuencia unido a IGFBP-3, la proteína de unión a IGF-I más abundante. El complejo IGF-I/IGFBP-3 se asocia con una proteína de subunidad susceptible a ácidos, formando un complejo de 150 kD. Véase Adams y col., Prog. Growth Factor Res. 6(2-4):347-56 (1995). Este complejo ternario grande sirve como reservorio circulatorio de IGF-I ya que los complejos IGF-I/IGFBP-3 presentan una mayor semivida y mejor estabilidad que el IGF-I libre. Véase Adams y col., supra, y Blum y col. (1991), Plasma IGFBP-3 Levels as Clinical Indicators, en Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors, pág. 381-93, E.M. Spencer, ed., Elsevier, New York.

IGF-I, IGFBP-3 y los complejos IGF-I/IGFBP-3 pueden obtenerse a partir de fuentes naturales o por técnicas recombinantes. Puede usarse tecnología recombinante para producir IGF-I, IGFBP-3 y complejos IGF-I/IGFBP-3 en organismos eucariotas y procariotas (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº 5.200.509, 5.670.341, 5.789.547 y 6.417.330). IGF-I, IGFBP-3 y los complejos IGF-I/IGFBP-3 recombinantes pueden cultivarse en formatos discontinuos o continuos, recogiéndose el sobrenadante de cultivo celular o las propias células recombinantes.

IGF-I, IGFBP-3 y los complejos IGF-I/IGFBP-3 típicamente se purifican después de la expresión en sistemas recombinantes usando técnicas tales como cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, estas técnicas no pueden eliminar todas las impurezas. Por ejemplo, los complejos IGF-I/IGFBP-3 típicamente están presentes en preparaciones parcialmente purificadas que contienen agregados de proteína. Además, se han descubierto nuevas impurezas tales como variantes de masa y de carga de IGFBP-3 que no se eliminan por procedimientos de la técnica anterior. La Figura 1 proporciona un gráfico de intercambio catiónico obtenido a partir de la cromatografía de intercambio iónico con carboximetilo ("CM-IEX") en gradiente lineal de muestras que comprenden complejos IGF-I/IGFBP-3 y agregados de proteína. La Figura 2 proporciona un análisis de CL/EM de complejos IGF-I/IGFBP-3 purificados usando CM-IEX de gradiente lineal que muestra variantes de masa y de carga descubiertas recientemente. La Patente de Estados Unidos Nº 5.789.547 describe un procedimiento para replegar el factor de crecimiento semejante a insulina I (IGF-I) y la proteína de unión a factor de crecimiento semejante a insulina 3 (IGFBP-3). El procedimiento descrito incluye el co-plegamiento de las dos proteínas purificadas y desnaturalizadas, expresadas por separado, para solucionar problemas relacionados con la expresión recombinante, es decir, un mal plegamiento y una baja solubilidad. La Patente de Estados Unidos Nº 6.417.330 se refiere a variantes de IGFBP, particularmente a variantes de IGFBP-3 que son resistentes a la hidrólisis, tienen secuencias de localización nuclear alteradas o tienen extensiones N-terminales. Las variantes de proteínas se obtienen por expresión recombinante y purificación por cromatografía de intercambio catiónico y se describe que puede ayudarse al plegamiento correcto de estas proteínas por una reacción de co-plegamiento con IGF.

En las técnicas farmacéuticas está bien establecido que es muy deseada la pureza de un fármaco y que incluso pequeñas mejoras en la pureza del fármaco son mejoras importantes. Esto se debe al hecho de que las impurezas pueden tener un impacto imprevisto sobre la estabilidad, seguridad o eficacia del fármaco. Por consiguiente, son intrínsecamente útiles y se necesitan procedimientos mejorados para purificar complejos IGF-I/IGFBP-3.

Sumario

En una realización, la presente invención se refiere a una proteína aislada que comprende un complejo de factor de crecimiento semejante a insulina I ("IGF-I") y proteína de unión a factor de crecimiento semejante a insulina 3 ("IGFBP-3"), teniendo la proteína aislada una pureza de al menos el 96%, una pureza de al menos el 97%, una pureza de al menos el 98% o una pureza de al menos el 99%, como se mide por CM-HPLC analítica.

En una realización, el complejo comprende IGF-I e IGFBP-3 en una relación molar de aproximadamente 0,8:1 a aproximadamente 1,2:1. En otra realización, la relación molar es aproximadamente 1:1.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína aislada que comprende un complejo de IGF-I e IGFBP-3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, teniendo la proteína una pureza de al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% como se mide por CM-HPLC analítica.

