CELDA PORTA-MUESTRAS PARA ANALISIS DE INTERCAMBIO ISOTOPICO H/D E INTERACCIONES MOLECULARES PARA ESPECTROSCOPIA INFRARROJA DE TRANSMISION Y SUS APLICACIONES.

Celda porta-muestras para análisis de intercambio isotópico H/D e interacciones moleculares para espectroscopia infrarroja de transmisión y sus aplicaciones.

La invención presentada se refiere al diseño, fabricación y uso de una nueva celda porta-muestras para compuestos líquidos utilizable en espectroscopia infrarroja de transmisión. Su ventaja principal es que permite medir, caracterizar y observar, in situ y en tiempo real, el intercambio isotópico de hidrógeno por deuterio desde el instante inicial de este proceso hasta su final. Los sectores de aplicación son varios: industria farmacéutica, química y biotecnológica, así como también es de uso en el campo de la investigación científica de la estructura electrónica, conformacional y evolución dinámica de compuestos químicos y biológicos como, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Esta celda porta-muestras se ha diseñado teniendo en cuenta futuros cambios de las técnicas de medida y en los procedimientos empleo de la espectroscopia infrarroja por transmisión

Celda porta-muestras para análisis de intercambio isotópico H/D e interacciones moleculares para espectroscopía infrarroja de transmisión y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un nuevo celda o dispositivo porta-muestras para líquidos utilizable en los equipos de espectroscopia infrarroja de transmisión, y, en términos generales, los sectores de aplicación son: industria farmacéutica, biotecnológica y química (alimenticia, cosmética, etc.). También es de aplicación en la investigación científica de la estructura electrónica y conformacional de sustancias químicas y biológicas tales como proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, y en la investigación de la evolución dinámica de las interacciones entre estos compuestos. Asimismo, la fabricación de este accesorio porta-muestras concierne a la industria de instrumentación científica que manufactura equipos para espectroscopia infrarroja.

Estado de la técnica anterior

La espectroscopia infrarroja de transmisión es una técnica analítica y estructural conocida de antiguo y muy extendida en los ámbitos industriales y de la investigación científica. Sus ventajas frente a otras técnicas usuales son:

a) Se pueden analizar muestras en cualquier estado físico de la materia con una preparación sencilla y rápida, a diferencia de otras técnicas.

b) Se precisan cantidades de muestra relativamente pequeñas.

Más específicamente, se sabe dentro del campo de la proteómica que el análisis infrarrojo de diversas regiones espectrales puede proporcionar información sobre estructura y dinámica de proteínas. Con esta finalidad se ha utilizado el intercambio isotópico de hidrógeno por deuterio (H/D) (Barth y Zscherp, Quart. Rev. Biophys., 35, 369-430 (2002)). La cinética de intercambio isotópico en grupos amida polipeptídicos y cadenas laterales depende de la estructura proteica y del entorno del medio que rodea a la proteína a estudiar. Así, los grupos que están expuestos al disolvente intercambian hidrógeno por deuterio con mayor rapidez. En cambio, los hidrógenos de un fragmento proteico ordenado estructuralmente intercambian más lentamente en comparación con los hidrógenos de otros segmentos carentes de orden estructural polipeptídico. Esto es debido, entre otras causas, a la presencia de enlaces de hidrógeno, a la baja accesibilidad del disolvente o a impedimentos estéricos. Por ello, en el caso frecuente de un hidrógeno amídico protegido se puede considerar como "cerrado", o lento, al intercambio isotópico. Ahora bien, existen dos posibilidades sobre cómo realizar el proceso de intercambio. Una es disolver previamente la proteína liofilizada en óxido de deuterio (agua pesada, D₂O) y tomar después una parte alícuota de esta disolución e introducirla en los porta-muestras convencionales para su posterior análisis por espectroscopia infrarroja de transmisión (Wu y cols., J. Phys. Chem. B, 105, 6251-6259 (2001)). Pero el uso de los porta-muestras convencionales comporta una etapa inicial de intercambio isotópico que no se puede medir durante el tiempo que media entre el momento de disolver la sustancia liofilizada y su posterior introducción en la celda porta-muestras disponibles hasta ahora. Además, la liofilización previa de una sustancia biológica puede comportar agregación de la misma, lo cual invalida su posterior análisis espectroscópico por tratarse ya de un producto biológico desnaturalizado. Para obviar esta dificultad se estableció, desde los inicios de la practica técnica, el método de "stopped flow" consistente en mezclar instantáneamente en una celda porta-muestras convencional la disolución de la sustancia a estudiar y agua pesada. Pero este procedimiento tiene el inconveniente de diluir dicha sustancia, lo que implica la consiguiente disminución de señal espectral. Otro método alternativo que se ha utilizado es el de realizar el intercambio isotópico en una bolsa de diálisis frente a un tampón de D₂O e ir tomando sucesivas partes alícuotas de la disolución para su posterior análisis. Sin embargo este método exige la disponibilidad de cantidades relativamente grandes de sustancia biológica, lo que con frecuencia es un problema insuperable. Por otra parte, si se utiliza otra técnica alternativa como la de reflectancia total atenuada (ATR) (De Jongh y cols., Biochemistry, 36, 13593-13602 (1997); Goormaghtigh y cols., Appl. Spectrosc. 50, 1519-1527 (1996)), también se necesitan cantidades relativamente grandes de muestra, y además, esta técnica comporta una pérdida (alrededor del 50%) de la energía del haz infrarrojo por reflexión múltiple (Miller y Stace, (Eds.), Laboratoy Methods in Infrared Spectroscopy, Heyden & Son Ltd., London, 1972, cap. 14, pp. 210). Por ello esta técnica de ATR resulta menos sensible que la espectroscopia infrarroja de transmisión, sobre todo en el caso de disoluciones que se deban preparar muy diluidas (como es frecuente en las disoluciones biológicas) para evitar agregaciones moleculares no deseadas.

