Vacuna.

Una composición inmunogénica que comprende un PhtD neumocócico sin conjugar y una neumolisina neumocócica sin conjugar y una composición adyuvante que consiste en una emulsión de aceite en agua

, en la que dicha emulsión de aceite en agua consiste en 0,5-10 mg de aceite metabolizable, 3-9 mg de tocol y 0,1-4 mg de agente emulsionante por dosis para ser humano y el aceite y el agente emulsionante están en un vehículo acuoso, en la que el volumen de la dosis está entre 0,4 y 1,5 ml.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2009/054491.

Solicitante: GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS S.A..

Nacionalidad solicitante: Bélgica.

Dirección: RUE DE L'INSTITUT, 89 1330 RIXENSART BELGICA.

Inventor/es: HANON,Emmanuel Jules, BALLOU JR,WILLIAM RIPLEY.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K39/00 (Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/02 (Antígenos bacterianos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/12 (Antígenos virales)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/39 (caracterizados por los aditivos inmunoestimulantes, p. ej. por los adyuvantes químicos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/145 (Orthomyxoviridae, p. ej. virus de la influenza)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/295 (Antígenos virales polivalentes (virus de la viruela o de la varicela A61K 39/285 ); Mezclas de antígenos virales y bacterianos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/102 (Pasteurella; Haemophilus)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/09 (Streptococcus)
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Vacuna.

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DESCRIPCIÓN

Vacuna

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a composiciones de vacuna e inmunogénicas mejoradas y a su uso en medicina. En particular, la invención se refiere a formulaciones de vacuna o inmunogénicas que comprenden un adyuvante de emulsión de aceite en agua y a su uso en medicina, en particular a su uso en el aumento de las respuestas inmunitarias a varios antígenos, incluyendo antígenos de S. pneumoniae, y a procedimientos de preparación, en el que la emulsión de aceite en agua comprende un tocol, un aceite metabolizable y un agente emulsionante.

Antecedentes de la técnica

Nuevas composiciones o vacunas con una inmunogenicidad mejorada son siempre necesarias. Como estrategia, se han usado adyuvantes para probar y mejorar la respuesta inmunitaria provocada frente a cualquier antígeno dado y reducir la reactogenicidad/toxicidad en el huésped.

Las emulsiones de aceite en agua per se también son bien conocidas en la técnica y se ha sugerido que son útiles como composiciones adyuvantes (documentos EP 399843; WO 95/17210).

El documento WO95/17210 divulga emulsiones de aceite en agua que comprenden de 2 a 10 % de escualeno, de 2 a 10 % de tocoferol alfa y de 0, 3 a 3 % de tween 80, y su uso solas o en combinación con QS21 y/o 3D-MPL El documento WO99/12565 divulga composiciones de emulsión de aceite en agua que comprenden un aceite metabolizable, una saponina y un esterol. Las emulsiones de aceite en agua comprenden además 3D-MPL.

El documento WO99/11241 divulga emulsiones de aceite en agua que comprenden aceite metabolizable y una saponina, en las que el aceite y la saponina están presentes en una proporción de entre 1:1 y 200:1.

El documento WO 2007/071707 divulga una emulsión de aceite en agua que comprende un antígeno de S. pneumoniae no conjugado.

Aún existe la necesidad de composiciones de vacunas e inmunogénicas mejoradas que proporcionen una respuesta inmunológica adecuada y sean menos reactogénicas en el huésped.

Declaración de la invención

Los presentes inventores han descubierto que pueden usarse composiciones de vacuna o inmunogénicas que comprenden cantidades menores de cada componente de la emulsión de aceite en agua al tiempo que se mantiene una respuesta inmunitaria comparable contra un antígeno o composición antigénica en dicha composición. Esto conlleva la ventaja de mantener el nivel de inmunogenicidad contra un antígeno mientras que se reduce la reactogenicidad dentro del receptor huésped.

De acuerdo con lo anterior, en el primer aspecto de la presente invención se proporciona una composición inmunogénica que comprende un PhtD neumocócico sin conjugar y una neumolisina neumocócica sin conjugar y una composición adyuvante que comprende una emulsión de aceite en agua, en la que dicha emulsión de aceite en agua consiste en 0,5-10 mg de aceite metabolizable, 3-9 mg de tocol y 0,1-4 mg de agente emulsionante por dosis para ser humano y el aceite y el agente emulsionante están en un vehículo acuoso, en el que el volumen de la dosis está entre 0,4 y 1,5 ml.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona el uso de una composición inmunogénica de la invención en la fabricación de una composición inmunogénica para el tratamiento, alivio o prevención de la infección o enfermedad neumocócica.

En un aspecto adicional se proporciona un procedimiento o uso como se ha definido anteriormente en el presente documento, para protección contra infección o enfermedad causada por un patógeno que es una variante del patógeno del que se obtiene el antígeno en la composición inmunogénica. En otra realización se proporciona un procedimiento o uso como se ha definido anteriormente en el presente documento, para protección contra infección o enfermedad causada por un patógeno que comprende un antígeno que es una variante del antígeno en la composición inmunogénica.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Ensayo clínico: títulos medios geométricos (GMT) para los anticuerpos anti-HA a diferentes puntos de tiempo (cohorte de ATP para inmunogenicidad).

Figura 2: Ensayo clínico: tasa de seroprotección (TSP) para el título de anticuerpo HI con intervalo de confianza del 95 % el día 0 y el día 21 (cohorte ATP para inmunogenicidad).

Figura 3: Ensayo clínico: tasa de seroconversión (TSC) para el título de anticuerpo HI con intervalo de confianza del 95 % el día 0 y el día 21 (cohorte ATP para inmunogenicidad).

Figura 4: Ensayo clínico: factor de seroconversión (FSC) para el título de anticuerpo HI con intervalo de confianza del 95 % el día 0 y el día 21 (cohorte ATP para inmunogenicidad).

Figura 5: Estudio en ratones: prueba de Inhibición de hemaglutinina (GMT +/- IC95) en ratones BALB/c sensibilizados con cepas heterosubtípicas (intervalo de dosis AS03). Figura 5A: Títulos HI Anti-A/Nueva Caledonia/20/99; Figura 5B: Títulos HI Anti-B/Shandong/7/97. Figura 5C: Títulos HI anti–B/Shandong/7/97.

Figura 6: Estudio en ratones: prueba de Inhibición de hemaglutinina (GMT +/- IC95) en ratones C57BI/6 sensibilizados con cepas heterosubtípicas (intervalo de dosis AS03).

Figura 7: Estudio en ratones: Respuesta inmunológica celular (células T CD4+) en PBMC de ratones C57BI/6 sensibilizados con cepas heterosubtípicas (intervalo de dosis AS03).

Figura 8: Estudio en ratones: Respuesta inmunológica celular (células T CD4+) en PBMC de ratones C57BI/6 sensibilizados con cepas heterosubtípicas e inmunizados con dosis bajas (0, 5 μg) del antígeno con adyuvante con intervalo de dosis AS03.

Figura 9: Estudio en ratones: Títulos de ELISA de Ig en suero específico de H5N1 (A y B) y respuestas isotípicas anti-H5N1 IgG1 (C y D) e IgG2b (E y F) a los 14 días de la inmunización (GMT +/- IC95) para dos diferentes dosis de antígeno: 1,5 µg (A, C y E) o 0,38 µg (B, D y F)

Figura 10: Estudio en ratones: Prueba de inhibición de la hemaglutinación (GMT +/- IC95) a los 21 días de la inmunización (GMT +/- IC95) para dos dosis de antígeno diferentes: 1,5 µg (A) o 0,38 µg (B).

Figura 11: Estudio en ratones: Respuesta inmunológica celular (célula T CD4+) en ratones C57BI/6 vírgenes inmunizados con diferentes dosis de vacuna frente a H5N1 (1,5 o 0,38 μg) con adyuvante con intervalo de dosis AS03: (A) 1,5 µg de HA Ag (antígeno) o (B) 0,38 µg de HA Ag (antígeno).

Figura 12: Estudio en cerdos: prueba de Inhibición de hemaglutinina (GMT +/- IC95) en cerdos sensibilizados con cepas homólogas (intervalo de dosis AS03).

Figura 13: Estudio en ratones: Respuesta inmunitaria humoral medida mediante ELISA en ratones C57bl inmunizados co 3 µg de cada uno de dPly, PhtD y proteína D en adyuvante AS03 que contiene 250, 125 o 62,5 µg de SB62.

Figura 14: Estudio en ratones: Respuesta inmunitaria humoral medida mediante ELISA en ratones C57bl inmunizados co 6, 3 o 1,5 µg de dPly, PhtD y proteína D en adyuvante AS03 que contiene 250, 125 o 62,5 µg de SB62.

Descripción detallada de la invención

Los inventores pretenden que los términos “que comprende”, “comprende” y “consiste”, puedan opcionalmente sustituirse con las expresiones que “consiste en”, “consiste en" “constituido por”, respectivamente, en cada caso. .

Las realizaciones del presente documento relacionadas con “composiciones de vacuna” de la invención también son aplicables a realizaciones relacionadas con “composiciones inmunogénicas” de la invención y al contrario.

Componente de emulsión de aceite en agua

La composición adyuvante de la invención comprende un adyuvante de emulsión de aceite en agua, preferentemente dicha emulsión comprende un aceite metabolizable en una cantidad de 0,5 a 10 mg, un tocol en una cantidad de 0,5 a 11 mg y un aceite emulsionante en una cantidad de 0,4 a 4 mg y tiene gotas de aceite de las cuales al menos el 70 % en intensidad, tienen diámetros menores a 1 μm.

Con el fin de que cualquier composición de aceite en agua sea adecuada para administración a seres humanos, la fase oleosa del sistema de emulsión tiene que comprender un aceite metabolizable. El significado de la expresión aceite metabolizable es bien conocido en la técnica. Metabolizable se puede definir como “capaz de ser transformado mediante metabolismo” (Dorland’s Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25ª edición (1974)). El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite sintético, que no es tóxico para el receptor y es capaz de ser transformado mediante metabolismo. Nueces, semillas y granos son fuentes habituales de aceites vegetales. Los aceites sintéticos también forman parte de la presente invención, y pueden incluir aceites disponibles comercialmente tales como NEOBEE® y otros. Un aceite metabolizable particularmente adecuado es escualeno. El escualeno (2,6,10,15,19,23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexeno) es un aceite insaturado que se encuentra en grandes cantidades en el aceite de hígado de tiburón y en cantidades menores en el aceite de oliva, aceite de germen de trigo, aceite de salvado de arroz y levaduras, y es un aceite particularmente preferido para usar en la presente invención. El escualeno es un aceite metabolizable en virtud del hecho de que es un intermedio en la biosíntesis de colesterol (Índice de Merck, 10ª Edición, entrada nº 8619).

De forma adecuada, el aceite metabolizable se encuentra en la composición adyuvante en una cantidad de 0,5 – 10 mg, preferentemente 1 – 10, 2 – 10, 3 – 9, 4 – 8, 5 – 7, o 5 – 6 mg (por ejemplo, 2 – 3, 5 – 6, o 9 – 10 mg) , específicamente 5,35 mg o 2,14 mg. En una realización adicional de la presente invención, el aceite metabolizable está presente en la composición de vacuna (o inmunogénica) en una cantidad de 0,5 – 10 mg, preferentemente 1 – 10, 2 – 10, 3 – 9, 4 – 8, 5 – 7, o 5 – 6 mg (por ejemplo 2 – 3, 5 – 6, o 9 – 10 mg), específicamente 5,35 mg o 2,14 mg.

La cantidad de aceite metabolizable en la vacuna o composición inmunogénica puede expresarse como un porcentaje de la composición total. De forma adecuada, el aceite metabolizable está presente en la composición de vacuna en una cantidad de 0,5 % a 2 %, preferentemente 0,25 – 2, o 0,25 – 1,75, o 0,5 – 1,65, o 0,6 – 1,5, o 0,8 – 1,4 o 1 – 1,25 % (v/v) de aceite del volumen de composición total.

En otra realización específica, el aceite metabolizable está presente en una cantidad final de aproximadamente 1,25 % del volumen total de la composición de vacuna (o inmunogénica). En otra realización específica, el aceite metabolizable está presente en una cantidad final de aproximadamente 0,25 % (v/v) del volumen de composición total.

A modo de aclaración, las concentraciones proporcionadas en v/v se pueden convertir en concentración en p/v aplicando el siguiente factor de conversión. Una concentración de escualeno al 5 % (v/v) es equivalente a una concentración de escualeno de 4,8 % (p/v).

La emulsión de aceite en agua comprende un tocol. En la técnica se conocen bien los tocoles y se describen en el documento EP0382271. Idóneamente, el tocol es α-tocoferol o un derivado del mismo, tal como succinato de alfa- tocoferol (también conocido como succinato de vitamina E). Dicho tocol está presente de forma adecuada en la composición adyuvante en una cantidad de, preferentemente, 3 – 9, 4 – 8, 5 – 7, 5 – 6 (por ejemplo, 5 – 6, 2,5 – 3,5 o 1 – 3 mg). En una realización específica el tocol está presente en una cantidad de 5,94 mg o 2,38 mg. En una realización específica, dicho tocol está presente de forma adecuada en la composición de vacuna (o inmunogénica) en una cantidad de, preferentemente, 3 – 9, 4 – 8, 5 – 7, 5 – 6 (por ejemplo, 5 – 6, 2,5 – 3,5 o 1 – 3 mg). En una realización específica, el tocol está presente en una cantidad de 5,94 mg o 2,38 mg.

La cantidad de tocol puede expresarse como un porcentaje del volumen de la composición de vacuna o inmunogénica total. De forma adecuada, el tocol está presente en la composición de vacuna en una cantidad de 0,25 % a 2 % (v/v) del volumen total de la composición inmunogénica, preferentemente en 0,25 – 2 comprende 0,25 – 2, o 0,25 – 1,75, o 0,5 – 1,65, o 0,6 – 1,5, o 0,8 –1,4 o 1 – 1,25 % (v/v) del tocol del volumen total.

Preferentemente el tocol está presente en una cantidad de entre 0,2 % y 2 % (v/v) del volumen total de la composición de vacuna (o inmunogénica) , más preferentemente en una cantidad de 1,25 % (v/v) en un volumen de dosis de 0, 5 ml.

En una realización específica, el tocol está presente en una cantidad final de aproximadamente 1,25 % del volumen total de la composición de vacuna (o inmunogénica). En otra realización específica, el tocol está presente en una cantidad final de 0,25 % (v/v) del volumen total o 1,25 % (v/v) en un volumen de dosis de 0,5 ml o 0,9 % (v/v), en un volumen de dosis de 0,7 ml, o 0,5 % (v/v) en una dosis de 0,5 ml o 0,35 – 0,37 %, preferentemente 0,36 % en una dosis de vacuna o inmunogénica de 0,7 ml.

A modo de aclaración, las concentraciones proporcionadas en v/v se pueden convertir en concentración en p/v aplicando el siguiente factor de conversión: una concentración de alfa-tocoferol al 5 % (v/v) es equivalente a una concentración de alfa-tocoferol de 4,8 % (p/v).

La emulsión de aceite en agua comprende además un agente emulsionante. El agente emulsionante puede ser, idóneamente, monooleato de polioxietilensorbitán. En una realización particular, el agente de emulsificación puede seleccionarse del grupo que comprende: Polisorbato® 80 o Tween® 80.

Dicho agente de emulsificación está presente de forma adecuada en la composición adyuvante en una cantidad de 0,3 – 4, 0,4 – 3 o 2 – 3 mg (por ejemplo, 0,4 – 1,2, 2 – 3) de agente de emulsificación. En una realización específica, el agente emulsionante está presente en una cantidad de 0,97 mg o 2,425 mg.

Adicionalmente, dicho agente de emulsificación está presente de forma adecuada en la composición de vacuna o inmunogénica en una cantidad de 0,3 – 4, 0,4 – 3 o 2 – 3 mg (por ejemplo, 0,4 – 1,2, 2 – 3) de agente de emulsificación. En una realización específica, el agente emulsionante está presente en una cantidad de 0,97 mg o 2,425 mg.

La cantidad de agente de emulsificación puede expresarse como un porcentaje del volumen de la composición de vacuna o inmunogénica total. De forma adecuada, el agente de emulsificación está presente en la composición de vacuna (o inmunogénica) en una cantidad de 0,125 % a 0,8 % (v/v) del volumen total de la composición, preferentemente en 0,08–0,05, o 0,1 – 0,7, o 0,2 – 0,6, o 0,25 – 0,55, o 0,3 – 0,52 o 0,4 – 0,5 % (v/v) del volumen total. En una realización específica, el agente de emulsificación está presente en una cantidad de 1 %, 0,5 % o 0,2 % (v/v) del volumen de la composición de vacuna o inmunogénica total.

A modo de aclaración, las concentraciones proporcionadas en v/v se pueden convertir en concentración en p/v aplicando el siguiente factor de conversión: una concentración de polisorbato 80 al 1,8 % (v/v) es equivalente a una concentración de polisorbato 80 al 1,91 % (p/v).

En una realización específica, un volumen de dosis de vacuna o inmunogénica de 0,5 ml contiene Tween 80 al 0,45 % (v/v), y un volumen de dosis de 0,7 ml contiene Tween 80 al 0,315 % (v/v). En otra realización específica, una dosis de 0,5 ml contiene agente de emulsificación al 0,18 % (v/v) y una dosis de la composición de vacuna o inmunogénica de 0, 7 ml, contiene agente de emulsificación al 0,126 % (v/v).

Con la expresión “dosis humana” se quiere decir una dosis que está en un volumen adecuado para uso humano. En general, ésta está entre 0,25 y 1,5 ml. En una realización una dosis humana es 0,5 ml. En una realización adicional, una dosis humana es superior a 0,5 ml, por ejemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 ml. En una realización adicional, una dosis humana está entre 1 ml y 1,5 ml. En otra realización, en concreto, cuando la composición inmunogénica es para la población pediátrica, una dosis humana puede ser inferior a 0,5 ml, tal como entre 0,25 y 0,5 ml. La invención se caracteriza por que cada uno o todos los componentes individuales del adyuvante dentro de la composición inmunogénica, está/están en un nivel menor que el considerado previamente como útil y es/son típicamente como se ha descrito anteriormente. Las composiciones particularmente adecuadas que comprenden los siguientes componentes adyuvantes en las cantidades siguientes están en un volumen final de dosis humana de 0,5 ml:

Tabla 1

Adyuvante Adyuvante Adyuvante Adyuvante Adyuvante Adyuvante Adyuvante A B E F C G D emulsión 125 µl 100 µl 83,33 µl 62,5 µl 50 µl 31,25 µl 25 µl ac/a Componentes: Tocoferol 5,94 mg 4,28 mg 3,57 mg 2,68 mg 2,38 mg 1,34 mg 1,19 mg Escualeno 5,35 mg 4,75 mg 3,96 mg 2,97 mg 2,14 mg 1,49 mg 1,07 mg Polisorbato 80 2,43 mg 1,94 mg 1,62 mg 1,21 mg 0,97 mg 0,61 mg 0,48 mg La presente invención proporciona además una composición adyuvante que comprende los componentes individuales tal como se ha definido anteriormente en el presente documento y en la cantidad definida anteriormente, por ejemplo, pero no de manera exclusiva, como se ilustra en la Tabla 1. Normalmente, dicha composición adyuvante estará en un volumen adecuado para dosis humana. Cuando el adyuvante está en forma líquida y se va a combinar con una forma líquida de una composición antigénica, la composición adyuvante estará en un volumen adecuado para dosis humana que es una fracción del volumen final previsto de la dosis humana, tal como, por ejemplo aproximadamente la mitad del volumen final previsto de la dosis humano, por ejemplo un volumen de 350 µl para una dosis humana prevista de 0,7 ml o un volumen de 250 µl para una dosis humana prevista de 0,5 ml. La composición adyuvante está diluida cuando se combina con la composición de antígeno para proporcionar la dosis humana final de la vacuna. El volumen final de dicha dosis variará, por supuesto, en función del volumen inicial de la composición adyuvante y el volumen de la composición de antígeno añadido a la composición adyuvante. En una realización alternativa, se usa un adyuvante líquido para reconstituir una composición de antígeno liofilizada. En esta realización, el volumen adecuado para la dosis humana de la composición adyuvante es aproximadamente igual al volumen final de la dosis humana. La composición adyuvante líquida se añade al vial que contiene la composición de antígeno liofilizada. La dosis humana final puede variar entre 0,5 y 1,5 ml.

El procedimiento de producción de emulsiones de aceite en agua es conocido por los expertos en la técnica. Habitualmente, el procedimiento comprende mezclar la fase de aceite que contiene tocol con un tensioactivo tal como una solución de PBS/TWEEN80™, seguido de homogenización utilizando un homogeneizador, quedará claro para un experto en la técnica que un procedimiento que comprende pasar la mezcla dos veces a través de una aguja de jeringa, puede ser adecuado para homogenizar pequeños volúmenes de líquido. Igualmente, el experto en la técnica podría adaptar el procedimiento de emulsificación en un microfluidizador (máquina M110S Microfluidics, máximo de 50 pases durante un periodo de 2 minutos a una presión máxima de entrada de 6 bares (presión de salida de aproximadamente 850 bares)) para producir volúmenes de emulsión más pequeños o más grandes. La adaptación se podrá conseguir mediante experimentación de rutina, que comprende la medición de la emulsión resultante hasta alcanzar una preparación con gotas de aceite del diámetro requerido.

En una emulsión de aceite en agua, el aceite y el emulsionante deberían estar en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

Preferentemente, los sistemas de emulsión de aceite en agua de la presente invención tienen un tamaño de gota del aceite pequeño, en el orden de los submicrómetros. Idóneamente, los tamaños de la gota estarán en el intervalo de 120 a 750 nm, más preferentemente tamaños de 120 a 600 nm de diámetro. Lo más preferentemente, la emulsión de aceite en agua contiene gotas de aceite de las que al menos el 70 % por intensidad tienen un diámetro inferior a 500 nm, más preferentemente al menos el 80 % por intensidad tienen un diámetro inferior a 300 nm, más preferentemente al menos el 90 % por intensidad tienen un diámetro en el intervalo de 120 a 200 nm.

El tamaño, es decir el diámetro, de la gota de aceite de acuerdo con la presente invención se expresa por intensidad. Existen varios modos de determinar el diámetro del tamaño de la gota de aceite por intensidad. La intensidad se mide mediante el uso de un instrumento de dimensionado, adecuadamente mediante dispersión de luz dinámica, tal como el aparato Malvern Zetasizer 4000 o, preferentemente, el aparato Malvern Zetasizer 3000HS. Un procedimiento detallado se proporciona en el ejemplo II.2. Una primera posibilidad es determinar el diámetro medio z DMZ mediante dispersión de luz dinámica (espectroscopia de correlación de fotones-PCS); este procedimiento proporciona adicionalmente el índice de polidispersidad (IPD) y tanto el DMZ como el IPD se calculan con el algoritmo de cumulantes. Estos valores no requieren el conocimiento del índice de refracción de la partícula. Un segundo medio es calcular el diámetro de la gota de aceite determinando la distribución del tamaño de la partícula entera mediante otro algoritmo, bien el Contin, o NNLS, o el "Malvern" automático (el algoritmo por defecto proporcionado por el instrumento de dimensionado). La mayor parte del tiempo, dado que el índice de refracción de la partícula de una composición compleja se desconoce, solo la distribución de la intensidad se tiene en cuenta y, si es necesario, la media de intensidad originada a partir de esta distribución.

Inmunoestimulantes opcionales

En una realización, la composición adyuvante comprende una emulsión de aceite y agua como se ha descrito en el presente documento. En una realización adicional, la composición adyuvante puede comprender además uno o más adyuvantes o inmunoestimulantes adicionales. En una realización adicional, la composición adyuvante comprende opcionalmente uno o más adyuvantes o inmunoestimulantes adicionales distintos de QS21 y / o MPL.

El adyuvante adicional opcional se selecciona del grupo: una saponina, lípido A o un derivado del mismo, un oligonucleótido inmunoestimulante, un alquilglucosaminida fosfato, una sal metálica, un agonista del receptor de tipo toll o combinaciones de los mismos. Se prefiere que el adyuvante es un agonista del receptor de tipo Toll, en particular, un agonista de un receptor de tipo Toll 2, 3, 4, 7, 8 o 9, o una saponina. Se prefiere además que el sistema adyuvante comprenda dos o más adyuvantes de la lista anterior. Las combinaciones contienen, preferentemente, una saponina (en particular QS21) adyuvante y / o un agonista 4 del receptor de tipo Toll, tal como 3D-MPL o un agonista 9 del receptor de tipo Toll, tal como un oligonucleótido inmunoestimulador que contiene CpG.

Otras combinaciones preferidas comprenden una saponina (en particular, QS21) y un agonista 4 del receptor de tipo Toll, tal como una saponina (en particular, QS21) y un ligando 4 del receptor de tipo toll tal como 3D-MPL o una alquiglucosaminida fosfato.

En una realización, el adyuvante adicional es un ligando 4 del receptor de tipo toll (TLR), preferentemente un agonista tal como un derivado del lípido, particularmente monofosforil lípido A, o, más particularmente, monofosforilo lípido A desacilado A (3 D - MPL).

El 3D-MPL está disponible con el nombre comercial MPL® de GlaxoSmithKline Biologicals North America y principalmente estimula las respuestas de células T CD4+ con un fenotipo IFN-γ (Th1). Se puede producir de acuerdo con los procedimientos divulgados en el documento GB 2 220 211 Químicamente es una mezcla de monofosforilo lípido A 3-desacilado con cadenas 3,4,5,6 aciladas. En las composiciones de la presente invención se usa 3D-MPL de partícula pequeña. El 3D-MPL de partícula pequeña tiene un tamaño de partícula tal que se puede filtrar a través de un filtro de 0,22 µm. Dichas preparaciones se describen en la solicitud de patente internacional nº WO 94/21292. Los derivados sintéticos del lípido A se conocen y se piensa que son agonistas de TLR4, incluyendo, entre otros:

OM174

(2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fosfono-β-D-glucopiranosil]-2- [(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-α-D-glucopiranosildihidrogenofosfato), (documento WO 95/14026)

OM

294

DP (3S, 9 R) -3--[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol,1,10-bis(dihidrogenofosfato) (documentos WO 99/64301 y WO 00/0462)

OM 197

MP–Ac DP (3S, 9 R) -3--[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol,1-dihidrogenofosfato 10-(6-aminohexanoato) (documento WO 46127) Otros ligandos de TLR4 que pueden usarse son alquilglucosaminida de fosfato (AGP) tales como los divulgados en el documento WO9850399 o el documento US6303347 (también se describen procedimientos para la preparación de AGP), o sales farmacéuticamente aceptables de AGP como se divulga en el documento US6764840. Algunos AGP son agonistas de TLR4, y algunos son antagonistas de TLR4. Se cree que ambos son útiles como adyuvantes.

Otros ligandos adecuados de TLR–4, capaces de producir una respuesta de señalización a través de TLR–4 (Sabroe y col., JI 2003 p1630 – 5) son, por ejemplo, lipopolisacárido de bacterias gramnegativas y sus derivados o fragmentos de los mismos, en particular un derivado no tóxico de LPS (tal como 3D–MPL). Otros agonistas de TLR adecuados son: Proteína del shock térmico (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 o 90; proteína A tensioactivo, oligosacáridos hialuronano, fragmentos de heparánsulfato, fragmentos de fibronectina, péptidos de fibrinógeno y b–defensina–2, dipéptido muramilo (MDP) o proteína F del virus sincitial respiratorio. En una realización, el agonista de TLR es HSP 60, 70 o 90.

Los receptores tipo Toll (TLR) son receptores transmembranales de tipo I, evolutivamente conservados entre los insectos y los seres humanos. Hasta ahora se han establecido diez TLR (TLR 1-10) (Sabroe y col., documento JI p1630-5 2003). Los miembros de la familia TLR tienen dominios extracelulares e intracelulares similares; se ha demostrado que sus dominios extracelulares tienen secuencias de repetición ricas el leucina, y sus dominios intracelulares son similares a la región intracelular del receptor de la interleucina - 1 (IL-1R). Las células TLR se expresan diferencialmente entre las células inmunes y otras células (incluyendo células epiteliales vasculares, adipocitos, miocitos cardiacos y células epiteliales intestinales). El dominio intracelular de los TLR puede interaccionar con la proteína adaptadora Myd88, que también posee el dominio de IL-1R en su región citoplásmica, que conduce a la activación de NF-KB de citocinas; esta vía de Myd88 es una manera por la cual la liberación de citocinas se efectúa mediante la activación de TLR. La principal expresión de los TLR está en los tipos de células, tales como las células presentadoras de antígeno (por ejemplo, células dendríticas, macrófagos, etc.).

La activación de las células dendríticas por la estimulación a través de TLR conduce a la maduración de las células dendríticas y la producción de citocinas inflamatorias tales como IL-12. La investigación llevada a cabo hasta ahora ha encontrado que los TLR reconocen diferentes tipos de agonistas, aunque algunos agonistas son comunes a varios TLR. Los agonistas de TLR derivan predominantemente de bacterias o virus, e incluyen moléculas tales como flagelina o lipopolisacárido bacteriano (LPS).

Por "agonista de TLR" se entiende un componente que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de una vía de señalización de TLR, ya sea como ligando directo o indirectamente a través de la generación de ligando endógeno o exógeno (Sabroe y col., documento JI 2.003 p1630-5).

En otra realización, otros agonistas naturales o sintéticos de las moléculas de TLR se utilizan como inmunoestimulantes adicionales opcionales. Estos podrían incluir, pero no se limitan a, agonistas para TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9.

En una realización de la presente invención, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-1 (Sabroe y col., documento JI 2.003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-1 se selecciona de: Lipopéptidos tri-acilados (LP); modulina soluble en fenol; LP de Mycobacterium tuberculosis; S–(2,3–bis(palmitoiloxi)–(2–RS)–propil)–N–palmitoil– (R)–Cys–(S)–Ser–(S)–Lys(4)–OH, LP trihidrocloruro (Pam3Cys) que imita al extremo amino acetilado de una lipoproteína bacteriana y OspA LP de Borrelia burgdorfei.

En una realización alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-2 (Sabroe y col., documento JI 2.003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-2 es uno o más de una lipoproteína, un peptidoglicano, un lipopéptido bacteriano de M. tuberculosis, B burgdorferi, T pallidum; glicanos de especies, incluido Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicoicos, ácidos manurónico, porinas de Neisseria, fimbrias bacterianas, factores de virulencia de Yersina, viriones de CMV, hemaglutinina del sarampión y zimosán de levaduras.

En una realización alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-3 (Sabroe y col., documento JI 2.003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-3 es ARN de doble cadena (ARNdc), o ácido poliinosínico- policitidílico (poli IC), un patrón de ácido nucleico molecular asociado con la infección viral.

En una realización alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-5 (Sabroe y col., documento JI 2.003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-5 es flagelina bacteriana.

En una realización alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-6 (Sabroe y col., documento JI 2.003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-6 es la lipoproteína de micobacterias, LP diacilado y modulina soluble en fenol. Otros agonistas de TLR6 se describen en el documento WO2003043572.

En una realización alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-7 (Sabroe y col., documento JI 2.003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-7 es un ARN de cadena única (ARNcu), loxoribina, un análogo de guanosina en las posiciones N7 y C8, o un compuesto de imidazoquinolina, o derivado del mismo. En una realización, el agonista de TLR es imiquimod. Otros agonistas de TLR7 se describen en el documento WO02085905.

En una realización alternativa, se usa un agonista de TLR que es capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-8 (Sabroe y col., documento JI 2.003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR capaz de causar una respuesta de señalización a través de TLR-8 es un ARN de cadena única (ARNcu), una molécula de imidazoquinolina con actividad antiviral, por ejemplo resiquimod (R848); resiquimod también es capaz de reconocimiento por parte de TLR-7. Otros agonistas de TLR-8 que se pueden usar incluyen los descritos en el documento WO2004071459.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores o cualquier otro agonista 9 del receptor de tipo toll (TLR) también se pueden utilizar. Los oligonucleótidos preferidos para uso en adyuvantes o vacunas o composiciones inmunogénicas de la presente invención son oligonucleótidos que contienen CpG, que contienen, preferentemente, dos o más motivos CpG dinucleótidos separados por al menos tres, más preferentemente al menos seis o más nucleótidos. Un motivo CpG es un nucleótido de citosina seguido de un nucleótido de guanina. Los oligonucleótidos de CpG de la presente invención son típicamente desoxinucleótidos. En una realización preferida, el internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o más preferentemente un enlace fosforotioato, aunque los enlaces fosfodiéster y otros enlaces internucleotídicos están dentro del alcance de la invención. También se incluyen dentro del alcance de la invención oligonucleótidos con enlaces internucleotídicos mixtos. Los procedimientos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato se describen en los documentos US5.666.153, US5.278.302 y WO95 / 26204.

Los ejemplos de oligonucleótidos preferidos tienen las siguientes secuencias. Las secuencias preferentemente contienen enlaces internucleotídicos modificados con fosforotioato modificado.

OLIGO 1(SEC ID Nº 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEC ID Nº 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3(SEC ID Nº 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEC ID Nº 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEC ID Nº 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) OLIGO 6 (SEC ID Nº 6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) Oligonucleótidos CpG alternativos pueden comprender las secuencias preferidas anteriormente en cuanto a que tienen deleciones o adiciones a los mismos intrascendentes. Los oligonucleótidos CpG utilizados en la presente invención se pueden sintetizar por cualquier procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, véase el documento EP 468 520). Convenientemente, tales oligonucleótidos pueden sintetizarse utilizando un sintetizador automático.

Por consiguiente, en otra realización, la composición adyuvante comprende además un inmunoestimulante adicional que se selecciona del grupo que consiste en: un agonista de TLR-1, un agonista de TLR-2, agonista de TLR-3, un agonista de TLR-4, un agonista de TLR-5, un agonista de TLR-6, un agonista de TLR-7, un agonista de TLR-8, un agonista de TLR-9, o una combinación de los mismos.

Otros inmunoestimulantes preferidos para usar en la presente invención es Quil A y sus derivados. Quil A es una preparación de saponina aislada del árbol de Sudamérica Quillaja Saponaria Molina y Dalsgaard y col. en 1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlín, p243 – 254). Mediante HPLC se han aislado fragmentos purificados de Quil A que conservan actividad adyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (documento EP 0 362 278), por ejemplo QS7 y QS21 (también conocidas como QA7 y QA21). La QS-21 es una saponina natural derivada de la corteza de Quillaja saponaria Molina, que induce linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, células TH1 y una respuesta de anticuerpos IgG2a predominante, y es una saponina preferida en el contexto de la presente invención.

Se han descrito formulaciones concretas de QS21 que son particularmente preferidas, estas formulaciones comprenden además un esterol (documento WO96/33739). Cuando se incluyen escualeno y una saponina (opcionalmente QS21), es beneficioso incluir también un esterol (opcionalmente, colesterol) a la formulación, ya que esto permite una reducción en el nivel total de aceite en la emulsión. Esto conduce a una reducción de los costes de fabricación la mejora de la comodidad general de la vacunación, y también mejoras cualitativas y cuantitativas de las respuestas inmunitarias resultantes, tal como la mejora de la producción de IFN-γ. Por consiguiente, el sistema adyuvante de la presente invención comprende típicamente una relación de aceite metabolizable: saponina (p / p) en el intervalo de 200:1 a 300:1, también puede usarse la presente invención en una forma "pobre en aceite " cuyo intervalo opcional es de 1:1 a 200:1, opcionalmente de 20:1 a 100:1, o sustancialmente 48:1, esta vacuna retiene las propiedades adyuvantes beneficiosas de todos los componentes, con un perfil de reactogenicidad muy reducido. Por consiguiente, algunas realizaciones tienen una proporción de escualeno: QS21 (p / p) en el intervalo de 1: p1 a 250: 1p, o de 20:1 a 200:1, o de 20:1 a 100:1, o sustancialmente 48:1. Opcionalmente, un esterol (por ejemplo colesterol) también se incluye presente en una relación de saponina:esterol tal como se describe en el presente documento.

Antígenos y composición antigénica

Las formulaciones de vacuna o inmunogénicas contienen un antígeno de Streptococcus pneumoniae a con la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria contra un patógeno humano o animal. Cuando el antígeno neumocócico es una proteína, la proteína está, opcionalmente, conjugada con un sacárido. Opcionalmente, la proteína no está conjugada o presente en la composición inmunogénica como una proteína libre. Una proteína no conjugada no está unida covalentemente a un sacárido como una proteína vehículo.

En una forma de realización de la invención, la composición inmunogénica de la invención comprende una proteína neumocócica que es, opcionalmente, un miembro de las proteínas de la familia de tríada de polihistidina (HTP), fragmentos o proteínas de fusión o equivalente inmunológicamente funcional de las mismas. Las proteínas PhtA, PhtB, PhtD o PhtE puede tener una secuencia de aminoácidos que comparte un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con una secuencia divulgada en el documento WO 00/37105 o el documento WO 00 / 39299 (por ejemplo, con la secuencia de aminoácidos 1-838 o 21-838 de la SEC ID Nº 4 del documento WO 00/37105 para PhtD). Por ejemplo, las proteínas de fusión están compuestas de la longitud completa o fragmentos de 2, 3 o 4 de PhtA, PhtB, PhtD, PhtE. Ejemplos de proteínas de fusión son PhtA/B, PhtA/D, PhtA/E, PhtB/A, PhtB/D, PhtB/E. PhtD/A. PhtD/B, PhtD/E, PhtE/A, PhtE/B y PhtE/D, en las que las proteínas están unidas al mencionado en primer lugar en el extremo N-terminal (véase, por ejemplo, el documento WO01 / 98334).

Cuando se utilizan fragmentos de proteínas Pht (por separado o como parte de una proteína de fusión), cada fragmento contiene opcionalmente uno o más motivos de la tríada de histidina tríada y / o regiones superenrolladas de dichos polipéptidos. Un motivo de tríada de histidina es la parte del polipéptido que tiene la secuencia HxxHxH en la que H es histidina y x es un aminoácido distinto de histidina. Una región superenrolladas es una región predicha por el algoritmo para "bobinas" de Lupus, A y col., (1991) Science 252; 1162 – 1164. En una realización, el o cada fragmento incluye uno o más motivos de tríada de histidina, así como al menos una región superenrollada. En una realización, el o cada fragmento contiene exactamente o al menos 2, 3, 4 o 5 motivos de la tríada de histidina (opcionalmente, con la secuencia nativa de Pht entre las 2 o más tríadas, o la secuencia intra-tríada secuencia que es más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % idéntica a una secuencia de Pht intratríada nativa neumocócica, por ejemplo, la secuencia intra-tríada se muestra en la SEC ID Nº 4 del documento WO 00/37105 para PhtD). En una realización, el o cada fragmento contiene exactamente o al menos 2, 3 o 4 regiones superenrolladas. En una realización, una proteína Pht divulgada en el presente documento incluye la proteína de longitud completa con la secuencia señal unida, la proteína madura de longitud completa con el péptido señal (por ejemplo, 20 aminoácidos en el extremo N- terminal) eliminada, variantes naturales de la proteína Pht y fragmentos inmunogénicos de la proteína Pht (por ejemplo, fragmentos como se ha descrito anteriormente o polipéptidos que comprenden al menos 15 o 20 aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos en el documento WO00 / 37105 o WO00 / 39299 donde dicho polipéptido es capaz de provocar una respuesta inmunitaria específica para dicha secuencia de aminoácidos en WO00 / 37105 o WO00 / 39299).

En particular, el término “PhtD", como se usa en el presente documento, incluye la proteína de longitud completa con la secuencia señal unida, la proteína madura de longitud completa con el péptido señal (por ejemplo, 20 aminoácidos en el extremo N-terminal) eliminada, variantes naturales de la proteína de PhtD y fragmentos inmunogénicos de PhtD (por ejemplo, fragmentos como se ha descrito anteriormente o polipéptidos que comprenden al menos 15 o 20 aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos de PhtD en el documento WO00 / 37105 o el documento WO00 / 39299, en el que dicho polipéptido es capaz de provocar una respuesta inmunitaria específica para dicha secuencia de aminoácidos de PhtD en el documento WO00 / 37105 o el documento WO00 / 39299 (por ejemplo, la SEC ID Nº 4 del documento WO 00/37105 para PhtD).

En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende al menos 1 proteína seleccionada del grupo que consiste en la familia de la tríada de polihistidina (PhtX), la familia de la proteína de unión a colina (CbpX), truncamientos de CbpX, la familia LytX, truncamientos de LytX, proteínas quiméricas (o fusiones) de truncamiento de CbpX- truncamiento de LytX, neumolisina (Ply), PspA, PsaA, SP128, SP101, Sp130, SP125 y SP133. En una realización adicional, la composición inmunogénica comprende 2 o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en la familia de la tríada de polihistidina (PhtX), la familia de la proteína de unión a colina (CbpX), truncamientos de CbpX, la familia LytX, truncamientos de LytX, proteínas quiméricas (o fusiones) de truncamiento de CbpX- truncamiento de LytX, neumolisina (Ply), PspA, PsaA y SP128. En una realización más, la composición inmunogénica comprende 2 o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en la familia de la tríada de polihistidina (PhtX), la familia de la proteína de unión a colina (CbpX), truncamientos de CbpX, la familia LytX, truncamientos de LytX, proteínas quiméricas (o fusiones) de truncamiento de CbpX- truncamiento de LytX, neumolisina (Ply) y SP128.

La familia Pht (tríada de poli histidina) de comprende proteínas PhtA, PhtB, PhtD y PhtE. La familia se caracteriza por una secuencia de lipidación, dos dominios separados por una región rica en prolina y varias tríadas de histidina, posiblemente implicadas en la unión al metal o al nucleósido o actividad enzimática, regiones superenrolladas (3 - 5), un extremo N conservado y un extremo C heterogéneo. Está presente en todas las cepas de neumococos analizadas. También se han encontrado proteínas homólogas en otros estreptococos y Neisseria. En una realización de la invención, la proteína Pht de la invención es PhtD. Se entiende, sin embargo, que los términos Pht A, B, D, y E se refieren a proteínas que tienen secuencias divulgadas en las citas siguientes, así como variantes de origen natural (y hechas por el hombre) de las mismas que tienen una homología de secuencia que es al menos 90 % idéntica a las proteínas citadas. Opcionalmente es al menos un 95 % idéntica, o al menos un 97 % idéntica.

Con respecto a las proteínas PhtX, PhtA se divulga en el documento WO 98/18930, y también se denomina Sp36.

Como se ha indicado anteriormente, es una proteína de la familia de la tríada de polihistidina y tiene el motivo de señal de tipo II de LXXC. PhtD se divulga en el documento WO 00/37105, y también se denomina Sp036D. Como se ha indicado anteriormente, también es una proteína de la familia de la tríada de polihistidina y tiene el motivo de señal de tipo II de LXXC. PhtB se divulga en el documento WO 00/37105, y también se denomina Sp036B. Otro miembro de la familia PhtB es el polipéptido de degradación de C3 como se divulga el documento WO 00/17370. Esta proteína también es de la familia de la tríada de polihistidina y tiene el motivo de señal de tipo II LXXC. Por ejemplo, un equivalente inmunológicamente funcional es la proteína SP42 divulgada en el documento WO 98/18930. A truncamiento de PhtB (de aproximadamente 79 kDa) se divulga en el documento WO99 / 15675 que también se considera un miembro de la familia PhtX. PhtE se divulga en el documento WO00 / 30299 y se denomina BVH-3.

Cuando se haga referencia a cualquier proteína Pht en el presente documento, se entiende que se pueden usar los fragmentos inmunogénicos o fusiones de los mismos de la proteína Pht inmunogénicas. Por ejemplo, una referencia a PhtX incluye fragmentos inmunogénicos o fusiones de los mismos de cualquier proteína Pht. Una referencia a PhtD o PhtB es también una referencia a las fusiones PhtDE o PhtBE tal como se encuentra, por ejemplo, en el documento WO0198334.

La neumolisina es una toxina multifuncional con distintas actividades citolíticas (hemolíticas) y de activación del complemento (Rubins y col., Am. Respi. Cit Care Med, 153:1339 – 1346 (1996)). La toxina no es secretada por neumococos, pero se libera tras la lisis de los neumococos bajo la influencia de autolisina. Sus efectos incluyen, por ejemplo, la estimulación de la producción de citocinas inflamatorias por monocitos humanos, la inhibición del batido los cilios sobre el epitelio respiratorio humano y la disminución de la actividad bactericida y la migración de los neutrófilos. El efecto más obvio de la neumolisina está en la lisis de los glóbulos rojos de la sangre, que implica la unión al colesterol. Debido a que es una toxina, tiene que estar destoxificada (es decir, no tóxica para un ser humano cuando se proporciona en una dosificación adecuada para la protección) antes de que pueda administrarse in vivo. La expresión y clonación de la neumolisina nativa o salvaje se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Walker y col., (Infect Immun, 55:1184 – 1189 (1987)), Mitchell y col., (Biochim Biophys Acta, 1007:67 – 72 (1989) y Mitchell y col., (NAR, 18:4010 (1990)). La destoxificación de ply puede realizarse por medios químicos, por ejemplo, mediante tratamiento con formalina o glutaraldehído o con una combinación de ambos (documentos WO 04081515, PCT/EP2005/010258). Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica para diversas toxinas. Como alternativa, ply se puede destoxificar genéticamente. Por lo tanto, la invención abarca derivados de las proteínas neumocócicas que pueden ser, por ejemplo, proteínas mutadas. El término “mutado” se usa en el presente documento para querer decir una molécula proteica que ha sufrido deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos usando técnicas bien conocidas para mutagénesis dirigida a sitio o cualquier otro procedimiento convencional. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, una proteína ply mutante puede alterarse de modo que sea biológicamente inactiva al mismo tiempo que mantiene sus epítopos inmunogénicos, véase, por ejemplo, el documento WO90/06951, Berry y col.,. (Infect Immun, 67:981 – 985 (1999)) y el documento WO99/03884.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término “Ply” se refiere a neumolisina mutada o destoxificada adecuada para uso médico (es decir, no tóxica).

Con referencia a la familia de proteínas de unión a colina (CbpX), los miembros de esa familia se identificaron originalmente como proteínas neumocócicas que podían purificarse mediante cromatografía de afinidad con colina. Todas las proteínas de unión a colina están unidas no covalentemente a restos de fosforilcolina del ácido teicoico de la pared celular y el ácido lipoteicoico asociado a membrana. Estructuralmente, tienen varias regiones en común en toda la familia, aunque la naturaleza exacta de las proteínas (secuencia de aminoácidos, longitud, etc.) puede variar. En general, las proteínas de unión a colina comprenden una región N-terminal (N), regiones repetidas conservadas (R1 y/o R2), una región rica en prolina (P) y una región de unión a colina conservada (C), compuesta por múltiples repeticiones, que comprende aproximadamente la mitad de la proteína. Como se usa en esta solicitud, la expresión “familia de proteínas de unión a colina (CbpX)” se selecciona del grupo que consiste en proteínas de unión a colina como se identifican en el documento WO97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD, y CbpG. CbpA se divulga en el documento WO97/41151. CbpD y CbpG se divulgan en el documento WO00/29434. PspC se divulga en el documento WO97/09994. PbcA se divulga en el documento WO98/21337.SpsA es una proteína de unión a colina divulgada en el documento WO 98/39450. Opcionalmente, las proteínas de unión a colina se seleccionan del grupo que consiste en CbpA, PbcA, SpsA y PspC.

Una realización de la invención comprende truncamientos de CbpX, en los que “CbpX” se ha definido anteriormente y “truncamientos” se refiere a las proteínas CbpX que carecen del 50 % o más de la región de unión a colina (C). Opcionalmente, dichas proteínas carecen de la totalidad de la región de unión a colina. Opcionalmente, dichos truncamientos de proteína carecen de (i) la región de unión a colina y de (ii) una parte de la mitad N-terminal de la proteína también, aunque al mismo tiempo retienen al menos una región repetida (R1 o R2). Opcionalmente, el truncamiento tiene 2 regiones repetidas (R1 y R2). Ejemplos de dichas realizaciones son NR1xR2 y R1xR2 como se ilustra en el documento WO99/51266, no obstante también se contemplan dentro del alcance de la presente invención otras proteínas de unión a colina que carecen de una región de unión a colina similar.

La familia LytX está constituida por proteínas asociadas a membrana asociadas a la lisis celular. El dominio N- terminal comprende el o los dominios de unión a colina, sin embargo, la familia LytX no tiene todas las características encontradas en la familia CbpA indicadas anteriormente y, por tanto, para la presente invención, la familia LytX se considera distinta de la familia CbpX. En contraste con la familia CbpX, el dominio C-terminal contiene el dominio catalítico de la familia de proteína LytX. La familia comprende LytA, B y C. Con respecto a la familia LytX, LytA se divulga en Ronda y col., Eur J Biochem, 164:621 – 624 (1987). LytB se divulga en el documento WO 98/18930 y también se denomina Sp46. LytC se divulga en el documento WO 98/18930 y también se denomina Sp91. Una realización de la invención comprende LytC.

Otra realización comprende truncamientos LytX en los que “LytX” se ha definido anteriormente y “truncamientos” se refiere a proteínas LytX que carecen del 5 0 % o más de la región de unión a colina. Opcionalmente, dichas proteínas carecen de la totalidad de la región de unión a colina. Otra realización más de la presente invención comprende las proteínas quiméricas (o fusiones) truncamiento CbpX-truncamiento LytX. Opcionalmente esto comprende NR1xR2 (o R1xR2) de CbpX y la parte C-terminal (Cterm, es decir, que carece de los dominios de unión a colina) de LytX (por ejemplo, LytCCterm o Sp91 Cterm). Opcionalmente, CbpX se selecciona del grupo que consiste en CbpA, PbcA, SpsA y PspC. Opcionalmente es CbpA. Opcionalmente, LytX es LytC (también conocido como Sp91). Otra realización de la presente invención es un truncamiento PspA o PsaA que carece del dominio de unión a colina (C) y se expresa como una proteína de fusión con LytX. Opcionalmente LytX es LytC.

Con respecto a PsaA y PspA, ambas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, PsaA y variantes de deleción transmembrana de la misma se han descrito en Berr y Paton, Infect Immun 1996 Dic; 64 (12):5255-62. PspA y variantes de deleción transmembrana de la misma se han divulgado en, por ejemplo, el documento US5804193, el documento WO92/14488, y el documento WO99/53940.

Sp128 y Sp130 se divulgan en el documento WO00/76540. Sp125 es un ejemplo de una proteína superficial de neumococos con el motivo de anclaje a la pared celular de LPXTG (en el que X es cualquier aminoácido). Se ha descubierto que cualquier proteína dentro de esta clase de proteínas superficiales de neumococos con este motivo es útil dentro del contexto de la presente invención, y, por lo tanto, se considera una proteína adicional de la invención. La propia Sp125 se divulga en el documento WO98/18930 y también se conoce como ZmpB, una metaloproteinasa de cinc. Sp101 se divulga en el documento WO98/06734 (en el que tiene el número de referencia y85993). Se caracteriza por una secuencia señal Tipo I. Sp133 se divulga en el documento WO98/06734 (en el que tiene el número de referencia y85992). También se caracteriza por una secuencia señal Tipo I.

Las proteínas de la invención también se pueden combinar de forma beneficiosa. Por combinado se entiende que la composición inmunogénica comprende todas las proteínas de las siguientes combinaciones, ya sea como proteínas vehículo o como proteínas libres o una mezcla de las dos. Por ejemplo, en una combinación de dos proteínas expuestas anteriormente en este documento, ambas proteínas pueden usarse como proteínas vehículo, o ambas proteínas pueden estar presentes como proteínas libres, o ambas pueden estar presentes como proteína vehículo y proteína libre, o una puede estar presente como proteína vehículo y una proteína libre mientras que la otra está presente solamente como una proteína vehículo o solamente como una proteína libre, o una puede estar presentes como proteína vehículo y la otra como proteína libre. Cuando se da una combinación de tres proteínas, existen posibilidades similares. Las combinaciones incluyen, aunque sin limitaciones, PhtD + proteínas quiméricas o de fusión NR1xR2-Sp91Cterm, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + proteínas quiméricas o de fusión NR1xR2-Sp91Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. Opcionalmente, NR1xR2 (o R1xR2) es de CbpA o PspC. Opcionalmente es de CbpA. Otras combinaciones incluyen tres combinaciones proteicas tales como PhtD + NR1xR2 + Ply, y PhtA + NR1xR2 + PhtD. En una realización, la composición de vacuna comprende neumolisina destoxificada y PhtD o PhtDE como proteínas vehículo. En una realización adicional, la composición de vacuna comprende neumolisina destoxificada y PhtD o PhtDE como proteínas libres.

Una respuesta inmunitaria eficaz contra PhtD o la proteína de fusión del mismo se mide, por ejemplo, mediante un ensayo de protección tal como el descrito en el Ejemplo 15. Una respuesta inmunitaria eficaz proporciona al menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de supervivencia 7 días después de la exposición con una cepa heteróloga. Dado que la cepa de exposición es heteróloga, la protección ofrecida se debe a la respuesta inmunitaria contra PhtD o la proteína de fusión de la misma.

Como alternativa, una respuesta inmunitaria eficaz contra PhtD se mide mediante ELISA como se describe en el Ejemplo 14. Una respuesta inmunitaria eficaz da una respuesta de tipo IgG anti-PhtD de al menos 250, 300, 350, 400, 500, 550 o 600 µg/ml de GMC.

En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende neumolisina.

En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende una proteína neumocócica divulgada en el documento US6699703, por ejemplo, la proteína neumocócica que tiene la secuencia o codificada por la secuencia de las SEC ID Nº 1 – 5.326 del documento US6699703.

En una realización de la invención, la composición inmunogénica comprende una proteína neumocócica que no se divulga en el documento PCT / EP2007 / 060743.

La presente invención proporciona adicionalmente una vacuna que comprende las composiciones inmunogénicas de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende una proteína neumocócica seleccionada del grupo que consiste en PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, LytB, LytC, LytA, SP125, SP101, Sp128, Sp130, SP133 o proteínas divulgadas en el documento US6699703, incluyendo las proteínas de S. pneumoniae representadas o codificadas por las SEC ID Nº 5225, 5200, 3166, 4360, 5137, 4263, 3166, 5226, 3716, 4360, 5243, 3964, 5179, 3850, 4263, 5137, 5226, 5325, 3850, 5179 o 5325 del documento US6699703, o un equivalente inmunológicamente funcional de las mismas. Equivalentes inmunológicamente funcionales incluyen secuencias que comparten una identidad de al menos 80, 90, 95, 98 o 99 % con la secuencia indicada. Equivalentes inmunológicamente funcionales también incluyen fragmentos que tienen una identidad de al menos 6, 10, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos contiguos de la secuencia indicada. Los equivalentes inmunológicamente funcionales son capaces de provocar una respuesta inmunitaria que reconoce el antígeno nativo.

Vacunación

Las preparaciones de vacunas que contienen composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden usar para proteger o tratar a un mamífero susceptible a la infección administrando dicha vacuna por medio de una vía sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante administración mucosa en los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario. Aunque la vacuna de la invención se puede administrar como una dosis única, los componentes de la misma también se pueden coadministrar juntos al mismo tiempo o a tiempos diferentes (por ejemplo, los conjugados de sacáridos neumocócicos se podrían administrar por separado, al mismo tiempo o 12 semanas después de la administración de cualquier componente de la proteína bacteriana de la vacuna para la coordinación óptima de las respuestas inmunitarias unas con respecto de otras). Además, las vacunas de la invención se pueden administrar i.m. para las dosis primeras e i.n. para las dosis de refuerzo.

El contenido de antígenos proteicos en la vacuna normalmente estará en el intervalo de 1 - 100 μg, preferentemente 5 - 50 μg, lo más habitualmente en el intervalo de 5 – 25 μg. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente.

La preparación de las vacunas está descrita en general en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach (eds Powell M. F. y Newman M. J.) (1995) Plenum Press Nueva York”). La encapsulación en liposomas la describe Fullerton, en la patente de EE.UU. 4.235.877.

Las vacunas de la presente invención se pueden almacenar en solución o liofilizadas. Preferentemente, la solución está liofilizada en presencia de un azúcar, tal como sacarosa o lactosa. Todavía es más preferible que estén liofilizadas y se reconstituyan de forma extemporánea antes de usar.

En un aspecto de la invención se proporciona un kit de vacuna, que comprende un vial que contiene una composición inmunogénica de la invención, opcionalmente en forma liofilizada y que además comprende un vial que contiene un adyuvante como se describe en el presente documento. Se ha concebido que en este aspecto de la invención, el adyuvante se use para reconstituir la composición inmunogénica liofilizada.

Aunque las vacunas de la presente invención se pueden administrar por cualquier vía, la administración de las vacunas descritas en la piel (i.d.) forma una realización de la presente invención. La piel humana comprende una cutícula externa “espinosa”, denominada estrato córneo, encima de la epidermis. Debajo de esta epidermis hay una capa que se denomina dermis que, a su vez, está encima de tejido subcutáneo. Los investigadores han demostrado que la inyección de una vacuna en la piel y, en particular, la dermis, estimula una respuesta inmunitaria, que también puede estar asociada con una serie de ventajas adicionales. La vacunación intradérmica con las vacunas descritas en la presente invención forma una característica preferida de la presente invención.

La técnica convencional de inyección intradérmica, el "procedimiento de mantoux”, comprende las etapas de limpiar la piel y, después, estirando con una mano y con el bisel de una aguja de calibre estrecho (26 – 31 gauge) hacia arriba, se inserta la aguja en un ángulo de entre 10 - 15°. Una vez que el bisel de la aguja se ha insertado, se baja el émbolo y se hace avanzar proporcionando al mismo tiempo una ligera presión para elevarlo debajo de la piel. Después, el líquido se inyecta muy despacio formando una vesícula o bulto sobre la superficie de la piel, seguido de una lenta retirada de la aguja.

Más recientemente se han descrito dispositivos específicamente diseñados para administrar agentes líquidos en o a través de la piel, por ejemplo los dispositivos descritos en los documentos WO 99/34850 and EP 1092444, también los dispositivos de inyección de chorro descritos en, por ejemplo, los documentos WO 01/13977; US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520 , 639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 y WO 97/13537. Procedimientos alternativos de administración intradérmica de las preparaciones de la vacuna pueden incluir jeringuillas y agujas convencionales diseñadas para administración balística de vacunas sólidas (documento WO 99/27961) o parches transdérmicos (documentos WO 97/48440; WO 98/28037); o de aplicación a la superficie de la piel (liberación transdérmica o transcutánea, documentos WO 98/20734; WO 98/28037).

Cuando las vacunas de la presente invención se van a administrar a la piel o, más específicamente, en la dermis, la vacuna está en un volumen de líquido bajo, en particular un volumen entre aproximadamente 0,05 ml y 0,2 ml.

El contenido en antígenos en la piel o vacunas intradérmicas de la presente invención puede ser similar a las dosis convencionales como se encuentran en las vacunas intramusculares (véase anteriormente). No obstante, es una característica de las vacunas en la piel o intradérmicas que las formulaciones puedan ser de “dosis baja”. De acuerdo con lo anterior, los antígenos proteicos en las vacunas de “dosis baja” están presentes, preferentemente, en tan poco como de 0,1 a 10 µg, preferentemente de 0,1 a 5 µg por dosis; y los antígenos sacáridos (preferentemente conjugados) pueden estar presentes en el intervalo de 0,01 1 - 1 µg, y, preferentemente, entre 0,01 1 a 0,5 µg de sacárido por dosis.

Como se usa en el presente documento, la expresión "liberación intradérmica” quiere decir la liberación de la vacuna en la región de la dermis en la piel. No obstante, la vacuna no necesariamente se localizará exclusivamente en la dermis. La dermis es la capa de la piel localizada entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 2,0 mm de la superficie de la piel humana, pero existe una cierta cantidad de variación entre individuos y en diferentes partes del cuerpo. En general, se puede esperar alcanzar la dermis a 1,5 mm por debajo de la superficie de la piel. La dermis se localiza entre el estrato córneo y la epidermis, en la superficie y la capa subcutánea de debajo. Dependiendo del modo de administración, la vacuna puede localizarse en última instancia, única o principalmente, dentro de la dermis o, en última instancia, se puede distribuir en la epidermis y la dermis.

La cantidad de cada antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que incluye una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en los vacunados típicos. Tal cantidad variará en función de qué inmunógenos específicos se emplean y de la manera en que se presenten.

En una realización adicional, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un individuo susceptible o que está sufriendo una enfermedad mediante la administración de una composición tal como se describe sustancialmente en el presente documento.

También se proporciona un procedimiento para prevenir que un individuo contraiga una enfermedad seleccionada del grupo que comprende enfermedades infecciosas bacterianas y virales, enfermedades parasitarias, especialmente enfermedades patogénicas intracelulares, enfermedades proliferativas tales como cáncer de próstata, de mama, colorrectal, de pulmón, pancreática, renal, de ovarios o melanoma; trastornos crónicos no cancerosos, alergia que comprende la administración a dicho individuo de una composición como se ha descrito sustancialmente en el presente documento sustancialmente.

En una realización adicional, se proporciona una composición de vacuna para su uso en la terapia profiláctica o terapia de una afección o enfermedad en la que la composición de vacuna comprende un antígeno o composición de antígeno y una composición adyuvante que consiste en una emulsión de aceite en agua que comprende 0,5 – 10 mg de aceite metabolizable, 0,5 – 11 mg de tocol y 0,1 – 4 mg de agente emulsionante, por dosis humana.

En una realización adicional, se proporciona el uso de una composición de vacuna en la fabricación de un medicamento para su uso en la terapia profiláctica o terapia de una afección o enfermedad en la que la composición de vacuna comprende un antígeno o composición de antígeno y una composición adyuvante que consiste en una emulsión de aceite en agua que comprende 0,5 – 10 mg de aceite metabolizable, 0,5 – 11 mg de tocol y 0,1 – 4 mg de agente emulsionante, por dosis humana.

La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes: El Ejemplo I describe procedimientos de lectura inmunológicos usados en estudios con ratones, hurones, ceros y seres humanos.

El Ejemplo II describe la preparación de la emulsión de aceite en agua y las formulaciones adyuvantes usadas en los estudios ilustrados.

El Ejemplo III muestra un ensayo clínico en una población adulta de 18 - 59 años de edad con una vacuna que contiene una preparación del antígeno contra la gripe fraccionada y varias dosis de adyuvante AS03.

El Ejemplo IV muestra una evaluación preclínica de vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03) en ratones BALBNc sensibilizados.

El Ejemplo V muestra una evaluación preclínica de vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03) en ratones C57BI/6 sensibilizados.

El Ejemplo V muestra una evaluación preclínica de vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03 y dosis bajas de antígeno) en ratones C57BI/6 sensibilizados.

El Ejemplo VII muestra una evaluación preclínica de vacunas contra la H5N1 fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03 y dosis bajas de antígeno) en ratones C57BI/6 no sensibilizados previamente.

El Ejemplo VIII muestra una evaluación preclínica de vacunas contra la gripe adyuvantadas y no adyuvantadas en cerdos Large White sensibilizados.

Ejemplo I – Procedimientos de lectura inmunológica

I.1. Procedimientos en ratones

I.1.1. Prueba de inhibición de la hemaglutinación

Principio de la prueba (procedimiento clásico).

Los títulos de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe (estacionales) se determinan usando la prueba de la inhibición de la hemaglutinación (IH). El principio de la prueba de la IH se basa en la capacidad de los anticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de glóbulos tojos (RBC) por la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. Los sueros inactivados con calor se tratan con caolín y RBC para eliminar los inhibidores no específicos. Tras el pretratamiento, diluciones de dos en dos de suero se incuban con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación se añaden glóbulos rojos y se puntúa la inhibición de la aglutinación. Los títulos se expresan como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo la hemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 1:20, un nivel indetectable se puntúa omo un título igual a 10.

Adaptación para H5N1 (descripción específica de HI usando eritrocitos de caballo):

Como se documento que el ensayo de HI clásico para determinar anticuerpos anti-HA no funcionaba bien para la cepa H5N1, se usó un protocolo adaptado usando RBC de caballo. Se usan eritrocitos de caballo para las cepas H5N1 pandémicas. Suspensión al 0,5 % (concentración final) de eritrocitos de caballo en tampón fosfato que contiene 0,5 % de BSA (seroalbúmina bovina, concentración final). Esta suspensión se prepara cada día mediante lavado de los glóbulos rojos con el mismo tampón fosfato y una etapa de centrifugación posterior (10 min, 2000 rpm). Esta etapa de lavado se tiene que repetir una vez. Después de la adición de los glóbulos rojos de caballo a la mezcla de reacción de los sueros y suspensión de virus, las placas tienen que incubarse a temperatura ambiente (TA, 20 °C +/– 2 °C) durante dos horas debido a la baja tasa de sedimentación de los glóbulos rojos de caballo.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron en títulos de HI después de la vacunación usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:  Transformación log de los datos  Prueba de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupos  Prueba de Cochran para verificar la homogeneicidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos)  Análisis de la varianza en datos seleccionados.

 Prueba para la interacción de ANOVA bilateral.

 Prueba de Tukey HSD para comparaciones múltiples I.1.2. Tinción intracelular de citocinas Esta técnica permite una cuantificación de linfocitos T específicos de antígeno sobre la base de la producción de citocinas. Las células T efectoras y/o las células T de memoria-efectoras producen IFN-γ y las células T de memoria central producen IL-2. Las PBMC se recogen el día 7 después de la inmunización.

Las células linfoides se reestimulan in vitro en presencia de un inhibidor de la secreción ((Brefeldine): Estas células se procesan a continuación mediante procedimiento de inmunofluorescencia convencional usando anticuerpos fluorescentes (CD4, CD8, IFN-γ e IL-2). Los resultados se expresan en forma de frecuencia de células positivas para citocinas en las células T CD4/CD8. La tinción intracelular de las citocinas de las células T se realizó en las PBMC 7 días después de la segunda inmunización. Se recogió sangre de ratones y se agrupó en medio heparinizado RPMI + Ad. Para la sangre se estratificaron RPMI + suspensiones de PBL diluidas con Add en un gradiente de linfolito- mamífero de acuerdo con el protocolo recomendado (centrífuga 20 minutos a 2500 rpm a TA). Las células mononucleares en la interfase se extrajeron, se lavaron 2 veces en RPMI + Ad y las suspensiones de PBMC se ajustaron a to 2 x 106 células/ml en RPMI con 5 % de suero bovino fetal.

La estimulación antigénica in vitro de las PBMC se llevó a cabo a una concentración final de 1 x 107 células/ml (en tubo para FACS) con FI completo (1 µg de HA/cepa) y después se incubó 2 horas a 37 ºC con la adición de anti- CD28 y anti-CD49d (1 µg/ml para ambos).

Tras la etapa de reestimulación con antígeno, las PBMC se incuban durante la noche a 37 °C en presencia de brefeldina (1 µg/ml)) a 37 °C para inhibir la secreción de citocinas.

La tinción de IFN-γ /IL-2/CD4/CD8 se realizó del siguiente modo: Las suspensiones celulares se lavaron, resuspendieron en 50 µl de PBS con 1 % de FCS que contenga 2 % de reactivo Bloqueantes Fc (1/50; 2.4G2). Tras 10 min de incubación a 4 ºC, se añadieron 50 µl de una mezcla de anti-CD4-PE (2/50) y anti-CD8 perCp (3/50) y se incubaron durante 30 min a 4 ºC. Tras lavar con PBS y 1 % de FCS, las células se permeabilizaron mediante resuspensión en 200 µl de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) y se incubaron 20 min a 4 ºC. A continuación, las células se lavaron con Perm Wash (Kit BD) y se resuspendieron con 50 µl de una mezcla de anti-IFN-γ APC (1/50) + anti-IL-2 FITC (1/50) diluida en Perm Wash. Tras una incubación de como mínimo 2 horas y como máximo durante toda la noche a 4ºC, las células se lavaron con Perm Wash y se resuspendieron en PBS con 1 % de FCS + 1 % de paraformaldehído. El análisis de la muestra se realizó con FACS. Las células vivas se agruparon (FSC/SSC) y la adquisición se realizó en ~ 20.000 sucesos (linfocitos) o 35.000 sucesos en células T CD4+. Los porcentajes de IFN- γ + o IL2+ se calcularon en poblaciones agrupadas de CD4+ and CD8+.

I.1.3. ELISA anti-H5N1 La cuantificación de títulos de anticuerpos Ig, IgG1 e IgG2b contra H5N1 se realizo mediante ELISA usando H5N1 fraccionado como recubrimiento. Las soluciones de virus y de anticuerpo se usaron a 100 µl por pocillo. El virus fraccionado H5N1 se diluyó a una concentración final de 1 µg/ml en PBS y se adsorbió durante la noche a 4 °C en los pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb Immunoplate Nunc 439454). Después, las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C con 200 µl por pocillo de PBS que contenía 1 % de BSA y 0,1 % de Tween 20 (tampón de saturación). Se añadieron veinte diluciones dobles de sueros en tampón de saturación a las placas recubiertas con H5N1 y se incubaron durante 1 h 30 a 37 ºC. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS con 0,1 % de Tween 20. El anticuerpo dirigido contra Ig de ratón conjugada biotinilada (Prozan-E0413) diluido a 1N500 o el anticuerpo dirigido contra IgG1 de ratón conjugado biotinilado (Imtech 1070-08) o un anticuerpo dirigido contra IgG2b de ratón biotinilado (Imtech 1090-08) diluido a 1/4000 en PBS con 1 % de BSA, 0,1 % de Tween 20 se añadió a cada pocillo y se incubó durante 1,30 horas a 37 ºC; después de una etapa de lavado, las placas se incubaron 30 minutos con un conjugado de estreptavidina-biotina-peroxidasa (Prozan P0397) diluido a 1/10.000 en PBS con 1 % de BSA-Tween 20.

Para la revelación colorimétrica, las placas se incubaron 20 minutos a 22 ºC con una solución de o-fenildiamina (Sigma P4664) al 0,04 %, H2O2 al 0, 03 % en tampón citrato 0,1 M a pH 4, 2. La reacción se detuvo con H2SO4 2N y las microplacas se leyeron a 490-630 nm.

I.2. Procedimientos en hurones

I.2.1. Prueba de inhibición de la hemaglutinación (IH)

Procedimiento del ensayo.

Los títulos de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe se determinaron usando la prueba de la inhibición de la hemaglutinación (IH). El principio de la prueba de la IH se basa en la capacidad de los anticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de eritrocitos (RBC) de pollo por la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. Los sueros se trataron primero con una solución al 25 % de neuraminidasa (RDE) y se inactivaron con calor para eliminar los inhibidores inespecíficos. Tras el pretratamiento, diluciones de dos en dos de suero se incubaron con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación se añadieron los eritrocitos de pollo y se puntuó la inhibición de la aglutinación. Los títulos se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo la hemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectable se puntuó como un título igual a 5.

Análisis estadístico.

Los análisis estadísticos se realizaron con títulos de IH (día 41 antes de la provocación) usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:  Transformación log de los datos.

 Prueba de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupos  Prueba de Cochran para verificar la homogeneicidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos)  Prueba para la interacción de ANOVA unilateral.

 Prueba de Tukey HSD para comparaciones múltiples I.2.2.Monitorización de la temperatura corporal Las temperaturas individuales se monitorizaron durante el periodo de exposición a los transmisores y mediante el registro de telemetría. Todos los implantes se comprobaron y se restauraron y se realizó una nueva calibración por DSI (Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, Países Bajos) antes de la colocación en la cavidad intraperitoneal. Todos los animales se alojaron individualmente en jaulas individuales durante estas mediciones. Las temperaturas se registraron cada 15 minutos 4 días antes de la exposición hasta 7 días después de la exposición.

I.2.3. Lavados nasales Los lavados nasales se realizaron mediante la administración de 5 ml de PBS en ambas fosas nasales en animales despiertos. El inóculo se recogió en una placa petri y se introdujo en contenedores de muestras en hielo seco.

Titulación viral en los lavados nasales

Todas las muestras nasales primero se filtraron en esterilidad a través de filtros Spin X (Costar) para eliminar toda contaminación bacteriana. 50 µl de diluciones seriadas de diez en diez de lavados nasales se transfirieron a placas de microtitulación que contengan 50 µl de medio (10 pocillos/dilución). A continuación se añadieron 100 µl de células MDCK (2,4 x 105 células/ml) a cada pocillo y se incubaron a 35 ºC durante 5-7 días.

Tras 57 días de incubación, el medio de cultivo se elimina suavemente y se añaden 100 µl de un medio con /20 WST-1 y se incuban durante otras 18 horas.

La intensidad del pigmento amarillo formazán producido tras la reducción de WST-1 mediante células viables es proporcional al número de células viables presente en el pocillo al final del ensayo de titulación vírica y se cuantifica midiendo la absorbancia de cada pocillo a la longitud de onda adecuada (450 nanómetros). El valor de corte se define como la DO media de las células control no infectadas, -0,3 DO (0,3 DO corresponde a una desviación estándar de +/- 3 de la DO de las células control no infectadas). Una puntuación positiva se define cuando la DO es < del valor de corte y, en contraste, una puntuación negativa se define cuando la DO es > del valor de corte. Los títulos de eliminación del virus se determinaron mediante “Reed and Muench” y se expresaron en forma de DICT50/ml.

1.3. Procedimientos en cerdos

I.3.1. Prueba de inhibición de la hemaglutinación (IH)

Procedimiento del ensayo

Los títulos de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe se determinaron usando la prueba de la inhibición de la hemaglutinación (IH). El principio de la prueba de la IH se basa en la capacidad de los anticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de eritrocitos (RBC) de pollo por la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. Los sueros se trataron primero con una solución al 25 % de neuraminidasa (RDE) y se inactivaron con calor para eliminar los inhibidores inespecíficos. Tras el pretratamiento, diluciones de dos en dos de suero se incubaron con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación se añadieron los eritrocitos de pollo y se puntuó la inhibición de la aglutinación. Los títulos se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo la hemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectable se puntuó como un título igual a 5.

