BIOPOLIMERO BASADO EN LACTOCOCCUS LACTIS, NRRL B-30656, PROCESO PARA EL CULTIVO DEL LACTOCOCCUS LACTIS NRRL B-30656 Y PROCESO PARA PREPARAR EL BIOPOLIMERO.

Un microorganismo aislado de suelo fue identificado como una cepa de Lactococcus lactis,

NRRL B-30656, el cual al crecer en un medio que contiene sacarosa produce una enzima transferasa, extracelular, la cual al ser purificada y colocarse en un medio con sacarosa, a condiciones adecuadas de temperatura y pH, produce un biopolimero de glucosa y fructosa

Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W04004224IB.

Solicitante: UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA.

Nacionalidad solicitante: Colombia.

Dirección: RECTORIA GENERAL CIUDAD UNIVERSITARIA,BOGOTA, 6.

Inventor/es: OSPINA-SANCHEZ,SONIA AMPARO, MONTOYA-CASTANO,DOLLY, BUITRAGO-HURTADO,GUSTAVO, CERON-SALAMANCA,JAIRO ALONSO, CAICEDO-ZAMORA,OSCAR.

Fecha de Publicación: 24 de Febrero de 2010.

Fecha Concesión Europea: 30 de Septiembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

A23L1/054
C08B37/00 QUIMICA; METALURGIA. › C08 COMPUESTOS MACROMOLECULARES ORGANICOS; SU PREPARACION O PRODUCCION QUIMICA; COMPOSICIONES BASADAS EN COMPUESTOS MACROMOLECULARES. › C08B POLISACARIDOS; SUS DERIVADOS (polisacáridos que contienen menos de seis radicales sacáridos unidos entre sí por enlaces glucosídicos C07H; procesos de fermentación o procesos que utilizan enzimas C12P 19/00; producción de celulosa D21). › Preparación de polisacáridos no previstos en los grupos C08B 1/00 - C08B 35/00; Sus derivados (celulosa D21).
C08J5/18 C08 […] › C08J PRODUCCION; PROCESOS GENERALES PARA FORMAR MEZCLAS; TRATAMIENTO POSTERIOR NO CUBIERTO POR LAS SUBCLASES C08B, C08C, C08F, C08G o C08H (trabajo, p. ej. conformado, de plásticos B29). › C08J 5/00 Fabricación de artículos o modelado de materiales que contienen sustancias macromoleculares (fabricación de membranas semipermeables B01D 67/00 - B01D 71/00). › Fabricación de películas u hojas.
C12N9/10 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
C12P19/04 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polisacáridos, es decir, compuestos que contienen más de cinco radicales sacárido unidos entre ellos por enlaces glucosídicos.
C12P19/18 C12P 19/00 […] › preparados por acción de una transferasa glicosílica, p. ej. alfa-, beta- o gamma-ciclodextrinas.

Clasificación PCT:

A23L1/054
C08B37/00 C08B […] › Preparación de polisacáridos no previstos en los grupos C08B 1/00 - C08B 35/00; Sus derivados (celulosa D21).
C08J5/18 C08J 5/00 […] › Fabricación de películas u hojas.
C12N1/20 C12N […] › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Bacterias; Sus medios de cultivo.
C12N9/10 C12N 9/00 […] › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
C12P19/04 C12P 19/00 […] › Polisacáridos, es decir, compuestos que contienen más de cinco radicales sacárido unidos entre ellos por enlaces glucosídicos.
C12P19/18 C12P 19/00 […] › preparados por acción de una transferasa glicosílica, p. ej. alfa-, beta- o gamma-ciclodextrinas.

Clasificación antigua:

A23L1/054
C08B37/00 C08B […] › Preparación de polisacáridos no previstos en los grupos C08B 1/00 - C08B 35/00; Sus derivados (celulosa D21).
C08J5/18 C08J 5/00 […] › Fabricación de películas u hojas.
C12N1/20 C12N 1/00 […] › Bacterias; Sus medios de cultivo.
C12N9/10 C12N 9/00 […] › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
C12P19/04 C12P 19/00 […] › Polisacáridos, es decir, compuestos que contienen más de cinco radicales sacárido unidos entre ellos por enlaces glucosídicos.
C12P19/18 C12P 19/00 […] › preparados por acción de una transferasa glicosílica, p. ej. alfa-, beta- o gamma-ciclodextrinas.