Se proporcionan procedimientos para purificar un complejo de IGF-I e IGFBP-3 que comprenden obtener un complejo de IGF-I e GFBP-3, purificar parcialmente el complejo IGF-I/IGFBP-3, adsorber el complejo en una fase estacionaria, desorber el complejo usando una multiplicidad de fases móviles, comprendiendo las fases móviles una serie de fuerzas iónicas secuencialmente crecientes, y recuperar el complejo de IGF-I e IGFBP-3 purificado. En una realización, la fase estacionaria es una resina de intercambio catiónico. En otra realización, la resina de intercambio catiónico contiene grupos carboximetilo funcionales. El complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 es un complejo proteico cargado, pero pueden producirse modificaciones sutiles en el complejo proteico que reducen la carga del complejo en 1 a 5 unidades positivas. Esto puede conseguirse por neutralización de una o más cargas positivas o por introducción de una o más cargas negativas. Los ejemplos de modificaciones que pueden cambiar la carga total en una manera de carga positiva incluyen, pero sin limitación, conjugación de amina N-terminal, conjugado de lisina, conjugación con arginina y desamidación. Al establecer dos condiciones tamponantes isocráticas, se puede separar el complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo de un complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 de carga positiva reducida. El primer tampón isocrático tiene una fuerza iónica suficiente para desorber el complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 de carga positiva reducida mientras que queda retenido el complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo. El segundo tampón isocrático tiene una fuerza iónica suficiente para desorber el complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo mientras que retiene otras impurezas tales como agregados de rhIGF-I/rhIGFBP-3 y formas mal plegadas de rhIGFBP-3. La Figura 6 representa dos separaciones, usando la figura superior una resina preparativa y usando la inferior una resina analítica. La identidad de los componentes se indica encima del gráfico UV para los picos. Como alternativa, el procedimiento puede realizarse con un solo tampón que desorbe tanto el complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 de carga positiva reducida y el complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo, consiguiéndose la separación durante el único tampón isocrático. Este procedimiento generalmente se usa para análisis analítico y generalmente no se usa para análisis preparativo debido al gran volumen de tampón que se necesita para conseguir la separación. Puede realizarse otro procedimiento alternativo con un primer tampón isocrático para desorber el complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 de carga positiva reducida seguido de un gradiente de fuerzas iónicas crecientes para eluir el complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo y otras impurezas.

Se proporcionan procedimientos en los que la multiplicidad de fases móviles comprende una primera fase móvil y una segunda fase móvil. La primera fase móvil puede tener una concentración de NaCl al menos aproximadamente...

1. Una proteína aislada que comprende un complejo de factor de crecimiento semejante a insulina I (IGF-I) y proteína 3 de unión al factor de crecimiento semejante a insulina (IGFBP-3), teniendo dicha proteína una pureza de al menos un 96% como se mide por CM-HPLC analítica.

2. La proteína de la reivindicación 1, en la que dicha proteína tiene una pureza de al menos el 97% como se mide por CM-HPLC analítica.

3. La proteína de la reivindicación 1, en la que dicha proteína tiene una pureza de al menos el 98% como se mide por CM-HPLC analítica.

4. La proteína de la reivindicación 1, en la que dicha proteína tiene una pureza de al menos el 99% como se mide por CM-HPLC analítica.

5. La proteína de la reivindicación 1, en la que dicho complejo comprende IGF-I e IGFBP-3 en una relación molar de aproximadamente 0,8:1 a aproximadamente 1,2:1.

6. La proteína de la reivindicación 1, en la que dicho complejo comprende IGF-I e IGFBP-3 en una relación molar de aproximadamente 1:1.

7. Una composición farmacéutica que comprende una proteína aislada que comprende un complejo de IGF-I e IGFBP-3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha proteína tiene una pureza de al menos el 96% como se mide por CM-HPLC analítica.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en la que dicha proteína tiene una pureza de al menos el 97% como se mide por CM-HPLC analítica.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en la que dicha proteína tiene una pureza de al menos el 98% como se mide por CM-HPLC analítica.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en la que dicha proteína tiene una pureza de al menos el 99% como se mide por CM-HPLC analítica.

11. Un procedimiento para purificar un complejo de IGF-I e IGFBP-3, que comprende

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha fase estacionaria es una resina de intercambio catiónico.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha resina de intercambio catiónico contiene grupos carboximetilo funcionales.

14. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha multiplicidad de fases móviles comprende una primera fase móvil y una segunda fase móvil.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha primera fase móvil tiene una concentración de NaCl al menos aproximadamente 10 mM menor que dicha segunda fase móvil.

16. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha primera fase móvil tiene una concentración de NaCl al menos aproximadamente 20 mM menor que dicha segunda fase móvil.

17. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha primera fase móvil tiene una concentración de NaCl al menos aproximadamente 40 mM menor que dicha segunda fase móvil.

18. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha primera fase móvil comprende NaCl de aproximadamente 160 mM a aproximadamente 185 mM y dicha segunda fase móvil comprende NaCl de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 250 mM.

19. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha segunda fase móvil comprende NaCl aproximadamente 225 mM.

20. Un procedimiento para purificar un complejo parcialmente purificado de IGF-I e IGFBP-3, que comprende adsorber dicho complejo en una resina de intercambio catiónico y desorber dicho complejo usando una serie de fases móviles por etapas.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que dichas fases móviles comprenden una primera fase móvil que tiene NaCl de aproximadamente 160 mM a aproximadamente 185 mM y una segunda fase móvil que tiene NaCl de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 250 mM.

22. Un procedimiento para purificar un complejo parcialmente purificado de IGF-I e IGFBP-3 por cromatografía de intercambio iónico usando una resina de carboximetilo, comprendiendo la mejora desorber dicho complejo de dicha resina de carboximetilo por la aplicación de una primera fase móvil que comprende NaCl de aproximadamente 160 mM a aproximadamente 185 mM seguida de la aplicación de una segunda fase móvil que comprende NaCl de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 250 mM, recuperando de esta manera dicho producto purificado.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que dicha segunda fase móvil comprende NaCl aproximadamente 225 mM.