Análisis estadístico.

Los análisis estadísticos se realizaron con títulos de IH (día 41 antes de la provocación) usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:  Transformación log de los datos.

 Prueba de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupos  Prueba de Cochran para verificar la homogeneicidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos)  Prueba para la interacción de ANOVA unilateral.

 Prueba de Tukey HSD para comparaciones múltiples

1.4. Análisis para evaluar la respuesta inmunitaria en seres humanos

I.4.1. Análisis de inhibición de la hemaglutinación La respuesta inmunitaria se determinó midiendo los anticuerpos de IH usando el procedimiento descrito por el Centro colaborador de la OMS para la gripe, Centros de Control de Enfermedades (Collaborating Centre for influenza, Centres for Disease Control), Atlanta, EE.UU. (1991).

Las mediciones del título de anticuerpos se realizaron en muestras de suero congeladas descongeladas con un microprocedimiento normalizado y validado exhaustivamente usando 4 unidades inhibidoras de la hemaglutinación (4 UIH) de los antígenos adecuados y una suspensión al 0,5 % de eritrocitos de ave de corral. Los inhibidores séricos no específicos se eliminaron mediante tratamiento con calor y enzima destructora del receptor.

Los sueros obtenidos se evaluaron para determinar los niveles de anticuerpos de IH. Comenzando con una dilución inicial de 1:10, se preparó una serie de diluciones (por un factor de 2) hasta una dilución final de 1:20480.

Como criterio de valoración de la titulación se tomó la dilución más elevada que mostró una inhibición completa (100 %) de la hemaglutinación. Todos los análisis se realizaron por duplicado.

I.4.2. Ensayo de inhibición de la neuraminidasa El análisis se realizó en placas de microtitulación recubiertas con fetuina. Se preparó una serie de dilución por 2 del antisuero y se mezcló con una cantidad normalizada de H3N2, H1N1 del virus de la gripe A o el virus de la gripe B. La prueba se basó en la actividad biológica de la neuraminidasa que enzimáticamente libera ácido neuramínico a partir de la fetuina. Tras la escisión del ácido neuramínico terminal se descubrió ß-D-galactosa-N-acetil- galactosamina. A los pocillos se añadió aglutinina de cacahuete de Arachis hypogaea marcado con peroxidasa de rábano (HRP), que se une de forma específica a las estructuras de galactosa. La cantidad de aglutinina unida se puede detectar y cuantificar en una reacción de sustrato con tetra-metilbencidina (TMB), Como título de IN se indicó la dilución de anticuerpos más elevada que todavía inhibía la actividad de neuraminidasa viral en al menos un 50 %.

I.4.3. Ensayo de anticuerpos neutralizantes Las mediciones de los anticuerpos neutralizantes se llevaron a cabo en muestras de suero congeladas descongeladas. La neutralización de virus por los anticuerpos contenidos en el suero se determinó en un análisis de microneutralización. Los sueros se usaron sin posterior tratamiento en el análisis.

Cada suero se analizó por triplicado. Una cantidad normalizada de virus se mezcló con diluciones seriadas de suero y se incubó para permitir la unión de los anticuerpos al virus. A continuación a la mezcla de virus y antisuero se añadió una suspensión celular que contenía una cantidad definida de células MDCK y se incubó a 33 ºC. Tras el periodo de incubación, la replicación se visualizó mediante hemaglutinación de eritrocitos de pollo. El título de neutralización del 50 % de un suero se calculó mediante el procedimiento de Reed and Muench.

I.4.4. La inmunidad mediada por células se evaluó mediante citometría de flujo de citocinas (CFC) Las células T DC4 y CD8 de sangre periférica específicas del antígeno se pueden reestimular in vitro para producir IL-2, CD40L, TNF-alfa e IFN si se incuban con su correspondiente antígeno.

En consecuencia, las células T CD4 y CD8 específicas del antígeno se pueden enumerar por citometría de flujo tras marcaje con inmunofluorescencia convencional del fenotipo celular, así como producción de citocinas intracelulares. En el presente estudio, como antígeno para reestimular las células T específicas de la gripe se usaron el antígeno de la vacuna de la gripe así como péptidos derivados de proteínas específicas de la gripe. Los resultados se expresaron en forma de una frecuencia de células T CD4 o CD8 positivas para citocina(s) dentro de la subpoblación de células T CD4 o CD8.

I.4.5. Procedimientos estadísticos

I.4.5.1. Criterios de valoración principal

 Porcentaje, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales solicitados durante un período de 7 días de seguimiento (es decir, días de la vacunación y 6 días posteriores) después de la vacunación y en general.

 Porcentaje, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales no solicitados durante un período de 21 días de seguimiento (es decir, días de la vacunación y 20 días posteriores) después de la vacunación y en general.

 Aparición de acontecimientos adversos graves durante todo el estudio.

I.4.5.2. Criterios de valoración secundarios

Para la respuesta inmunitaria humoral:

Variables observadas:

 Los días 0 y 21: inhibición de la hemaglutinación sérica (HI) y títulos de anticuerpos de NI, analizados por separado contra cada una de las tres cepas del virus de la gripe presentes en la vacuna (anticuerpos anti-H1N1, anti-H3N2 y anti-B).

 Los días 0 y 21: títulos de anticuerpos neutralizantes, analizados por separado frente a cada una de las tres cepas de virus de la gripe presentes en la vacuna

Variables derivadas (intervalo de confianza del 95 %):

 La media geométrica de los títulos (GMT) de anticuerpos HI en suero, con intervalos de confianza del 95 % (IC 95 %) antes y después de la vacunación  Tasas de seroconversión * con IC del 95 % el día 21  Factores de conversión ** con IC del 95 % el día 21  Tasas de seroprotección *** con IC del 95 % el día 21  GMT de anticuerpos NI en suero (con intervalos de confianza del 95 %) en todos los puntos de tiempo.

* El índice de seroconversión se define como el porcentaje de vacunados que experimentan un incremento de al menos 4 veces los títulos de inhibición de HI en suero el día 21 en comparación con el día 0 para cada cepa vacunal.

** El factor de conversión se define como el incremento de los títulos medios geométricos de HI en suero el día 21 en comparación con el día 0 para cada cepa vacunal.

*** El índice de protección se define como el porcentaje de vacunados con un título de IH en suero= 40 después de la vacunación (para cada cepa vacunal) que normalmente se acepta como indicativo de protección.

Debe entenderse que, para algunos de los ensayos clínicos, la reactogenicidad/seguridad pueden ser criterios de valoración secundarios, y la inmunogenicidad puede ser el criterio de valoración principal.

Para la respuesta inmunitaria celular (IMC)

Variable observada

Los días 0 y 21: frecuencia de células CD4/CD8 positivas para citocinas por 106 en diferentes pruebas. Cada prueba cuantifica la respuesta de los linfocitos T CD4/CD8 a:  Antígeno peptídico de la gripe (pf) (la naturaleza exacta y el origen de estos antígenos tiene que darse / explicarse)  Antígenos fraccionados (sf) de la gripe  Antígenos enteros (sf) de la gripe

Variables derivadas:

 células que producen al menos dos citocinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNγ, TNFα)  células que producen al menos CD40L y otra citocina (IL-2, TNFIFN)  células que producen al menos CD40L y otra citocina (IL-2, TNFIFN)  células que producen al menos IFNγ y otra citocina (IL-2, TNFα, CD40L)  células que producen al menos TNF-α y otra citocina (IL-2, CD40L, IFNγ)

I.3.5.3. Análisis de inmunogenicidad

El análisis de inmunogenicidad se basó en la cohorte vacunada total. Para cada grupo de tratamiento, se calcularon los siguientes parámetros (con intervalos de confianza del 95 %):  Títulos geométricos medios (GMT) de los títulos de anticuerpos HI y NI los días 0 y 21  Títulos geométricos medios (GMT) de los títulos anticuerpos neutralizantes los días 0 y 21  Factores de conversión el día 21.

 Tasas de seroconversión (SC) el día 21 definidos como el porcentaje de vacunados que experimentan un incremento de al menos 4 veces los títulos de inhibición de HI en suero el día 21 en comparación con el día 0.

 Índices de protección el día 21 definidos como el porcentaje de los vacunados con un título de HI e suero = 1:40.

 La frecuencia de linfocitos T CD4/CD8 que secretan en respuesta, se resumió (estadísticas descriptivas) para cada grupo de vacunación, en cada punto de tiempo (Día 0, Día 21) y para cada antígeno (péptido de la gripe (pf), virus fraccionados de la gripe (sf) y virus enteros de la gripe (wf)).

 Estadísticas descriptivas en diferencia individual entre respuestas en puntos de tiempo (Después-Antes) para cada grupo de vacunación y cada antígeno (pf, sfí y wf) en cada una de las 5 pruebas diferentes.

 Un ensayo no paramétrico (prueba Kruskall-Wallis) se usó para comparar las diferencias de ubicación entre los 3 grupos y se calculó el valor p estadístico para cada antígeno en cada una de las 5 pruebas diferentes. Todas las pruebas de significación fueron de dos colas. Los valores p menores o iguales a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Ejemplo II Preparación de las formulaciones de emulsión de aceite en agua y adyuvante

A menos que se manifieste lo contrario, la emulsión de aceite/agua utilizada en los ejemplos posteriores está compuesta por una fase orgánica formada por 2 aceites (alfa-tocoferol y escualeno) y una fase acuosa de PBS que contiene Tween 80 como agente emulsionante. A menos que se manifieste lo contrario, las formulaciones de adyuvante de emulsión de aceite en agua utilizadas en los ejemplos posteriores se elaboraron comprendiendo el siguiente componente de emulsión de aceite en agua (concentraciones finales proporcionadas): escualeno 2,5 % (v/v), alfa-tocoferol 2,5 % (v/v), monooleato de polioxietilensorbitán al 0,9 % (v/v) (Tween 80), véase el documento WO 95/17210. Esta emulsión, denominada AS03 en los ejemplos posteriores, se preparó del siguiente modo como un concentrado al doble.

11.1. Preparación de la emulsión SB62

Este procedimiento se uso en los estudios notificados en las secciones de ejemplos clínicos y preclínicos. La preparación de la emulsión de SB62 se realiza mediante la mezcla con agitación fuerte de una fase oleosa compuesta por componentes hidrófobos (DL–α-tocoferol y escualeno) y una fase acuosa que contiene los componentes solubles en agua (el detergente aniónico Tween 80 y PBS mod (modificado), a pH 6,8). Mientras se agita, la fase de aceite (1/10 volumen total) se transfiere a la fase acuosa (9/10 volumen total), y la mezcla se agita durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla resultante se somete después a fuerzas de cizallamiento, impacto y cavitación en la cámara de interacción de un microfluidizador (15.000 PSI - 8 ciclos o 3 ciclos en el adyuvante usado en el ensayo clínico notificado en el Ejemplo III) para producir gotitas submicrónicas (distribución entre 100 y 200 nm). El pH resultante es entre 6,8 ± 0,1. La emulsión SB62 se esteriliza después mediante filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros y el grueso de la emulsión estéril se almacena refrigerada en contenedores a 2 a 8 °C. Se pasa gas inerte estéril (nitrógeno o argón) por el volumen muerto del recipiente con el grueso final de la emulsión SB62 durante al menos 15 segundos.

La composición final de la emulsión SB62 es la siguiente: Tween 80: 1,8 % (v/v) 19,4 mg/ml; escualeno: 5 % (v/v) 42,8 mg/ml; α-tocoferol: 5 % (v/v) 47,5 mg/ml; PBS-mod: NaCl 121 mM, KCI 2,38 mM, Na2HPO 47,14 mM, KH2PO 41,3 mM; pH 6,8 ± 0,1.

Ejemplo III Ensayo clínico en una población adulta de 18 - 59 años de edad con una vacuna que contiene una preparación del antígeno contra la gripe fraccionada y varias dosis de adyuvante AS03 (Flu–LD–004).

111.1. Introducción

Se realizó un estudio de fase II, controlado, aleatorizado y de diego único en una población adulta de 18-59 anos de edad en 2006 con el fin de evaluar la inmunogenicidad, seguridad y reactogenicidad de la vacuna candidata contra la gripe de dosis baja de GlaxoSmithKline Biologicals (es decir, que contiene 5 µg de HA por cepa) con dos dosis de adyuvante AS03.

La respuesta inmunitaria humoral (es decir, anti-hemaglutinina) se midió 21 días después de la administración intramuscular de una dosis de una vacuna adyuvantada con AS03. Fluarix™ se usó como referencia.

111.2. Diseño del estudio

Tres grupos de sujetos recibieron en paralelo la siguiente vacuna intramuscularmente:  un grupo de 100 sujetos que reciben una inyección de la vacuna contra la gripe de virus fraccionada de dosis baja que contiene 5 µg de HA adyuvantada con AS03 (FluLD1/1)  un grupo de 100 sujetos que reciben una inyección de la vacuna contra la gripe de virus fraccionada de dosis baja que contiene 5 µg de HA adyuvantada con media dosis de AS03 (AD03 ½) (FluLD1/2)  un grupo de 100 sujetos que reciben una dosis de Fluarix™ (Fluarix) Calendario: una inyección i.m. de vacuna contra la gripe el día 0, visitas al sitio de estudio el día 0 y el día 21 con una extracción de muestra de sangre (determinación de anticuerpos de IH) y un contacto telefónico adicional el día 30 (conclusión del estudio).

La vacuna contra la gripe fraccionada trivalente convencional Fluarix™ usada en este estudio es una vacuna comercial desde el año 2006 desarrollada y fabricada por GlaxoSmithKline Biologicals.

111.3. Objetivos del estudio

III.3.1. Objetivo primario - Evaluar la respuesta inmunitaria humoral inducida por las vacunas del estudio, en términos de títulos de anticuerpos anti-hemaglutinina.

Variables observadas los días 0 y 21: títulos de anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación en suero. Variables derivadas (intervalo de confianza del 95 %):

- Títulos geométricos medios (GMT) de anticuerpos en suero los días 0 y 21 - Tasas de seroconversión* el día 21 - Factores de conversión** el día 21 - Índices de protección*** los días 0 y 21 *El índice de seroconversión para respuesta de anticuerpos de hemaglutinina se define como el porcentaje de las vacunas que tienen un título de prevacunación < 1:10 y un título de posvacunación ≥ 1:40 o un título de pre- vacunación ≥ 1:10 y al menos un incremento de cuatro veces en título de posvacunación ** El factor de conversión se define como el incremento de los títulos medios geométricos de HI en suero posvacunación en comparación con el día 0; *** El índice de protección se define como el porcentaje de vacunados con un título de HI en suero ≥ 40 después de la vacunación que normalmente se acepta como indicativo de protección.

III.3.2. Objetivo secundario - Evaluar la reactogenicidad y la seguridad de las vacunas en estudio, en términos de acontecimientos adversos locales y generales inducidos, acontecimientos adversos no inducidos y acontecimientos adversos graves: 1. Aparición, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales esperados durante un período de 7 días de seguimiento (es decir, días de la vacunación y 6 días posteriores) después de cada vacunación en cada grupo.

2. Aparición, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales inesperados durante un período de 30 días de seguimiento (es decir, días de la vacunación y 29 días posteriores) después de cada vacunación en cada grupo.

3. Aparición y relación de acontecimientos adversos graves durante todo el periodo de estudio en cada grupo.

III.4. Composición y administración de vacunas

III.4.1. Preparación de la vacuna La vacuna contra la gripe no adyuvantada es una vacuna contra la gripe inactivada de virión fraccionado trivalente que consiste en tres vacunas de antígeno vírico monovalente (preparadas respectivamente a partir de las cepas de la gripe A/H1N1, A/H3N2 y B). Los antígenos presentes en esta vacuna son los mismos que en la vacuna Fluarix™

autorizada que esta disponible en el mercado como Fluarix™ (α–Rix®) desde 1992 y contiene 15 µg de HA/cepa por dosis. Las cepas de la gripe incluidas en los lotes clínicos de FluLD son las cepas que se eligieron para el hemisferio norte en 2006/2007:  Cepa similar a A/New Caledonia/20/99 (H1N1): A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR–116  Cepa similar a A/Wisconsin/67/2005 (H3N2): A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) NYMCX–161  B/Malaysia/2506/2004.

Los antígenos derivan de virus cultivados en huevos. El fraccionamiento se lleva a cabo con desoxicolato de sodio antes de la etapa de inactivación, que se realiza mediante la posterior acción de desoxicolato de sodio y formaldehído.

La vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 (FluLD) (lotes clínicos) se basa en la vacuna Fluarix™ comercialmente disponible (preparada respectivamente a partir de las cepas de la gripe A/H1N1, A/H3N2 y B), pero con un menor contenido de antígeno y adyuvantada con el sistema de adyuvante de GSK AS03. AS03 consiste en una emulsión de aceite en agua (SB62) que contiene dos aceites biodegradables, escualeno y α- tocoferol (vitamina E) y un tensioactivo, polisorbato 80 (Tween 80). Los antígenos de la gripe se incorporan en la fase acuosa del sistema de adyuvante mediante simple mezcla con la emulsión. Se han analizado dos formulaciones, que se diferencian por la cantidad de adyuvante introducida con los antígenos de la gripe en el lote de vacuna. Las vacunas adyuvantadas contienen 5 µg de hemaglutinina (HA) de cada cepa del virus de la gripe por dosis, combinada con una dosis completa (AS03) o media dosis (AS03 ½) del sistema de adyuvante AS03. Los excipientes son los siguientes: polisorbato 80 (Tween 80), octoxinol 10 (Triton X-100), hidrógenosuccinato de alfatocoferilo, cloruro sódico, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de potasio, agua para inyección. Las vacunas contra la gripe de dosis baja adyuvantadas con AS03 (FluLD, dosis completa o media dosis de AS03) son vacunas libres de conservante. Sin embargo, contienen cantidades restos de tiomersal (< 1,25 µg de Hg por dosis) de las fases tempranas del procedimiento de fabricación. Ambas se presentan como vacunas de monodosis en jeringuillas precargadas de vidrio (tipo I) a un volumen de 0,5 ml/dosis.

III.4.1.1. Composición de la vacuna antigripal adyuvantada con AS03

Una dosis de FluLD (dosis completa o media dosis de AS03) se corresponde con 0,5 ml. La composición se 55 proporciona en la Tabla 3. El contenido de HA por dosis es 5 µg para ambas formulaciones, siendo la única diferencia la cantidad de AS03 presente en los recipientes finales.

Tabla 3. Composición de la vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 (dosis completa y

media dosis de AS03)

Componente

Cantidad por dosis (0,5 ml)

Viriones fraccionados inactivados – A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR–116 5 µg de HA – A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) NYMCX–161 5 µg de HA – B/Malaysia/2506/2004 5 µg de HA Adyuvante (dosis completa / media dosis) – Emulsión SB62 (volumen total) 0,250 ml • escualeno 10,70 mg / 5,35 mg.

• DL-α-Tocoferol 11,88 mg / 5,94 mg.

• Polisorbato 80 (Tween 80) 4,85 mg / 2.425 mg.

Polisorbato 80 (Tween 80) 0,122 mg Octoxinol 10 (Triton X-100) 0,0283 mg Hidrógenosuccinato de α-tocoferilo 0,01665 mg Cloruro sódico 4 mg Fosfato disódico 0,575 mg Dihidrógenofosfato potásico 0,100 mg Cloruro potásico 0,101 mg Agua para inyectables añadir 0,50 ml Abreviaturas: HA = Hemaglutinina. El contenido total en Polisorbato 80 se corresponde con 4,972 mg por dosis cuando se usa la dosis completa de AS03, y 2,547 mg por dosis cuando se usa media dosis de AS03.

III.4.1.2. Producción de preparación antigénica de la gripe con virus inactivados fraccionados

Los antígenos de la gripe son idénticos a los incluidos en Fluarix™ (vacuna contra el virus de la gripe). Las vacunas monovalentes consisten en virus fraccionados inactivados purificados que se preparan a partir de semillas de trabajo de las tres cepas del virus de la gripe, tipo A (H1N1 y H3N2) y tipo B, que se cultivan individualmente en huevos de gallina embrionados. Estas semillas de trabajo derivan de cepas que se recibieron de un centro colaborador con la OMS siguiendo las recomendaciones anuales de la OMS. Para el procedimiento para preparar los antígenos se hace referencia, a modo de ilustración, al documento WO 02N097072. Los volúmenes de las tres vacunas monovalentes se basan en el contenido de HA medido en cada vacuna monovalente antes de la formulación y en el volumen de fabricación diana. Una solución salina tamponada con fosfato concentrada 10 veces (pH 7,4 cuando se concentra 1 vez) y una premezcla de Tween 80 e hidrógenosuccinato de α-tocoferilo se diluyen en agua para inyectables, seguido de agitación durante 5-30 minutos a temperatura ambiente.

Después, las tres vacunas monovalentes concentradas se diluyen sucesivamente en la solución resultante de solución salina tamponada con fosfato / Tween 80 - hidrógenosuccinato de α-tocoferilo hasta una concentración de 20 µg de HA de cada vacuna monovalente de A (H1N1, H3N2) 23,32 µg de HA de la vacuna monovalente de B por ml de vacuna trivalente intermedia (5 µg de HA de cada vacuna monovalente de A y 5,83 µg de HA de B / 500 µl de la vacuna final trivalente). Entre las adiciones de cada vacuna monovalente, la mezcla se agita durante 10 -30 minutos a temperatura ambiente y durante 15 - 30 minutos después de la adición de la última vacuna monovalente. Esta vacuna trivalente intermedia también denominada en lo sucesivo "pre-mezcla" puede mantenerse a +2 -+8 ºC o adicionalmente procesarse a la etapa de formulación final el mismo día. El volumen final de la pre-mezcla es 250 µl por dosis.

III.4.1.3. Preparación de las composiciones de vacuna con adyuvante AS03

Vacuna adyuvantada: LD AS03 1/1 (Tabla 4) PBS mod concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando se concentra una vez; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4, 8,1 mM, KH2PO4, 1,47 mM, pH 7, 4) , además de una mezcla que contiene Tween 80, Triton X-100 y VES (cantidades teniendo en cuenta el detergente presente en las cepas), se añaden a agua para inyectables. Después de 5 a 30 minutos de agitación, 20 µg de HA por ml de cada cepa H1N1 y H3N2 y 23,32 µg de HA por ml de cepa B se añaden con 10 a 30 minutos de agitación entre cada adición. Después de 15 a 30 minutos de agitación, un pequeño volumen de la llamada "vacuna intermedia" se desecha para análisis y se guarda entre +2 y +8 °C. La vacuna intermedia esta en PBS mod concentrado 1 vez. La concentración de detergente diana son 488 µg de Tween 80 por ml, 73,6 µg de Triton X-100 por ml y 66, 6 µg de VES por ml. A continuación se prepara la formulación final: volumen igual de SB62 (véase la preparación en el Ejemplo II) se añade a cada 250 µl de la vacuna intermedia de pre-mezcla y se mezcla durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente. El pH se comprueba para que oscile entre 6,8 y 7,5. La formulación se lava con nitrógeno y después se almacena entre +2 y 8 °C antes de la carga.

Tabla 4 Vacuna de dosis baja adyuvantada con AS03

Componente

Concentración

Volumen (ml)

Etapa 1: Premezcla

Vacuna monovalente de A/Nueva 104 µg/ml 302,88 Caledonia Vacuna monovalente de B/Wisconsin 85 µg/ml 370,59 Vacuna monovalente de B/Malasia 110 µg/ml 333,90 PBS mod (1) Véase la leyenda 56,76 Tween 80 48.000 µg/ml 5,24 Triton X-100 Residuo de la cepa H3N2 Hidrógenosuccinato de α-tocoferilo 26.480 µg/ml 1,2 Agua filtrada 504,43 Volumen total = 1.575 (ml)

75 ml de las muestras de pre-mezcla se recuperan para las pruebas

Volumen de premezcla restante = 1500 (ml)

Etapa 2: añadido a la pre-mezcla

Emulsión SB62 1500

Volumen total de la vacuna final = 3.000 (ml)

(1): La composición a granel final del tampón es: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM , Na2HPO4 8,1 mM , KH2PO4 1,47 mM , pH 7,4 Vacuna adyuvantada: LD AS03 1/2 (Tabla 5) PBS mod concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando se concentra una vez - véase la composición anterior) , además de una mezcla que contiene Tween 80, Triton X-100 y VES (cantidades teniendo en cuenta el detergente presente en las cepas) se añaden a agua para inyectables. Después de 5 a 30 minutos de agitación, 20 µg de HA por ml de cada cepa H1N1 y H3N2 y 23,32 µg de HA por ml de cepa B se añaden con 10 a 30 minutos de agitación entre cada adición. Después de 15 a 30 minutos de agitación, un pequeño volumen de la llamada "vacuna intermedia" se desecha para análisis y se guarda entre +2 y +8 °C. El PBS mod se concentra 1 vez en la vacuna intermedia. La concentración de detergente diana son 488 µg de Tween 80 por ml, 73,6 µg de Triton X-100 por ml y 66, 6 µg de VES por ml.

A continuación se prepara la formulación final: SB62 se diluye primero con el tampón PBS mod y se agita durante 15 - 30 minutos a TA. Después se añade un volumen igual de esta SB62 diluido a cada 250 µl de pre-mezcla de la vacuna intermedia. Después de 30 a 60 minutos de agitación a TA, el pH se comprueba para que oscile entre 6,8 y 7,5. La formulación se lava con nitrógeno y después se almacena entre +2 y 8 °C antes de cargar.

El volumen final de ambas formulaciones es 500 µl por dosis y la concentración final de HA es de 10 µg de cada vacuna monovalente de A y 11,66 µg de la vacuna monovalente de B por ml de vacuna final trivalente. Las concentraciones diana finales de Tween 80, Triton X-100 (residuo de la fabricación de la vacuna monovalente H3N2) e hidrógenosuccinato de α-tocoferilo (el hidrógenosuccinato de α-tocoferilo es una forma de éster de RRR (isómero D)-α-tocoferol) son 244 µg/ml, 58,6 µg/ml y 33,3 µg/ml, respectivamente.

Tabla 5 Vacuna de dosis baja adyuvantada con AS03 (media dosis de adyuvante)

Componente

Concentración

Volumen (ml)

Etapa 1: Premezcla

Etapa 1: Premezcla

Vacuna monovalente de A/Nueva 104 µg/ml 300,96 Caledonia Vacuna monovalente de B/Wisconsin 85 µg/ml 368,24 Vacuna monovalente de B/Malasia 110 µg/ml 331,78 PBS mod (1) Véase la leyenda 56,4 Tween 80 48000 µg/ml 5,2 Triton X-100 Residuo de la cepa H3N2 Hidrógenosuccinato de α-tocoferilo 26.480 µg/ml 1,2 Agua filtrada 501,22 Volumen total = 1565 (ml) 85 ml de las muestras de pre-mezcla se recuperan para las pruebas Volumen de premezcla restante = 1500 (ml)

Etapa 2: añadido a la pre-mezcla

Emulsión SB62 750 PBS mod (1) Véase la leyenda 75 Agua filtrada 675

Volumen total de la vacuna final = 3.000 (ml)

(1): La composición a granel final del tampón es: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM , Na2HPO4 8,1 mM , KH2PO4 1,47 mM , pH 7,4 III.4.2. Administración de la acuna La vacuna se carga asépticamente en jeringas de vidrio de tipo I estériles de 1,25 ml (farmacopea europea). Cada jeringuilla se carga hasta un objetivo de 0,57 ml (intervalo: 0,54 – 0,60 ml). Las vacunas se administran por vía intramuscular en la región deltoide del brazo no dominante. Todas las vacunas se presentaron como jeringas precargadas (0,5 ml). Con el fin de garantizar la inyección i.m. adecuada de la vacuna se usó una aguja de al menos 25G y al menos 2,5 cm de longitud.

III.5 Resultados de la población del estudio

En este estudio participó un total de 300 grupos: 100 sujetos en cada uno de los 3 grupos. La media de edad de la cohorte vacunada total en el momento de la vacunación fue de 36,7 años con una desviación estándar de 13,67 años. La distribución media de la edad y el sexo de los sujetos en los 3 grupos de vacuna fue similar.

III.6 Resultados de inmunogenicidad

El análisis de inmunogenicidad se realizó en la cohorte de ATP para inmunogenicidad (297 sujetos).

Respuesta inmunitaria humoral Con el objeto de evaluar la respuesta inmunitaria humoral inducida por la vacuna candidata de la gripe de dosis bajas con adyuvante AS03, se calcularon los siguientes parámetros (con intervalos de confianza de 95 %) para cada grupo de tratamiento:  Títulos geométricos medios (GMT) de los títulos anticuerpos de HI los días 0 y 21;  Tasas de seroconversión (s.c.) los días 21 y 42;  Factores de conversión el día 21;  Índices de protección los días 0 y 21.

III.6.1 Títulos geométricos de HI (TMG)

Los TMG para los anticuerpos de HI con IC del 95 % se muestran en la Tabla 10 y la Figura 1. Las relaciones de los TMG ajustadas entre grupos se muestran en la Tabla 11. Los TMG antes de la vacunación de los anticuerpos de HI para las 3 cepas de vacuna estuvieron dentro del mismo intervalo en los 3 grupos de tratamiento. Los TMG observados el día 21 para los grupos adyuvantados tienden a ser mayores que en el grupo de Fluarix para las 3 cepas con una diferencia estadística (sin solapamiento de los IC del 95 % y la relación de los TMG ajustada no contenía el valor 1) entre FluLD1/1 y Fluarix para la cepa de la vacuna A/Wisconsin. Una diferencia estadística (la relación de los TMG ajustado no contenía el valor 1) también se observo entre FluLD1/2 y Fluarix para la cepa de la vacuna B/Malasia.

III.6.2 Factores de conversión de los títulos de anticuerpos anti-HI, índices de seroprotección y tasas de seroconversión (se correlaciona para la protección tal como se establece para la vacuna de la gripe en seres humanos)

Los resultados se presentan en la Tabla 6 - Figura 2 para los Tasas de seroprotección, Tabla 7 - Figura 3 para los Tasas de seroconversión y Tabla 8 -Figura 4 para los factores de conversión. El umbral requerido por las autoridades europeas para los Tasas de seroprotección (70 %) se alcanzó en todos los grupos (al menos el 94,9 %). Para cada cepa de vacuna, los Tasas de seroprotección el día 21 para los 3 grupos estuvieron dentro del mismo intervalo. El umbral requerido por las autoridades europeas para los Tasas de seroconversión (40 %) se alcanzó en todos los grupos (al menos el 65 %). Para cada cepa de vacuna A/New Caledonia, las TSC el día 21 para los 3 grupos estuvieron dentro del mismo intervalo. Para la cepa de la vacuna A/Wisconsin, las TSC el día 21 para el grupo de FIuLD1/1 tendieron a ser mayores en comparación con el grupo de Fluarix. Los TSC el día 21 para el grupo de FluLD1/2 estaban dentro del mismo intervalo en comparación con el grupo de Fluarix. Para la cepa de la vacuna B/Malaysia, las TSC el día 21 para el grupo de FIuLD1/2 tendieron a ser mayores en comparación con el grupo de Fluarix. Los TSC el día 21 para el grupo de FluLD1/1 estaban dentro del mismo intervalo en comparación con el grupo de Fluarix. El umbral requerido por las autoridades europeas para los factores de seroconversión (2,5) se alcanzó en todos los grupos (al menos el 6,2). Para cada cepa de vacuna A/New Caledonia, las TSC el día 21 para los 3 grupos parecían estar dentro del mismo intervalo. El valor observado para el grupo de FluLD1/2 fue inferior al valor observado para el grupo de Fluarix, pero pudo explicarse por el mayor índice de seroprotección antes de la vacunación en el grupo de FluLD1/2. Para la cepa de la vacuna A/Wisconsin, las TSC el día 21 para el grupo de FIuLD1/1 tendieron a ser mayores en comparación con el grupo de Fluarix. Los TSC el día 21 para el grupo de FluLD1/2 estaban dentro del mismo intervalo en comparación con el grupo de Fluarix. Para la cepa de la vacuna B/Malaysia, las TSC el día 21 para los dos grupos con adyuvante tendieron a ser mayores en comparación con el grupo de Fluarix.

TABLA 6 – Tasas de seroprotección (TSP) para el título de anticuerpos HI el día 0 y el día 21 (cohorte de ATP

para inmunogenicidad)

Cepa de vacuna

Grupo

Cronología

N

TSP n

IC del 95 %

%

LI

LS

A/New Caledonia

FluLD1/1 PRE 99 41 41,4 31,6 51,8 PI(D21) 99 95 96,0 90,0 98,9 FluLD1/2 PRE 99 55,6 45,2 65,5 PI(D21) 99 97 98,0 92,9 99,8 Fluarix PRE 98 35,7 26,3 46,0 PI(D21) 98 93 94,9 88,5 98,3

A/Wisconsin

FluLD1/1 PRE 99 32 32,3 23,3 42,5 PI(D21) 99 97 98,0 92,9 99,8 FluLD1/2 PRE 99 37 37,4 27,9 47,7 PI(D21) 99 97 98,0 92,9 99,8 Fluarix PRE 98 25,5 17,2 35,3 PI(D21) 98 93 94,9 * * 8,5

B/Malaysia

FluLD1/1 PRE 99 31 31,3 22,4 41,4 PI(D21) 99 97 98,0 92,9 99,8 FluLD1/2 PRE 99 39 39,4 29,7 49,7 PI(D21) 99 98 99,0 94,5 100 Fluarix PRE 98 44 44,9 34,8 55,3 PI(D21) 98 94 95,9 89,9 98,9 FluLD1/1 = Vacuna contra la gripe de dosis bajas (5 ug de HA/cepa) con dosis completa de adyuvante AS03 FluLD1/2 = Vacuna contra la gripe de dosis bajas (5 ug de HA/cepa) con media dosis de adyuvante AS03 Fluarix = Vacuna Fluarix N= número de sujetos con resultados disponibles n/ % = número/porcentaje de sujetos seroprotegidos (título de HI > =40 1/DIL) IC del 95 %= intervalo de confianza del 95 %, LI= límite inferior, LS= límite superior PRE = Antes de la vacunación el día 0 PI(D1) = Después de la vacunación el día 21 Fuente de datos= Tabla IIA anexa TABLA 7 – Índice de seroconversión (TSC) para título de anticuerpos de HI el día 21 (cohorte de ATP para inmunogenicidad)

TSC

Cepa de vacuna

Grupo

N

IC del 95 %

n

%

LI

LS

FluLD1/1 99 69 69,7 59,6 78,5

A/New Caledonia

FluLD1/2 99 64 64,6 54,4 74,0 Fluarix 98 66 67,3 57,1 76,5 FluLD1/1 99 88 88,9 81,0 94,3

A/Wisconsin

FluLD1/2 99 79 79,8 70,5 87,2 Fluarix 98 73 74,5 64,7 82,8 FluLD1/1 99 76 76,8 67,2 84,7

B/Malaysia

FluLD1/2 99 82 82,8 73,9 89,7 Fluarix 98 66,3 56,1 75,6 FluLD1/1 = Vacuna contra la gripe de dosis bajas (5 ug de HA/cepa) con dosis completa de adyuvante AS03 FluLD1/2 = Vacuna contra la gripe de dosis bajas (5 ug de HA/cepa) con media dosis de adyuvante AS03 Fluarix = Vacuna Fluarix Seroconversión definida como: Para sujetos inicialmente seronegativos, titulo de anticuerpos >= 40 1/DIL después de la vacunación Para sujetos inicialmente seropositivos, titulo de anticuerpos después de la vacunación º= 4 veces el título de anticuerpos antes de la vacunación N = Número de sujetos con resultados disponibles tanto antes como después de la vacunación n/ % = Número/porcentaje de sujetos seroconvertidos IC del 95 %= intervalo de confianza del 95 %, LI= límite inferior, LS= límite superior

TABLA 8 – Factor de seroconversión (FSC) para título de anticuerpos de HI el día 21 (cohorte de ATP para

inmunogenicidad)

Cepa de vacuna

Grupo

N

FSC Valor

IC del 95 % LI

LS

A/New Caledonia FluLD1/1 99 14,9 10,4 21,3 FluLD1/2 99 11,0 7,7 15,9 Fluarix 98 14,6 9,9 21,6 A/Wisconsin FluLD1/1 99 16,5 13,0 20,9 FluLD1/2 99 12,2 9,2 16,1 Fluarix 98 11,7 8,8 * B/Malaysia FluLD1/1 99 13,2 10,0 17,4 FluLD1/2 99 13,6 10,2 18,0 Fluarix 98 8,3 6,2 11,0 FluLD1/1 = Vacuna contra la gripe de dosis bajas (5 ug de HA/cepa) con dosis completa de adyuvante AS03 FluLD1/2 = Vacuna contra la gripe de dosis bajas (5 ug de HA/cepa) con media dosis de adyuvante AS03 Fluarix = Vacuna Fluarix N = Número de sujetos con resultados disponibles tanto antes como después de la vacunación FSC = Factor de seroconversión o relación media geométrica (media[log10(PI(D21)/PRE)]) IC del 95 %= intervalo de confianza del 95 %, LI= límite inferior, LS= límite superior

III.7 Conclusiones de seguridad

Una mayor reactogenicidad en términos de síntomas esperados (locales/generales) e inesperados en los grupos de de vacuna adyuvantada en comparación con el grupo de Fluarix fue la tendencia global observada en este estudio.

Una reducción del contenido de AS03 en la vacuna adyuvantada tiene un impacto significativo sobre todos los síntomas de grado 3 generales y locales. La aparición de síntomas inesperados tendió a ser mayor en los grupos de vacuna adyuvantada (55 % y 47 % de sujetos) en comparación con el grupo de Fluarix (35 %). A partir de estos resultados, se puede concluir que el perfil de reactogeneicidad y de seguridad de las vacunas candidatas es satisfactorio y clínicamente aceptable.

III.8. Conclusiones globales

III.8.1. Resultados de inmunogenicidad El objetivo primario de este estudio fue evaluar la respuesta inmunitaria humoral (títulos de anticuerpos anti-HI) provocada por la vacuna contra la gripe de dosis baja con dos concentraciones diferentes de adyuvante AS03 diferentes, y por Fluarix.

El día 21, las tres vacunas sobrepasaron los requisitos de las autoridades europeas para el registro anual de vacunas contra la gripe de virión fraccionado ("Nota orientativa para la armonización de requisitos para vacunas contra la gripe" para la evaluación inmunológica de los cambios de cepas anuales -CPMPNBWPN214N96). Los TMG tendieron a ser mayores en los grupos adyuvantados en comparación con el grupo de Fluarix, con una diferencia estadísticamente significativa observada para las cepas de vacuna A/Wisconsin (FluLD1/1 frente a Fluarix) y B/Malaysia (FluLD1/2 frente a Fluarix). Se observaron Tasas de seroprotección similares en los tres grupos de vacuna que oscilan del 94,9 % a 99 %. Se observó que los Tasas de seroconversión y los factores de seroconversión eran mayores en los grupos adyuvantados que en el grupo de Fluarix. Los datos de este ensayo también revelaron que la inmunogenicidad inducida por la vacuna con media dosificación de adyuvante AS03 era comparable a la inducida con la dosis completa de adyuvante.

III.8.2. Reactogeneicidad y resultados de seguridad La administración de la vacuna candidata de la gripe de dosis bajas adyuvada con AS03 era segura y clínicamente bien tolerada por la población de estudio, es decir adultos de edades comprendidas entre los 18 y los 59 años. La vacuna adyuvantada de media dosis mostró una marcada disminución en la incidencia de síntomas locales y generales esperados en comparación con la vacuna adyuvantada de dosis completa.

Ejemplo IV -Evaluación preclínica de vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03) en ratones BALBNc sensibilizados.

IV.1. Diseño experimental y objetivo

Los experimentos en ratones sensibilizados a la gripe se realizaron con el fin de evaluar el aumento en las respuestas humorales por AS03 inducidas por vacunas contra la gripe formuladas con este adyuvante de aceite en agua. Para simular la situación humana se realizó un experimento usando animales sensibilizados con cepas heterosubtipicas.

IV.1.1. Tratamiento/grupo (Tabla 9) Grupos de 27 ratones BALBNc hembra adultos se sensibilizaron intranasalmente (20 µl de volumen) el día 0 con virus de la gripe inactivado con formalina completos trivalente (5 µg de HA para cada cepa). Las cepas de sensibilización consistieron en variantes de desviación anteriores (5 µg de HA para H1N1 A/Johannesburg/82/96, H3N2 A/Sydney/5/97, B/Harbin/7/94 inactivadas completas) a las incluidas en la vacuna. Veintiocho días después, los ratones se vacunaron con una dosis única del candidato a vacuna intramuscularmente en un volumen total de 50 µl. Se inmunizó a los ratones con formulaciones que contenían antígenos fraccionados solos (simples fraccionados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos fraccionados adyuvantados con dos dosis de AS03 (completa o 1/5). Las cepas usadas para las inmunizaciones incluyeron antígenos víricos de H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99, B/Shangdong/7/97 (1,5 µg/cepa, 1/10ª de la dosis humana).

Tabla 9

Gr.

Antígeno / formulación Otro tratamiento 1 Fraccionado trivalente N simple (no adyuvantada) Sensibilización heteróloga D0 2 Fraccionado trivalente N AS03 Sensibilización heteróloga D0 3 Fraccionado trivalente / AS03 1/5 Sensibilización heteróloga D0 IV.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna Una premezcla de Tween 80, Triton X100 y succinato de vitamina E (VES) se prepara con el fin de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 µg/ml de Tween 80, 110 µg/ml de Triton X100 y 100 µg/ml de VES. Las cantidades usadas en la premezcla en se calculan teniendo en cuenta las cantidades de detergente y VES ya presentes en las cepas.

Preparación de un litro de tampón de solución salina concentrada 10 veces (PBS a pH 7, 4): a 0, 800 I de agua para inyectables, añadir NaCl 80 g, 2 g de KCI, 11,44 g de Na2HPO4, 2 g de Na2HPO4. Después de la solubilización, ajustar a 1,0 l con agua para inyectables. El pH será de 7, 4 cuando se diluya 10 veces.

Fraccionada trivalente / simple

La formulación de una dosis de 50 µl se prepara extemporáneamente según la secuencia: agua para inyectables + tampón de solución salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7, 4) + premezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1, 5 µg de HA para la cepa H1N1, 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1, 5 µg de HA para la cepa H3N2, 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1,5 µg de HA de la cepa B, 15 minutos agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al final de su preparación.

Fraccionada trivalente / AS03

Una premezcla de Tween 80, Triton X100 y succinato de vitamina E (VES) se prepara con el fin de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 µg/ml de Tween 80, 110 µg/ml de Triton X100 y 100 µg/ml de VES. Las cantidades usadas en la premezcla en se calculan teniendo en cuenta las cantidades de detergente y VES ya presentes en las cepas.

La formulación de una dosis de 50 µl se prepara extemporáneamente según la secuencia: agua para inyectables + tampón de solución salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7, 4) + premezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1, 5 µg de HA para la cepa H1N1, 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1, 5 µg de HA para la cepa H3N2, 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1,5 µg de HA de la cepa B, 15 minutos agitación magnética a temperatura ambiente + 25 µl de la emulsión SB62 para la dosis completa de AS03 o 5 µl de la emulsión SB62 para la dosis de 1/5 de AS03, 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al final de su preparación.

IV.1.3 Lecturas (Tabla 10) La respuesta inmunitaria humoral a la vacunación se midió antes de la inmunización (día 28) y 14 días después de la inmunización (27 ratones/grupo). Las muestras de suero se analizaron mediante la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI).

Tabla 10

Lectura Punto de tiempo Tipo de muestra Procedimiento de análisis Respuesta humoral D28, D42 Sueros IHA

IV.2. Resultados

IV.2.1. Inmunidad humoral Los resultados se presentan en la Figura 5. En este modelo de ratón de sensibilización heterosubtípica seguida de una única vacunación se mostró que AS03 y diluciones del mismo inducían mayores títulos de HI en comparación con la vacuna simple. Para todas las cepas de la gripe A se observó un aumento estadísticamente significativo de títulos de HI (p < 0,05). Para la cepa H1N1 también se observó una diferencia significativa en los títulos de HI entre AS03 y AS03 1N5 (p < 0,05). Una dosis reducida de AS03 no aumentó los títulos de HI para las tres cepas en comparación con la vacuna simple. Se observaron respuestas muy bajas contra la cepa B (B/Shandong); esto es probablemente debido a la significativa desviación antigénica entre la cepa B usada para la sensibilización y la vacuna.

IV.3. Resumen de resultados y conclusiones

En conclusión, se observó un aumento en títulos de HI en animales sensibilizados con cepas heterosubtípicas cuando se usaron vacunas adyuvantadas con AS03 en comparación con la vacuna simple. Una dosis completa de AS03 fue óptima para obtener títulos de HI sólidos contra las tres cepas de la vacuna contra la gripe.

Ejemplo V -Evaluación preclínica de vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03) en ratones C57BI/6 sensibilizados.

V.1. Diseño experimental y objetivo

Los experimentos en ratones sensibilizados a la gripe se realizaron con el fin de evaluar el aumento en las respuestas humorales y celulares por AS03 inducidas por vacunas contra la gripe formuladas con este adyuvante de aceite en agua. Para simular la situación humana se realizó un experimento usando animales sensibilizados con cepas heterosubtipicas.

V.1.1. Tratamiento/grupo (Tabla 11) Grupos de 25 ratones C57BI/6 hembra adultos se sensibilizaron intranasalmente (20 µl de volumen) el día 0 con virus de la gripe inactivado con formalina completos trivalente (5 µg de HA para cada cepa). Las cepas de sensibilización consistieron en variantes de desviación anteriores (5 µg de HA para H1N1 A/Beijing/262/95, H3N2 A/ Panama/2007/99, B/ Shangdong/7/97 inactivadas completas) a las incluidas en la vacuna. Veintiocho días después, los ratones se vacunaron con una dosis única del candidato a vacuna intramuscularmente en un volumen total de 100 µl. Se inmunizó a los ratones con formulaciones que contenían antígenos fraccionados solos (simples fraccionados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos fraccionados adyuvantados con tres dosis de AS03 (completa 1/2 o 1/5). Las cepas usadas para las inmunizaciones incluyeron antígenos víricos de H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/New York/55/2004, B/Jiangsu/10/2003 (1,5 µg/cepa, 1/10ª de la dosis humana).

Tabla 11

Gr.

Antígeno / formulación Otro tratamiento 1 Fraccionado trivalente N simple (no adyuvantada) Sensibilización heteróloga D0 2 Fraccionado trivalente / AS03 Sensibilización heteróloga D0 3 Fraccionado trivalente / AS03 1/2 Sensibilización heteróloga D0 4 Fraccionado trivalente / AS03 1/5 Sensibilización heteróloga D0 PBS Sensibilización heteróloga D0 V.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna

Fraccionada trivalente / simple

Las formulaciones para una dosis de 100 µl se prepara extemporáneamente según la secuencia: agua para inyectables + tampón de solución salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7, 4 preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + lote de Fluarix DFLUA014 (1,5 µg por cepa en la dosis final).

Fraccionada trivalente / AS03

Las formulaciones para una dosis de 100 µl se prepara extemporáneamente según la secuencia: agua para inyectable + tampón de solución salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7, 4 preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + lote de Fluarix clínico DFLUA014 (1, 5 µg por cepa en la dosis final) + 25 µl de emulsión SB62 para la dosis completa o 12,5 µl de emulsión SB62 para la mitad de la dosis o 5 µl de emulsión SB62 para 1/5 de la dosis. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al final de la preparación.

V.1.3 Lecturas (Tabla 12) La respuesta inmunitaria humoral a la vacunación se midió después de cada inmunización en los días 21 después de la inmunización (10 ratones/grupo) y las muestras de suero se analizaron mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI). La respuesta inmunitaria celular (15 ratones por grupo) se analizó 7 días después de la inmunización por tinción intracelular de citocinas (ICS).

Tabla 12

Lectura

Punto de tiempo

Tipo de muestra

Procedimiento de análisis

Respuesta humoral D49 Sueros IHA Respuesta celular D35 PBMC ICS

V.2. Resultados

V.2.1. Inmunidad humoral (10 ratones/grupo).

Los resultados se presentan en la Figura 6. En este modelo de ratón de sensibilización heterosubtípica seguida de una única vacunación se mostró que AS03 y diluciones (1/2 Y 1/5) del mismo inducían mayores títulos de HI en comparación con la vacuna simple. Para las tres cepas no se observaron diferencias de los títulos de HI entre ratones que recibieron la vacuna adyuvantada con una dosis completa de AS03 o dosis reducida de AS03.

V.2.2. Inmunidad celular (15 ratones/grupo).

Los resultados se presentan en la Figura 7. Independientemente de la dilución de AS03, se observaron mayores respuestas de linfocitos T CD4+ en ratones inmunizados con vacuna fraccionada trivalente adyuvantada con AS03 en comparación con los ratones inmunizados con la vacuna simple fraccionada trivalente. En comparación con la respuesta inducida en ratones inmunizados con la vacuna fraccionada trivalente adyuvantada con una dosis completa de AS03 se observó una tendencia a reducir las respuestas celulares cuando los ratones se inmunizaron con la vacuna fraccionada trivalente adyuvantada con menores dosis de AS03.

V.3. Resumen de resultados y conclusiones

En conclusión, se observó un aumento en aumento en las respuestas humorales y celulares en animales sensibilizados con cepas heterosubtípicas cuando se usaron vacunas adyuvantadas con AS03 en comparación con la vacuna simple. Se observó una magnitud similar de la respuesta humoral entre ratones inmunizados con dosis completa o dosis fraccionada de adyuvante AS03. Sin embargo, una reducción en la dosis de adyuvante se asoció a una tendencia a una magnitud reducida de la respuesta de linfocitos T CD4+.

Ejemplo VI - Evaluación preclínica de la respuesta inmunitaria celular inducida por vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03 y antígeno de dosis baja) en ratones C57BI/6 sensibilizados

VI.1. Diseño experimental y objetivo

Los experimentos en ratones sensibilizados a la gripe se realizaron con el fin de evaluar el aumento en las respuestas inmunitarias celulares por AS03 inducidas por vacunas contra la gripe que contienen antígeno de dosis baja (0,5 µg/cepa, 1/30ª de la dosis humana) y formuladas con este adyuvante de aceite en agua. Para simular la situación humana se realizó un experimento usando animales sensibilizados con cepas heterosubtipicas.

VI.1.1. Tratamiento/grupo (Tabla 13) Grupos de 15 ratones C57BI/6 hembra adultos se sensibilizaron intranasalmente (20 µl de volumen) el día 0 con virus de la gripe inactivado con formalina completos trivalente (5 µg de HA para cada cepa). Las cepas de sensibilización consistieron en variantes de desviación anteriores (5 µg de HA para H1N1 A/Beijing/262/95, H3N2 A/ Panama/2007/99, B/ Shangdong/7/97 inactivadas completas) a las incluidas en la vacuna. Veintiocho días después, los ratones se vacunaron con una dosis única del candidato a vacuna intramuscularmente en un volumen total de 50 µl. Se inmunizó a los ratones con formulaciones que contenían antígenos fraccionados solos (simples fraccionados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos fraccionados adyuvantados con tres dosis de AS03 (completa 1/2 o 1/5). Las cepas usadas para las inmunizaciones incluyeron antígenos víricos de H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/New York/55/2004, B/Jiangsu/10/2003 (0,5 µg/cepa, 1/30ª de la dosis humana).

Tabla 13

Gr.

Antígeno / formulación Otro tratamiento 1 Fraccionado trivalente N simple (no adyuvantada) Sensibilización heteróloga D0 2 Fraccionado trivalente / AS03 Sensibilización heteróloga D0 3 Fraccionado trivalente / AS03 1/2 Sensibilización heteróloga D0 4 Fraccionado trivalente / AS03 1/5 Sensibilización heteróloga D0 PBS Sensibilización heteróloga D0 VI.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna

Fraccionada trivalente / simple

Las formulaciones para una dosis de 50 µl se prepara extemporáneamente según la secuencia: agua para inyectables + tampón de solución salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7, 4 preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + lote de Fluarix DFLUA014 (0,5 µg por cepa en la dosis final).

Fraccionada trivalente / AS03

Las formulaciones para una dosis de 50 µl se prepara extemporáneamente según la secuencia: agua para inyectable + tampón de solución salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7, 4 preparado como se enseña en el Ejemplo IV) + lote de Fluarix clínico DFLUA014 (0,5 µg por cepa en la dosis final) + 25 µl de emulsión SB62 para la dosis completa o 12,5 µl de emulsión SB62 para la mitad de la dosis o 5 µl de emulsión SB62 para 1/5 de la dosis. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al final de la preparación.

VI.1.3 Lecturas (Tabla 14) La respuesta inmunitaria celular (15 ratones por grupo) se analizó 7 días después de la inmunización por tinción intracelular de citocinas.

Tabla 14

Lectura Punto de tiempo Tipo de muestra Procedimiento de análisis Respuesta celular D35 PBMC ICS

VI.2. Resultados

VI.2.1. Inmunidad celular Los resultados se presentan en la Figura 8. Se observaron respuestas de linfocitos T CD4+ marginalmente mayores en ratones inmunizados con vacuna fraccionada trivalente adyuvantada con AS03 dosis completa o 1/2 de la dosis) en comparación con los ratones inmunizados con la vacuna simple fraccionada trivalente. En comparación con la respuesta inducida en ratones inmunizados con la vacuna fraccionada trivalente simple o adyuvantada con una dosis completa o media dosis de AS03, se observaron respuestas celulares mayores cuando los ratones se inmunizaron con la vacuna fraccionada trivalente adyuvantada con 1/5 de la dosis de AS03.

VI.3. Resumen de resultados y conclusiones

En conclusión, se observó un mínimo aumento en las respuestas celulares de linfocitos T CD4+ en animales sensibilizados con cepas heterosubtípicas cuando se usaron vacunas adyuvantadas con AS03 en comparación con la vacuna simple. No se observó respuesta a la dosis de adyuvante en este experimento y, de hecho, un 1/5 de la dosis de AS03 indujo mayores frecuencias de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno que las observadas con mayor dosis de adyuvante. En general, estos datos no son consistentes con los datos de otros experimentos preclínicos y pueden sugerir un problema técnico con este experimento concreto.

Ejemplo VII - Evaluación preclínica de vacunas contra la H5N1 fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03 y dosis bajas de antígeno) en ratones C57BI/6 no sensibilizados previamente.

VII.1. Diseño experimental y objetivo

Los experimentos en ratones no expuestos previamente a H5N1 se realizaron con el fin de evaluar el aumento en las respuestas humorales y celulares por AS03 inducidas por vacunas fraccionadas contra H5N1 formuladas con este adyuvante de aceite en agua. En el caso de una pandemia se espera que toda la población mundial no haya recibido tratamiento inmunológico previo frente a la cepa de la gripe pandémica recientemente en circulación. Debido a este estado inmunitario sin tratamiento previo, una vacuna pandémica requerirá probablemente dos dosis de vacuna para proteger a los individuos de la infección y la grave enfermedad producida por una nueva cepa de la gripe. Para representar esta falta de exposición previa se desarrolló un modelo de ratón sin tratamiento previo para evaluar la inmunogenicidad de las vacunas- VII.1.1. Tratamiento/grupo (Tabla 15) Grupos de 15 ratones C57BI/6 hembra adultos sin tratamiento previo se inmunizaron los días 0 y 21 con un candidato a vacuna contra H5N1 pandémica intramuscularmente en un volumen total de 50 µl. Se inmunizó a los ratones con formulaciones que contenían antígenos fraccionados de H5N1 (simples fraccionados H5N1) o formulaciones que contenían antígenos fraccionados adyuvantados con tres dosis de AS03 (doble, completa 1/2 o 1/5). Las cepas usadas para las inmunizaciones incluyeron antígeno vírico H5N1 A/Vietnam/1194/04 (11,5 o 0,38 µg/cepa correspondiente a 1/10ª de la dosis humana).