De lo anteriormente expuesto surge la necesidad de un nuevo accesorio porta-muestras para espectroscopia infrarroja de transmisión, donde realizar, "in situ", el intercambio isotópico y que además nos permita observar y medir el proceso de intercambio isotópico desde el momento inicial. Este nuevo accesorio, que se describe en esta memoria, resulta de la inclusión de dos membranas de diálisis en una celda de muestras líquidas que posee los elementos de diseño que se indican más adelante. El mismo accesorio es utilizable no solamente para el estudio analítico, estructural y dinámico de proteínas y otras biomoléculas, sino también en investigaciones relativas a interacciones proteína-ligando, proteína-ácido nucleico y proteína-lípido e interacciones fármaco-células biológicas en tiempo real. En el continuo desarrollo de las técnicas de espectroscopia infrarroja se prevén avances en la denominada espectroscopia de correlación bidimensional, que exige la medida en función del tiempo de numerosos espectros a diferentes porcentajes de deuteración. Por ello, este invento tendría aquí su aplicación práctica porque con él se acorta el tiempo de proceso y, también, hace posible su observación integra.

Descripción de la invención

Esta invención se refiere al diseño y uso de una celda porta-muestras de líquidos utilizable en espectroscopia infrarroja de transmisión para el estudio de intercambio isotópico H/D. Esta celda porta-muestras lleva incorporados dos cilindros en donde se introduce el agua pesada y en cuyos extremos, en contacto con la muestra, se sitúan dos membranas de diálisis (Fig. 1 y 2) entre las cuales se realiza la reacción de intercambio.

La ventaja de este accesorio sobre la celda porta-muestras convencional es que el intercambio isotópico se puede realizar, in situ, en el mismo porta-muestras desde el inicio del proceso. Como el volumen de D₂O que se puede introducir en los cilindros es aproximadamente 4 ml y el volumen necesario para rellenar el espacio, entre los cristales de la celda y las membranas, es aproximadamente 40 µl, se pueden conseguir deuteraciones de hasta el 99%, sin necesidad de renovar el agua pesada de los cilindros. Resultado de ello es que el proceso completo se puede medir en una sola etapa, acortando notablemente el tiempo de operación. Un conocimiento más detallado de la invención se adquiere a continuación, en donde se describen las características de este accesorio y unos ejemplos de intercambio isotópico realizado para la enzima tripsina y tampón acuoso.

La presente invención se basa en que los autores de la misma han puesto a punto una celda porta-muestras para medida espectral de líquidos, por espectroscopia infrarroja de transmisión, en el curso del intercambio isotópico H/D. Como ya se ha mencionado, la ventaja de este accesorio porta-muestras sobre los convencionales es que el intercambio isotópico H/D se puede realizar in situ, y observar en la misma celda porta-muestras, el proceso completo. La celda utilizada posee las características geométricas indicadas en las Figuras 1 y 2. El esquema de la Figura 1 (y, en detalle en la figura 2, sección lateral de los conductos de relleno y secciones del soporte metálico frontal) muestra el ensamblaje de todos los componentes de la celda. Además, en los orificios de entrada de los líquidos (en nuestro prototipo, con un de un diámetro de 2,5 milímetros), se colocan dos membranas...

1. Celda porta-muestras de líquidos, para medir cinéticas de intercambio isotópico H/D en su integridad, mediante la espectroscopia infrarroja de transmisión, caracterizada porque comprende las siguientes partes o componentes: