BIOSENSOR OPTICO ENZIMATICO.

Biosensor óptico enzimático, del tipo de los utilizados para determinaciones analíticas cuantitativas y en continuo de peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético mediante absorción molecular,

caracterizada porque comprende una lámina de poliacrilamida con una enzima que se oxida en presencia del analito a una forma química que presenta un espectro de absorción molecular UV-visible diferente de la forma original, midiéndose este cambio en el espectro de absorción luminosa y relacionándose con la concentración del analito, regenerando posteriormente la enzima mediante tirosina. La invención que se presenta aporta la principal ventaja de permitir realizar la medición de peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético en continuo de manera rápida, sencilla, fácilmente utilizable en la práctica habitual de un trabajo de campo con un coste económico reducido que abarate los costes

Biosensor óptico enzimático.

La presente memoria descriptiva se refiere, como su título indica, a un biosensor óptico enzimático, del tipo de los utilizados para determinaciones analíticas cuantitativas y en continuo de peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético mediante absorción molecular, caracterizado porque comprende una lámina de poliacrilamida con una enzima que se oxida en presencia del analito a una forma química que presenta un espectro de absorción molecular UV-visible diferente de la forma original, midiéndose este cambio en el espectro de absorción luminosa y relacionándose con la concentración del analito, regenerando posteriormente la enzima mediante tirosina.

En la actualidad son ampliamente conocidos en el campo de la instrumentación para química diferentes analizadores comerciales para la medida "in situ" de la concentración de H₂O₂ y/o ácido peracético. En función del principio físico-químico en el que están basado se pueden distinguir principalmente los basados en:

A - Valoración redox del peróxido con MnO₄^- que realiza de forma automática. Se trata de un dispositivo de valoración redox automático, que presenta una serie de problemas de incertidumbre, necesidad de calibración continua y estabilidad de los reactivos que hacen que su utilización no sea muy habitual, especialmente para el trabajo de campo.

B - Absorción infrarroja directa del H₂O₂ en fase gas. Este tipo de dispositivos se puede utilizar únicamente para medidas en fase gas pero tiene el gran inconveniente de que no es aplicable en muestras líquidas por la elevada interferencia que provoca el H₂O₂, lo cual impide asimismo su uso de campo, restringiéndolo al entorno del laboratorio.

Estos dispositivos, además, tienen el problema añadido de que permiten la determinación "in situ" pero únicamente en modo discontinuo del analito, lo cual hace que su uso no sea viable cuando se requieran medidas en continuo.

Desde el punto de vista de sensores aptos para la medida en continuo el más comúnmente conocido y utilizado es un sensor amperimétrico, tal y como el descrito en la Patente ES 2242730 "Sensor electroquímico par la detección específica de ácido peracético en soluciones acuosas usando procedimientos de pulso amperimétrico" basado en la descarga directa del H₂O₂ o el ácido peracético sobre un electrodo, generalmente de Au. Este dispositivo es el que tiene más éxito comercial y el que ha mostrado mayor eficacia. Sin embargo presenta todavía el inconveniente de que no se han obtenido hasta ahora resultados satisfactorios en cuanto a fiabilidad y estabilidad, lo cual le hace muy delicado para su trabajo en medidas de campo.

Se ha intentado buscar otras soluciones. Por ejemplo la patente ES 2260710 "Biosensor óptico" presenta un biosensor basado en la retención del bioreactivo en una matriz constituida por alúmina porosa que adolece del problema de que no especifica un procedimiento concreto de medida y utilización.

Para solventar esta necesidad de disponer de dispositivos para la medición de peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético que permitan realizar medidas en continuo de manera rápida, sencilla, y que sean asimismo fácilmente utilizable en la práctica habitual de un trabajo de campo se ha ideado el biosensor óptico enzimático objeto de la presente invención, el cual se basa en los cambios que presenta el espectro de absorción UV-visible de una enzima al pasar de su forma original (o reducida, a partir de ahora Ez) a su forma oxidada (a partir de ahora Ezox). El H₂O₂ produce el paso de Ez a Ezox, y una disolución de tirosina (u otro reductor químico, o electroquímico alternativo) permite la regeneración de la Ez original.

