CEPAS DE STREPTOMYCES MODIFICADAS GENETICAMENTE PARA BIOTRANSFORMACIONES EN LA PRODUCCION DE ANTRACICLINA.
Una cepa microbiana seleccionada entre el género Streptomyces que convierte los metabolitos de antraciclina en antibióticos de antraciclina no naturales,
caracterizada porque la cepa está bloqueada en la biosíntesis de daunomicinas naturales y comprende el gen de resistencia heteróloga snorO
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07016622.
Solicitante: W.C. HERAEUS GMBH
GALILAEUS OY.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: HERAEUSSTRASSE 12 - 14,63450 HANAU.
Inventor/es: YLIHONKO, KRISTIINA, LAMBERT,MICHAEL,DR, HOLMBAECK,MARIA.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 24 de Agosto de 2007.
Fecha Concesión Europea: 3 de Febrero de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12P19/56 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › con un átomo de oxígeno del radical sacárido unido directamente a un sistema cíclico condensado de al menos tres carbociclos, p. ej. daunomicina, adriamicina.
Clasificación PCT:
- C12P19/56 C12P 19/00 […] › con un átomo de oxígeno del radical sacárido unido directamente a un sistema cíclico condensado de al menos tres carbociclos, p. ej. daunomicina, adriamicina.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
Fragmento de la descripción:
Cepas de Streptomyces modificadas genéticamente para biotransformaciones en la producción de antraciclina.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a cepas microbianas mejoradas del género Streptomyces y a su uso en un procedimiento de biotransformación para mejorar los rendimientos de antibióticos antitumorales de antraciclina, particularmente epirrubicina e idarrubicina.
Antecedentes de la invención
Las daunomicinas son un grupo de antibióticos antitumorales producidos por diversas Streptomyces sp., tales como S. peucetius, S. coerulorubidus, S. griseus, Streptomyces sp. C5, S. peucetius var. caesius, y S. bifurcus. El compuesto básico del grupo es daunomicina (DiMarco et al., 1964). Las daunomicinas pueden describirse mediante la fórmula general I
Sus derivados más importantes se muestran en la Tabla 1.
Los derivados semisintéticos de daunorrubicina, epirrubicina e idarrubicina pueden clasificarse como antibióticos de antraciclina no naturales ya que las cepas de origen natural no producen estas antraciclinas. La epirrubicina se usa clínicamente para muchos tipos de cáncer. El mercado está creciendo y compite con la doxorrubicina. Nuevas formulaciones, conjugados y nuevas combinaciones con otros fármacos para el cáncer expanden también el uso de epirrubicina. La epirrubicina se fabrica por un procedimiento que comprende producir daunorrubicina por fermentación y modificar sintéticamente el resto aglicona y azúcar, descrito por ejemplo en la Patente de Estados Unidos 5.874.550.
La idarrubicina (4-desmetoxi-daunorrubicina) se usa para tratar ciertos tipos de cáncer, incluyendo leucemia, linfoma, y otras enfermedades de la médula ósea. Se reivindica que provoca menos efectos secundarios que la doxorrubicina. El mercado anual global para idarrubicina, sin embargo, no es mayor de 20 kg, presumiblemente debido a su precio excepcionalmente alto, que se debe a un procedimiento de fabricación muy complicado. La idarrubicinona se fabrica a partir de daunomicinona, obtenida de la fermentación de daunorrubicina con hidrólisis ácida posterior. La daunorrubicinona se modifica sintéticamente adicionalmente para dar idarrubicinona. Un resto azúcar, daunosamina, se une mediante una serie de reacciones sintéticas complicadas, como se revela, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.325.946.
En la producción por fermentación de antraciclinas importantes tales como daunorrubicina y epidaunorrubicina los intermedios se acumulan en el caldo de fermentación. Un intermedio típico en ambos casos es
Se ha descubierto un nuevo procedimiento para obtener mayores rendimientos de antraciclinas no naturales comercialmente importantes, epirrubicina e idarrubicina a un menor coste por utilización de los productos secundarios obtenidos en la producción por fermentación de daunomicina y epidaunorrubicina.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una presentación esquemática de la ruta biosintética para la clase daunomicina de antraciclinas.
La Figura 2 es una presentación esquemática del procedimiento para la producción de epirrubicina e idarrubicina de acuerdo con la presente invención.
La Figura 3 es un cromatograma que muestra el perfil de producción de una biotransformación de la cepa de acuerdo con la presente invención después de alimentarla con 4-desoxi-
Rt = 6,0: 13-dihidro-idarrubicina, Rt = 6,9: idarrubicina, Rt = 8,1: 13-desoxi-idarrubicina.