Fragmento de la descripción:

Biopolímero basado en Lactococcus lactis, NRRL B-30656, proceso para el cultivo del Lactococcus lactis NRRL B-30656 y proceso para preparar el biopolímero.

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se relaciona con un polímero de glucosa y fructosa y el método para su preparación utilizando una cepa de Lactococcus lactis. Los exopolisacáridos son polímeros naturales de glucosa y fructosa. Estos polímeros se encuentran en varias plantas y microorganismos y son de utilidad como emulsificantes, espesantes y surfactantes en la industria de alimentos y medicamentos.

2. Descripción del estado de la técnica

Los fructosanos se encuentran en la naturaleza en dos formas generales que se diferencian por el tipo de enlace entre las moléculas de fructosa: inulina, como la que se encuentra en las plantas, se forma a partir de una columna de moléculas de fructosa unidas por enlaces beta, 2-1. Levanas, formadas como productos microbianos, tienen una columna de moléculas de fructosa unidas por enlaces beta, 2-6. Los fructosanos de las plantas tienen menor tamaño (cerca de 100 residuos) mientras que las levanas microbianas contienen más de 3 millones de residuos (Pontis et al., 1985, Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants. In: Dey and Dixon (eds). Ch. 5, p. 205. New York, Academic Press).

Las levanas microbianas se producen con sustratos a base de sacarosa que tienen una amplia gama de microorganismos: Acetobacter (Loewenberg, et al., 1957. Can. J. Microbiol., Vol. 3, p. 643); Achromobacter sp. (Lindberg, G., 1957. Nature. Vol. 180, p. 1141); Aerobacter aerogenes (Srinivasan, et al., 1958. Science. Vol. 127, p. 143); Phytobacterium vitrosum (Belval, et al., 1947.1948. Compt. Rend. Vol. 224, p. 847 y Vol. 226,, p. 1859); Xanthomonas pruni (Cooper, et al., 1935. Biochem. J. Vol. 29; p. 2267); Bacillus subtilis (Dedonder, R., 1966. Meth. Enzymol. Vol. 8, p. 500 y Tanka, et al., 1979. J. Biochem., Vol. 85, p. 287); Bacillus polymyxa (Hestrin et al., 1943. Biochem. J., Vol. 3, p. 450); Aerobacter levanicum (Hestrin, et al., Ibid.); Streptococcus sp. (Corrigen et al., 1979. Infect. Immun., Vol. 26, p. 387);Pseudomonas sp.(Fuchs, A., 1956. Nature. Vol. 178, p. 92); Corynebacterium laevaniformans (Dias et al., 1962. Antonie Van Leewenhoeck, Vol. 28, p. 63).

Se han producido algunos informes de producción de levana en niveles muy bajos y de baja pureza para ser empleados industrialmente.

Se han usado ampliamente otros polímeros biológicos como goma xantán y dextranos en la industria de alimentos como estabilizantes en emulsiones y espumas en helados, aderezos para ensalada, etc. (Sharma, S. C., enero 1981. J. Food Tech., p. 59). Los polisacáridos extracelulares producidos por microorganismos ofrecen una variedad de usos y costos potencialmente bajos.

Generalmente se producen pequeñas cantidades de levana por la fermentación de la sacarosa empleando cepas de Actinomyces viscosus o Aerobacter levanicum.

El Bacillus polymixa generalmente produce heteropolisacáridos que tienen diferentes formas de polímeros. Las cepas de E. coli genéticamente modificadas se han usado para producir levana. (Gay, P. et al., 1983. J. Bacteriol., Vol. 153, p. 1424). Además, se han empleado otros métodos basados en la fermentación aeróbica para la producción de levana (Jeanes, et al., U. S. Pat. No. 2.673. 828; Gaffor, et al., U. S. Pat. No. 3,879, 545; Ayerbe, et al., U. S. Pat. No. 4.399. 221). Estos procesos tienen el inconveniente de un bajo rendimiento de producto y problemas relacionados con contaminación, por lo cual se requieren procesos industriales que permitan una mayor productividad.