Para ello la invención comprende básicamente una lámina, preferentemente de poliacrilamida, con enzima inmovilizada en su interior, o en su superficie, dotada por un extremo de uno o varios elementos emisores de luz con la longitud de onda apropiada, y por el otro extremo con un elemento sensor de luz, también dentro del espectro de luz deseado. Esta lámina de poliacrilamida con enzima se pone en contacto con el analito a medir (peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético), produciéndose la oxidación de la enzima a una forma química que presenta un espectro de absorción molecular UV-visible diferente de la forma original. Este cambio se refleja en la variación de medida indicada en el elemento sensor de luz que está midiendo continuamente la luz que atraviesa la lámina de poliacrilamida proveniente de los elementos emisores de luz midiéndose este cambio en el espectro de absorción luminosa y relacionándose con la con- centración del analito, regenerando posteriormente la enzima mediante tirosina para continuar realizando medidas.

Obviamente el sensor requiere además de los oportunos circuitos electrónicos de control de los elementos emisores de luz y de proceso y medida de la señal proveniente del elemento sensor de luz, de una bomba de doble canal para el paso de la muestra y de una envolvente y soporte de los elementos.

El principal problema que resuelve esta invención es que permite la determinación enzimática de peróxido de hidrógeno de manera fiable y continua sin la necesidad de adicionar ningún reactivo. Tan sólo es necesaria la muestra sobre la que se va a llevar a cabo la determinación, ya que hace uso de las propiedades de autoabsorción de la propia enzima inmovilizada sobre un soporte de poliacrilamida.

Este biosensor óptico enzimático que se presenta aporta múltiples ventajas sobre los sistemas disponibles en la actualidad siendo la más importante que permite realizar la medición de peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético en continuo de manera rápida, sencilla, fácilmente utilizable en la práctica habitual de un trabajo de campo.

Es importante destacar que este biosensor puede utilizarse tanto para medidas de peróxido de hidrógeno como de ácido peracético.

Otra importante ventaja es que este sistema permite llevar a cabo la reacción enzimática sin la necesidad de adicionar ningún otro reactivo, tan sólo la muestra objeto de análisis.

Además es necesario recalcar que esta invención tiene un coste económico reducido que permite abaratar notablemente los costes.

Otra ventaja de la presente invención es que el procedimiento de medida permite obtener unos resultados altamente fiables, no requiriendo de complejas ni frecuentes calibraciones.

Para comprender mejor el objeto de la presente invención, en el plano anexo se ha representado un ejemplo de realización práctica preferencial de un biosensor óptico enzimático.

En dicho plano la figura (1) muestra una vista en perspectiva de un ejemplo de realización con dos elementos emisores de luz.

La figura (2) muestra un diagrama de bloques del ejemplo de realización con dos elementos emisores de luz.

La figura (3) muestra un diagrama de bloques de una realización alternativa con un único elemento emisor de luz.

El biosensor óptico enzimático objeto de la presente invención, esta formado básicamente, como puede apreciarse en el plano anexo, por una lámina biosensora (1), preferentemente de poliacrilamida, en la que se ha inmovilizado la enzima, dotada por un extremo de uno o varios elementos emisores de luz (4, 5, 12) con la longitud de onda apropiada, y por el otro extremo con un elemento sensor de luz (6), también dentro del espectro de luz deseado. En esta lámina biosensora (1) de poliacrilamida con enzima se pone en contacto con el analito a medir (peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético), produciéndose la oxidación de la enzima a una forma química que presenta un espectro de absorción molecular UV-visible diferente de la forma original. Este cambio se refleja en la variación de medida captada por el elemento sensor de luz (6) que está midiendo continuamente la luz que atraviesa la lámina biosensora (1) proveniente de los elementos emisores de luz (4, 5, 12) midiéndose este cambio en el espectro de absorción luminosa y relacionándose con la concentración del analito, regenerando posteriormente la enzima mediante tirosina u otro reductor químico, o electroquímico alternativo, para continuar realizando medidas.

La enzima a utilizar puede ser cualquiera que presente una diferencia suficientemente apreciable en el espectro de absorción molecular UV-visible entre la forma original...