Rt = 11,0: 4-desoxi-
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a una cepa microbiana del género Streptomyces, que convierte los metabolitos de antraciclina, tales como epidaunorrubicina, 13-dihidroepidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y
La presente invención también se refiere a un procedimiento para convertir metabolitos de antraciclina tales como 13-dihidroepidaunorrubicina, y
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a cepas de Streptomyces mejoradas, que son capaces de convertir los intermedios de antraciclina modificados en fármacos antitumorales de antraciclina importantes, idarrubicina y epirrubicina. Dichas cepas son útiles en un procedimiento para convertir los metabolitos de antraciclina en los productos finales.
Por tanto, un objeto de la presente invención proporciona una cepa de Streptomyces mejorada, modificada para poder convertir de forma estable 4-desoxi-
El gen snorO se aisló de S. nogalater (ATCC 27952) y se sugiere que es el responsable de la resistencia a nogalamicina (Torkkell 2001). Basándose en el análisis de la secuencia, el producto génico, SnorO es un producto génico multifunción para resistencia, con dominios para la proteína de reparación de la excisión UvrA, y proteína de unión a ATP transportadora de ABC. La expresión heteróloga de snorO en TK24 de S. lividans mostró que el gen protegía a la cepa de todas las antraciclinas, nogalamicina, aclarubicina y daunorrubicina diferentes ensayadas. La introducción del gen snorO en la cepa mejorada procedente de G001 proporcionó una cepa de biotransformación, que presenta una mayor resistencia a idarrubicina. Sorprendentemente, snorO, cuando se introducía en la cepa mejorada procedente de G001 en el vector E. coli, mejoraba la velocidad de conversión y estabilizaba la cepa para mantener la conversión dentro del
Dicha nueva cepa de biotransformación puede alimentarse mediante intermedios de antraciclina naturales tales como aclavinona y
Sorprendentemente, la cepa es capaz de realizar la conversión de metabolitos no naturales...
Reivindicaciones:
1. Una cepa microbiana seleccionada entre el género Streptomyces que convierte los metabolitos de antraciclina en antibióticos de antraciclina no naturales, caracterizada porque la cepa está bloqueada en la biosíntesis de daunomicinas naturales y comprende el gen de resistencia heteróloga snorO.
2. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichos metabolitos de antraciclina se seleccionan entre el grupo constituido por epidaunorrubicina, 13-dihidroepidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y
3. La cepa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que dichos antibióticos de antraciclina no naturales se seleccionan entre el grupo constituido por epirrubicina e idarrubicina.
4. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha cepa se selecciona entre la especie Streptomyces peucetius.
5. La cepa de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicha cepa se selecciona entre la subespecie Streptomyces peucetius var caesius.
6. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho gen se aísla del género Streptomyces.
7. La cepa de acuerdo con la reivindicación 6, en la que dicho gen se aísla de la especie Streptomyces nogalater.
8. La cepa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 20%.
9. La cepa de acuerdo con la reivindicación 8, en la que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 30%.
10. La cepa de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 40%.
11. Un procedimiento para convertir los metabolitos de antraciclina en antibióticos de antraciclina usando una cepa microbiana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dichos metabolitos de antraciclina se seleccionan entre el grupo constituido por epidaunorrubicina, 13-dihidroepidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y
13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en el que dichos antibióticos de antraciclina se seleccionan entre el grupo constituido por epirrubicina e idarrubicina.
14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 20%.
15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 30%.
16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 40%.
17. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que la pureza de los metabolitos de antraciclina brutos usados para la biotransformación es > 60%.
18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la pureza de los metabolitos de antraciclina brutos usados para la biotransformación es > 80%.
19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la pureza de los metabolitos de antraciclina brutos usados para la biotransformación es > 90%.
20. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en el que se usa una resina en cualquier momento para adsorber los metabolitos de antraciclina o antibióticos de antraciclina.
21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicha resina se selecciona entre el grupo constituido por adsorbentes iónicos y no iónicos.
22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dicha resina se selecciona entre el grupo de los poliestirenos.
23. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dicha resina se selecciona entre el grupo constituido por XAD-7 y Diaion HP-20.
24. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que dicha resina se añade en una cantidad de 1 - 100 g/l.
25. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicha resina se añade en una cantidad de 10 - 50 g/l.
26. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicha resina se añade en una cantidad de 15 - 30 g/l.
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