Descripción de la invención

El propósito principal de esta invención es proporcionar un biopolímero producido por una extracto o preparación enzimática con actividad de glucosiltransferasa y de fructosiltransferasa. Se produce a partir de una cepa de Lactococcus lactis (NRRL B-30656), caracterizada por su alta actividad de transferencia, lo cual permite obtener el biopolímero mediante un método de producción sencillo y fácil de escalar. Su producción consiste en los siguientes pasos: Fase 1: Fermentación con la cepa de Lactococcus lactis, NRRL B-30656 en un medio de cultivo desarrollado para el crecimiento de este microorganismo. Fase 2: Recuperación de la enzima extracelular mediante centrifugación o ultrafiltración. Fase 3. Producción del biopolímero mediante la reacción enzimática utilizando sacarosa como sustrato y el extracto o preparación enzimática. Fase 4: Purificación del biopolímero mediante precipitación con solventes o ultrafiltración y posterior secado de producto.

Descripción detallada de la invención

El objeto de la invención es producir un biopolímero puro, libre de contaminantes polisacarídicos. El biopolímero se puede describir como un polímero producido por una cepa de Lactococcus lactis aislada del suelo. Esta cepa tiene alta actividad de transferencia, lo cual permite obtener el biopolímero mediante un proceso sencillo, y con una pureza superior al 95%.

El microorganismo. En la presente invención la cepa de Lactococcus lactis NRRL B-30656 se aisló del suelo mediante un proceso selectivo utilizando un medio que contenía sacarosa como fuente de carbono, en el cual, los microorganismos productores de el extracto o preparación enzimática que tiene actividad de glucosiltransferasa y de fructosiltransferasa son capaces de utilizar el sustrato y producir polímeros, dando a la colonia un aspecto mucoide. Los microorganismos que muestran estas características se seleccionan del medio y se purifican mediante técnicas de aislamiento por diluciones sucesivas y aislamiento en placa. De estas cepas se obtuvo la cepa de Lactococcus lactis NRRL B-30656 que se usa en la presente invención.

De conformidad con la presente invención, la cepa de Lactococcus lactis NRRL B-30656 ha sido depositada en el Banco de Referencia Agricultural Research Service Patent Culture Collection NRRL, institución que asignó el número de registro NRRL B-30656. Esta cepa produce una enzima que tiene actividad de transferencia de glucosa de 2-6 U/mL, empleando sacarosa como sustrato y produce un polímero de glucosa y fructosa con un peso molecular de 900-1100 Daltons.

La cepa fue denominada NRRL B-30656. Esta cepa fue aislada y caracterizada en el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN).

La cepa se conservo a 4ºC en cajas de Petri con medio de cultivo cuya composición es: sacarosa 10-40 g/L, extracto de levadura 7-30 g/L, fosfato de potasio 5-20 g/L 0,05-05 gel, sales minerales 10-100 ppm, pH 5-9.

El microorganismo se caracterizó por microscopía óptica utilizando tinción de Gram y microscopía electrónica de transmisión, utilizando tinción positiva con acetato de uranilo y citrato de plomo. La caracterización bioquímica se realizó con el sistema computarizado MicroScan y según lo descrito en el manual de bacteriología determinativa de Bergey (Stanley, W; Sharpe, E; Holt, J., 1994. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, William and Wilkins, Baltimore,)

El medio de cultivo. Para el diseño y optimización del medio de cultivo para la fermentación con la cepa de Lactococcus lactis NRRL B-30656 se realizó un balance entre la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno y ciertos elementos traza. El medio de cultivo le aportó al microorganismo los nutrientes que éste requiere para crecer y producir la enzima.

Como resultado de la evaluación de los componentes del medio de cultivo, se establecieron las siguientes concentraciones:

El pH se ajustó a pH 5-9 con HCl El medio se esteriliza a 121ºC durante quince minutos.

Fermentación. Los preinóculos corresponden al 5-20% de volumen del inóculo, se activan a partir de la cepa pura conservada a -70ºC en medio que tiene glicerol al 20%; el tiempo de incubación no debe superar las 10-36 horas, período en el cual se debe verificar la pureza del pre-inóculo. Estos cultivos se realizan en frascos bajo agitación, ocupando un 5-20% del volumen total; se incuban a 20-40ºC con agitación...

Reivindicaciones:

1. Un biopolímero de glucosa y fructosa obtenido de los productos del metabolismo de una cepa de Lactococcus lactis (NRRL B-30656), en donde los mencionados productos del metabolismo comprenden un extracto o preparado enzimático que tiene dos tipos de actividad de glucosiltransferasa y fructosiltransferasa y en donde el mencionado biopolímero tiene una composición que tiene una proporción glucosa/fructosa de 0,2 a 0,7 y se caracteriza por las siguientes propiedades:

Peso molecular de 900 a 1.00 Kilodaltons

Dos puntos de transición vítrea; el primero entre 20ºC y 30ºC y el segundo entre 190ºC y 220ºC;

Estabilidad en soluciones acuosas, con valores de pH entre 2 y 9;

Viscosidad de 1000 a 3000 centipoises cuando el polímero se encuentra en una concentración de 10 a 20% en una solución acuosa a 30ºC;

No higroscópico; y

Altamente soluble en agua, capaz de formar dispersiones homogéneas de hidrogel a una concentración máxima de 50% p/v.

2. Un método para producir el extracto o preparado enzimático que tiene actividad de glucosiltransferasa y fructosiltransferasa, producido por la cepa de Lactococcus lactis NRRL B-30656, compuesto por:

Lactococcus lactis

c) Separar el extracto o preparado enzimático del medio fermentado usando centrifugación o ultrafiltración.

3. El método para producir el extracto o preparado enzimático conforme a la reivindicación 2 en donde el paso de activación del microorganismo se lleva a cabo inoculando un medio que contiene sacarosa como fuente de carbono, proteínas como fuente de nitrógeno (extracto de levadura, sulfato de amonio, extracto de carne y otras fuentes de nitrógeno) y sales minerales, incubado durante 10-36 horas a 25ºC, bajo agitación a 100-400 rpm y pH 5-9.

4. El método conforme a la reivindicación 2, en donde el paso de fermentación del microorganismo se lleva a cabo cultivando el microorganismo Lactococcus lactis NRRL B-30656 empleando un medio de cultivo que contiene azúcares como fuente de carbono, proteínas como fuente de nitrógeno (extracto o preparado de levadura, sulfato de amonio, extracto de carne y otras fuentes de nitrógeno) y sales minerales K₂HPO₄, FeSO₄7H₂O, MgSO₄7H₂O; MnSO₄H₂O, CaCl₂2H₂O y NaCl, incubando durante 12-36 horas a 25ºC, bajo agitación a 100-400 rpm, 0,1-1 vvm y pH 5 a 9.

5. El método conforme a la reivindicación 2, en donde el paso de separación del extracto o preparado enzimático se lleva a cabo separando el extracto o preparado enzimático del medio de fermentación por medio de centrifugación de la suspensión del microorganismo entre cerca de 3000 y cerca de 7000 rpm.

6. El método de producción de un extracto o preparado enzimático conforme a la reivindicación 2, en donde el paso de fermentación del microorganismo se puede hacer haciendo un preinóculo con el microorganismo Lactococcus lactis NRRL B-30656 empleando un medio de cultivo que contiene azúcares como fuente de carbono, proteínas como fuente de nitrógeno (extracto de levadura, sulfato de amonio, extracto de carne y otras fuentes de nitrógeno) y sales minerales K₂HPO₄, FeSO₄7H₂O, MgSO₄7H₂O; MnSO₄H₂O, CaCl₂2H₂O y NaCl, incubando durante 12-36 horas a 25ºC, bajo agitación a 100-400 rpm, 0,1-1 vvm y pH 5 a 9.