1. Biosensor óptico enzimático, del tipo de los utilizados para determinaciones analíticas cuantitativas y en continuo de peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético mediante absorción molecular, caracterizado porque comprende una lámina biosensora (1) con una enzima sobre la que se añade el analito a medir, dotada por un extremo de uno o varios elementos emisores de luz (4, 5, 12), y por el otro extremo con un elemento sensor de luz (6) dentro del espectro correspondiente a los elementos emisores de luz (4, 5, 12).

2. Biosensor óptico enzimático, según la anterior reivindicación, caracterizado porque la lámina biosensora (1) está soportada por una pieza inferior (3) constituida por una lámina preferentemente de vidrio con un recubrimiento reflectante compatible con la lámina biosensora (1), y tiene adyacentes sendas piezas laterales (2) similares a la pieza inferior (3) pero más estrechas y asimismo con un recubrimiento reflectante compatible con la lámina biosensora (1).

3. Biosensor óptico enzimático, según las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la lámina biosensora (1) es de poliacrilamida.

4. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la enzima es una del grupo de las metaloproteínas.

5. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la enzima es peroxidasa.

6. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el tratamiento reflectante compatible con la lámina biosensora (1) incorporado en la pieza inferior (3) y en las piezas laterales (2) es un depósito de AlN₃.

7. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la lámina biosensora (1) contiene una enzima inmovilizada en su interior mediante un procedimiento de polimerización con entrampamiento realizado directamente sobre el hueco que deja el conjunto constituido por las piezas laterales (3) e inferior (2).

8. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el elemento sensor de luz (6) mide la señal proveniente de los elementos emisores de luz (4, 5, 12) situados en la parte opuesta una vez han atravesado la lámina biosensora (1).

9. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque sobre el conjunto formado por la lámina biosensora (1) y las piezas laterales (2), soportadas en la pieza inferior (3), se adapta una pieza metálica (7) de cierre que contiene las conducciones de entrada (8) y salida (9) de la muestra ubicadas sobre la lámina biosensora (1) y conectadas a una bomba de doble canal para el paso de la muestra.

10. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el sensor incorpora los oportunos circuitos electrónicos de control (10, 13) de los elementos emisores de luz (4, 5, 12) y circuito electrónico de proceso y medida (11) de la señal proveniente del elemento sensor de luz (6).

11. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque los elementos emisores de luz (4, 5, 12) son del tipo Diodo Electro Luminiscente (LED).

12. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el fotodiodo (6) es del tipo de Diodo Fotosensible o fotodiodo.

13. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque se utilizan simultáneamente dos elementos emisores de luz (4, 5) diferentes, uno de ellos que emite a 425 nm y el otro a 450 nm respectivamente, siendo la primera la longitud de onda analítica y la segunda la de referencia.

14. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a la 10, caracterizado porque se utiliza un único elemento emisor de luz (12), unido a un circuito electrónico de control específico (13) que utilice modulación de frecuencia para generar las dos longitudes de onda en el mismo elemento emisor de luz (12).

15. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque comprende un juego de válvulas electromecánicas, para la inyección de la muestra y la limpieza de la lámina sensora, una tarjeta de adquisición de datos y un sistema informático para el almacenamiento, tratamiento y presentación de datos.

16. Procedimiento de uso de un biosensor óptico enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque comprende un primer paso en el que a la lámina biosensora (1) de poliacrilamida con enzima se añade el analito a medir, produciéndose a continuación el paso de la oxidación de la enzima a una forma química que presenta un espectro de absorción molecular UV-visible diferente de la forma original, para a continuación reflejarse este cambio en una variación de la medida captada por el elemento sensor de luz (6) que está midiendo continuamente la luz que atraviesa la lámina biosensora (1) proveniente de los elementos emisores de luz (4, 5, 12), procediendo a continuación a un paso de medida de este cambio en el espectro de absorción luminosa y de relación con la concentración del analito, para finalizar con un paso de regeneración de la enzima mediante tirosina u otro reductor químico, o electroquímico alternativo, para a continuación volver a comenzar de nuevo el proceso de medida de una manera cíclica.

17. Uso del biosensor óptico enzimático para la analítica del peróxido de hidrógeno y/o del ácido peracético.