7. El método de producción del extracto o preparado enzimático que tiene actividad de glucosiltransferasa y fructosiltransferasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el contenido de concentración de sacarosa como fuente de glucosa es de cerca de 10-40 g/L y el contenido de concentración de proteínas como fuente de nitrógeno es de cerca de 7-30 g/L y el contenido de sales minerales es de cerca de: 7-30 g/L K₂HPO₄, 0,01-1 g/L FeSO₄7H₂O, 0,01-0,1 g/L MgSO₄7H₂O; 0,01-0,1 g/L MnSO₄H₂O, 0,001-0,01 g/L CaCl₂2H₂O y 0,01-0,1 g/L NaCl, incubando durante 12-36 horas a 25ºC, bajo agitación a 100-400 rpm, 0,1-1 vvm y pH 5 a 9.

8. Un método para producir un polímero de glucosa y fructosa, conforme a la reivindicación 1, que comprende:

a) Incubar la extracto o preparado enzimático con actividad de glucosiltransferasa y fructosiltransferasa, obtenida por fermentación según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en un medio que contiene sacarosa como fuente de carbono, bajo condiciones adecuadas de agitación, temperatura, pH, concentraciones del extracto o preparado enzimático y del sustrato y condiciones del tiempo de reacción, para la producción del biopolímero.

b) Recuperar y purificar el biopolímero mediante precipitación o ultrafiltración.

9. El método para la producción de biopolímero de acuerdo con la Reivindicación 8, en donde la etapa de incubación del extracto o preparado enzimático consiste en:

Incubar el extracto o preparado enzimático en un medio que contiene sacarosa como medio fuente de carbono, bajo condiciones adecuadas de agitación (100-400 rpm), temperatura, pH (5 a 9), concentración del extracto o preparado enzimático (10-40%v/v ) y del sustrato (5-40%) y de tiempo de reacción (12-48 horas), para la producción del biopolímero.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la etapa de recuperar y purificar el biopolímero mediante precipitación consiste en:

Adicionar a la mezcla de reacción fría 1,2-2,0 volúmenes de etanol al 96%, bajo agitación (la cantidad de etanol adicionada corresponde a la proporción de etanol/volumen de la mezcla de reacción).

Disolver el biopolímero precipitado en la mitad del volumen de agua desionizada y destilada y precipitarlo nuevamente con 1,2 a 2,0 volúmenes de etanol/volumen de la mezcla de reacción; y

Disolver el biopolímero precipitado en un tercio del volumen de agua y secar mediante liofilización o con aire comprimido cerca de 50 a 80ºC hasta alcanzar una humedad cercana a 5-6%.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la etapa de recuperar y purificar el biopolímero mediante ultrafiltración consiste realizar un proceso de ultrafiltración con la mezcla de reacción empleando una membrana de celulosa regenerada con un tamaño de poro mayor de 10.000-30.000 Daltons con el fin de eliminar la glucosa y la fructosa residuales, y someter al biopolímero a un proceso de secado por aspersión.

12. Un microorganismo de la cepa de Lactococcus lactis, aislado de suelos colombianos, depositado bajo el código NRRL B-30656.

13. El microorganismo conforme a la reivindicación 12, el cual produce el extracto o preparado enzimático que tiene actividad tanto de glucosiltransferasa como de fructosiltransferasa.

14. El microorganismo conforme a la reivindicación 12, el cual se preserva en un medio que contiene sacarosa con 20% de glicerol a -70ºC y se liofiliza usando leche descremada al 10%.

15. El microorganismo conforme a la reivindicación 12, el cual se utiliza para producir el biopolímero conforme a la reivindicación 1.

16. El uso del biopolímero conforme a la reivindicación 1 en la industria farmacéutica como viscosante, espesante, estabilizante, dispersante, formador de películas, desintegrador, sustituto de plasma sanguíneo, agente lubricante y agente prebiótico.

17. El uso del biopolímero conforme a la reivindicación 1 en la industria de alimentos como espesante, viscosante, estabilizador, dispersante, fibra y sustituto de grasas, aceites y carbohidratos basados en éteres y ésteres.

18. El uso del biopolímero conforme a la reivindicación 1 en productos obtenidos por extrusión para formar películas aptas para producir empaques flexibles y biodegradables y para obtener productos desechables biodegradables mediante inyección o moldeo y para producir agentes floculantes para el tratamiento de aguas.

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