No se realizó ninguna formulación con una dosis doble de AS03 sino mas bien una inyección concomitante de una dosis completa de 50 µl de H5N1 fraccionada/ dosis completa de AS03 + una dosis de 50 µl de AS03.

Tabla 15

Gr.

Antígeno / formulación Dosis de antígeno 1 H5N1 Fraccionado / simple (no adyuvantada) 1,5 µg 2 H5N1 Fraccionado / dosis doble de AS03 1,5 µg 3 Fraccionado H5N1 / AS03 1,5 µg 4 Fraccionado H5N1 / AS03 1/2 1,5 µg Fraccionado H5N1 / AS03 1/5 1,5 µg 6 H5N1 Fraccionado / simple (no adyuvantada) 0,38 µg 7 H5N1 Fraccionado / dosis doble de AS03 0,38 µg 8 Fraccionado H5N1 / AS03 0,38 µg 9 Fraccionado H5N1 / AS03 1/2 0,38 µg Fraccionado H5N1 / AS03 1/5 0,38 µg 11 PBS VII.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna Preparación de un litro de tampón de carga final (PBS a pH 7, 2 ± 0, 2): A 0,800 I de agua para inyectables, añadir 7,699 g de NaCl, 0,200 g de KCI, 0, 100 g de MgCl2 x 6H2O, 2,600 g de Na2HPO4 x 12H2O, 0, +373 g de KH2PO4.

Después de la solubilización, ajustar a 1,0 l con agua para inyectables.

Fraccionada H5N1 / simple

Preparación de una dosis de 50 µl: Se añaden tiomersal (cantidades teniendo en cuenta su concentración en la cepa) y Triton X100 al tampón de carga final. No se añade Tween 80 ya que el contenido diana en la formulación se alcanza mediante la concentración de Tween de la cepa. Las concentraciones finales son de 10 µg/ml para tiomersal, 368 µg/ml para Tween 80 y 35 µg/ml para Triton X100 en la dosis de formulación de 1,5 µg. Las concentraciones finales son de 10 µg/ml para tiomersal, 93 µg/ml para Tween80 y 8,9 µg/m para Triton X100 y 0,38 µg en la dosis de formulación. Después de 5-30 minutos de agitación magnética se añaden 1,5 o 0,38 µg de HA (cepa H5N1). Las formulaciones se agitan durante 30-60 minutos. El pH se comprueba. Las inyecciones se producen dentro de la hora siguiente a la finalización de la formulación.

Fraccionado H5N1 / AS03

Preparación de una dosis de 50 µl: Se añaden tiomersal (cantidades teniendo en cuenta su concentración en la cepa) y Triton X100 al tampón de carga final. No se añade Tween 80 ya que el contenido diana en la formulación se alcanza mediante la concentración de Tween de la cepa. Las concentraciones finales son de 10 µg/ml para tiomersal, 368 µg/ml para Tween 80 y 35 µg/ml para Triton X100 en la dosis de formulación de 1,5 µg. Las concentraciones finales son de 10 µg/ml para tiomersal, 93 µg/ml para Tween80 y 8,9 µg/m para Triton X100 y 0,38 µg en la dosis de formulación. Después de 5-30 minutos de agitación magnética se añaden 1,5 o 0,38 µg de HA (cepa H5N1). Después de 30-60 minutos de agitación magnética se añaden 25 o 12,5 o 5 µl de emulsión SB62. Las formulaciones se agitan durante 30-60 minutos. El pH se comprueba. Las inyecciones se producen dentro de la hora siguiente a la finalización de la formulación.

VII.1.3 Lecturas (Tabla 16) La respuesta inmunitaria humoral también se midió 21 días después de la inmunización (10 ratones/grupo) mediante los títulos de anticuerpos anti–Ig, IgG1 e IgG2b (Figura 9, A–F). La respuesta inmunitaria celular se analizó 21 días después de la inmunización (10 ratones por grupo) mediante ensayo de inhibición de la hemaglutinación de anti- H5N1 (Figura10, A-B). La respuesta inmunitaria celular se analizó 6 días después de la inmunización (5 conjuntos de 3 ratones por grupo) mediante tinción intracelular de citocinas (ICS)) de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno numerados por citometría de flujo (Figura 11, A-B).

Tabla 16

Lectura Punto de tiempo Tipo de muestra Procedimiento de análisis Respuesta humoral D39 Sueros ELISA, isotipos y títulos de HI Respuesta celular D34 PBMC ICS

VII.2. Resultados

VII.2.1. Respuesta inmunitaria humoral: ELISA e isotipos.

Los resultados se presentan en la Figura 9.

A cada dosis de la vacuna fraccionada contra H5N1, todos los grupos adyuvantados indujeron mayores títulos de anticuerpos Ig, IgG1 y IgG2b anti-H5N1 en comparación con la vacuna fraccionada contra H5N1 no adyuvantada (Figuras 9 -A a F).

A cada dosis de vacuna fraccionada contra H5N1; la respuesta de anticuerpos IgG1 dirigidos contra H5N1 fue 4-5 veces superior a la respuesta de anticuerpos IgG2b dirigidos contra H5N1 (Figuras 9 -C a F). Con una dosis de 1,5 µg de HA de vacuna fraccionada contra H5N1 y combinada con cada dosis de adyuvante no se observó diferencia de respuestas de anticuerpos Ig, IgG1 y IgG2b dirigidos contra H5N1 (Figuras 9 - A, C y E).

Con una dosis de 0,38 µg de HA de vacuna fraccionada contra H5N1 se obtuvo una tendencia a mayores títulos de Ig dirigida contra H5N1 después de la inmunización con vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con 2x dosis completa en comparación con la respuesta inducida por la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03N2 (p= 0,7315) y AS03 1/5 (p=0,9744) (Figura 9-B). Esta tendencia también se observó para la respuesta de anticuerpos IgG1 dirigidos contra H5N1 (Figura 9 - D). Sin embargo, la potencia no fue suficiente para observar una diferencia estadísticamente significativa (25 % de potencia para una diferencia de 1,7 veces, o 47 % para una diferencia de 2 veces).

VII.2.2. Respuesta inmunitaria humoral: Títulos de HI.

Con una dosis de 1,5 μg de HA/ratones:

A cada dosis de adyuvante, todos los ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03 indujeron mayores títulos de HI en comparación con la respuesta obtenida en ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 no adyuvantada (Figura 10-A). No se observó diferencia estadísticamente significativa de títulos de HI cuando la vacuna fraccionada contra H5N1 se adyuvantó con un intervalo de dosis de AS03 (Figura 10-A).

Con una dosis de 0,38 μg de HA/dosis

A cada dosis de adyuvante, todos los ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03 indujeron mayores títulos de HI en comparación con la respuesta obtenida en ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 no adyuvantada (Figura 10-B).

Se observaron títulos de HI significativamente mayores con la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con 2x dosis completa de AS03 en comparación con la respuesta obtenida con la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03/2 (p=0, 032 para una diferencia de 4 veces) (Figura 10B).

No se observó diferencia estadísticamente significativa de los títulos de HI en ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con 2x dosis completa de AS03 o una dosis completa de AS03 o entre ratones inmunizados con vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03N2 o AS03N5 (Figura 10B).

Comparación entre dosis de antígeno (1,5 μg o 0,38 μg):

No se observó diferencia de títulos de HI entre ratones inmunizados con cada dosis de HA de la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03, AS03/2 o AS03/5, excepto entre ratones inmunizados con 1,5 µg de HA de fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03/5 y los ratones inmunizados con la vacuna contra H5N1 fraccionada de HA con 2x dosis completas de AS03 (Figura 10). Los títulos de HI fueron significativamente más altos después de la inmunización con 0,38 µg de H5N1 fraccionada HA adyuvantada con 2x dosis completa de S03 en comparación con la dosis de antígeno superior combinado con la dosis más baja de adyuvante (1,5 µg de HA con AS03 / 5, p = 0,0193 para una diferencia de 4 veces) (Figura 10).

VII.2.3. Respuesta inmunitaria celular Los resultados se presentan en la Figura 11.

A cada dosis de vacuna fraccionada contra H5N1 (1,5 o 0,38 µg) se observaron mayores respuestas de linfocitos T CD4+ en ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con diversas dosis de AS03 en comparación con los ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 no adyuvantaza (Figura 11).

A una dosis de 1,5 µg de vacuna fraccionada contra H5N1, una reducción de la dosis de AS03 se correspondió con una disminución en las frecuencias de linfocitos T CD4+ (Figura 11A). Sin embargo, a una dosis 0,38 µg de la vacuna fraccionada contra H5N1 no se observó diferencia en las respuestas de linfocitos T CD4+ entre diferentes dosis de adyuvante en ratones inmunizados con vacunas fraccionadas contra H5N1 adyuvantadas con AS03 (Figura 11B).

VII.3. Resumen de resultados y conclusiones

Los estudios de inmunogenicidad en ratones mostraron que la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada indujo respuestas humorales (títulos de ELISA y de HI anti-H5N1) y celulares (linfocitos T CD4 +) significativamente mayores que las inducidas por la vacuna fraccionada contra H5N1 no adyuvantaza.

No se observó efecto de respuesta a dosis de antígeno para la respuesta inmunitaria humoral entre ratones inmunizados con 1,5 µg y 0,38 µg de vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada, lo que sugiere que en presencia de adyuvante pueden requerirse incluso dosis de HA menores para observar un efecto de respuesta a dosis en este modelo.

Se observó un fuerte aumento en las respuestas de linfocitos T CD4+ en ratones sin tratamiento previo cuando se usaron vacuna pandémicas contra H5N1 adyuvantadas con AS03 en comparación con la vacuna contra H5N1 simple. No se observó impacto de la dilución de AS03 cuando se usó una dosis de 0,38 µg de vacuna fraccionada contra H5N1 como candidato a vacuna, mientras que se observó una disminución de respuestas de linfocitos T CD4 cuando 1,5 µg de la vacuna fraccionada contra H5N1 se adyuvantó con la dosis reducida de AS03.

Como se ha observado previamente, no se observó diferencia en respuestas inmunitarias humorales y celulares entre ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 (a cualquier dosis de antígeno) adyuvantada con una dosis completa de AS03 o con AS03/2. Se detectó alguna potenciación en la respuesta inmunitaria cuando seusó 2x de la dosis completa de AS03 en la formulación de vacunas y, por consiguiente, se detectó una disminuciónen la respuesta inmunitaria cuando se usó AS03N5 en la formulación de vacunas.

En conjunto, los datos notificados en el presente documento avalan la potencia de este sistema de adyuvante novedoso en esta formulación de vacunas.

Ejemplo VIII - Evaluación preclínica de vacunas contra la gripe adyuvantadas y no adyuvantadas en cerdos Large White sensibilizados.

VIII.1. Diseño experimental y objetivo

Los experimentos en cerdos sensibilizados a la gripe se realizaron con el fin de evaluar el aumento en las respuestas humorales por AS03 inducidas por vacunas contra la gripe formuladas con este adyuvante de aceite en agua.

Se usaron cerdos con el fin de evaluar un intervalo de dosis de AS03 en un modelo animal próximo a seres humanos. Los cerdos muestran una larga lista de analogías biológicas que establecen este animal como fisiológicamente el más próximo al hombre con muy pocas excepciones (Douglas R., 1972). Además, la manifestación de la infección de la gripe en cerdos se observa habitualmente.

VIII.1.1. Tratamiento/grupo (Tabla 17) Grupos de 10 cerdos hembra Large White adultos se sensibilizaron el día 0 intranasalmente con un volumen total de 200 µl con virus de la gripe inactivado con formalina completos trivalente (25 µg de HA para cada cepa). Las cepas de sensibilización consistieron en cepas homologas a la cepas de la vacuna (25 µg de HA para H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99 and B/Shangdong/7/97 completas inactivadas). Veintiocho días después, los cerdos se vacunaron con una dosis única del candidato a vacuna intramuscularmente en un volumen total de 500 µl. Se inmunizó a los cerdos con formulaciones que contenían antígenos fraccionados solos (simples fraccionados trivalentes) o formulaciones que contenían antígenos fraccionados adyuvantados con un intervalo de dosis de AS03 (completa 1/2 o 1/5). Las cepas usadas para las inmunizaciones incluyeron los antígenos víricos de H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99 and B/Shangdong/7/97 viral antígenos (15 µg HA for H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99 y 17,5 µg de la cepa B/Shangdong/7/97como en una dosis humana).

Grupos (10 cerdos/grupo):

Tabla 17

Gr.

Antígeno / formulación Otro tratamiento 1 Fraccionado trivalente N simple (no adyuvantada) Sensibilización heteróloga D0 2 Fraccionado trivalente / AS03 Sensibilización heteróloga D0 3 Fraccionado trivalente / AS03 1/2 Sensibilización heteróloga D0 4 Fraccionado trivalente / AS03 1/5 Sensibilización heteróloga D0 VIII.1.2 Preparación de las formulaciones de vacuna

Fraccionada trivalente / simple

Una premezcla de Tween 80, Triton X100 y succinato de vitamina E (VES) se prepara con el fin de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 µg/ml de Tween 80, 110 µg/ml de Triton X100 y 100 µg/ml de VES. Las cantidades usadas en la premezcla tienen en cuenta su contenido en las cepas.

La formulación de una dosis de 500 µl se prepara extemporáneamente según la secuencia: agua para inyectables + tampón de solución salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7, 4 preparado como se enseña en el ejemplo IV) + premezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1, 5 µg de HA para la cepa H1N1, 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1, 5 µg de HA para la cepa H3N2, 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 17,5 µg de HA de la cepa B, 15 minutos agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al final de su preparación.

Fraccionada trivalente / AS03

Una premezcla de Tween 80, Triton X100 y succinato de vitamina E (VES) se prepara con el fin de alcanzar una concentración final en la vacuna de 750 µg/ml de Tween 80, 110 µg/ml de Triton X100 y 100 µg/ml de VES. Las cantidades usadas en la premezcla tienen en cuenta su contenido en las cepas.

La formulación de una dosis de 500 µl se prepara extemporáneamente según la secuencia: agua para inyectables + tampón de solución salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7, 4 preparado como se enseña en el ejemplo IV) + premezcla, 5 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1, 125 µg de HA para la cepa H1N1, 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 1,5 µg de HA para la cepa H3N2, 10 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente, + 17,5 µg de HA de la cepa B, 15 minutos agitación magnética a temperatura ambiente + 250 µl de la emulsión SB62 para la dosis completa de AS03 o 5 µl de la emulsión SB62 para la dosis de 1/2 de AS03 o 50 µl de la emulsión SB62 para la dosis de 1/5 de AS03, 15 minutos de agitación magnética a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al final de su preparación.

VIII.1.3 Lecturas (Tabla 18) La respuesta inmunitaria humoral a la vacunación se midió antes de la sensibilización intranasal (día 0) y antes de la inmunización (día 28) y 14 días después de la inmunización (10 cerdos/grupo). Las muestras de suero se analizaron mediante la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI).

Tabla 18

Lectura Punto de tiempo Tipo de muestra Procedimiento de análisis Respuesta humoral D0, D28, D42 Sueros IHA

VIII.2. Resultados y conclusiones

VIII.2.1. Inmunidad humoral Los resultados se presentan en la Figura 12. Independientemente de la dilución del adyuvante, las formulaciones fraccionadas trivalentes adyuvantadas con AS03 indujeron una mayor respuesta de HI a todas las cepas que la formulación trivalente simple en este modelo de sensibilización homóloga, aunque la significación estadística no siempre se alcanzó para las tres cepas. Se observó un efecto de la dosis de adyuvante con ligeras diferencias de cepa a cepa. Para cepas menos inmunogénicas tales como B/Shandong, solo la vacuna fraccionada trivalente adyuvantada con una dosis completa de AS03 fue significativamente diferente de la vacuna simple. A diferencia de la vacuna fraccionada trivalente adyuvantada con una dosis completa de AS03, una dosis reducida de AS03 fracasó en aumentar los títulos de HI para las tres cepas anteriores por encima de aquellos observados con la vacuna simple.

Ejemplo IX

Inmunogenicidad de los antígenos dPly–PhtD–PD adyuvantados con AS03 a diferentes diluciones.

IX.1 Experimento Lims 20080257 dPly (neumolisina destoxificada) y PhtD (la proteína D de la tríada de polihistidina) son proteínas de Streptococcus pneumoniae, mientras que PD es proteínas D de Haemophilus influenzae. Los ratones C57bl se inmunizaron por vía intramuscular tres veces (día 0, 14 y 28) con C57blde una dosis humana de dos lotes clínicos liofilizados de dPly– PhtD–PD (DSPEA005A and 006A) en adyuvante AS03A (250 µg de SB62) (Grupos 1 y 2). Se utilizó un lote preclínico líquido de dPly–PhtD–PD en AS03A como vacuna de referencia (Grupo 3). El lote clínico DSPEA005 reconstituido con AS03B (125 µg de SB62) y AS03C (62,5 µg de SB62) también se evaluó (Grupos 4 y 5). Por último, los dos lotes clínicos liofilizados reconstituidos con solución salina se inyectaron como comparadores con el fin de medir el efecto del adyuvante sobre la respuesta inmunitaria inducida contra los antígenos dPly, PhtD y PD (Grupos 6 y 7).

Se extrajo sangre de los ratones el día 42 y la respuesta de anticuerpos dirigidos contra cada antígeno se midió mediante ELISA. Los datos se presentan en la Figura 13 como GMC en µg/ml.

Se demostró la consistencia de los dos lotes clínicos de dPly–PhtD–PD (DSPEA005A y 006A). No se mostró impacto de la liofilización (Grupo 1 y 2 frente al Grupo 3). Se indujeron títulos de anticuerpos significativamente más altos contra todos los antígenos mediante las formulaciones AS03 (Grupos 1 a 5) en comparación con las formulaciones sin adyuvante (Grupos 6 y 7). A excepción de PD en la formulación AS03C (Grupo 5), no se observaron diferencias significativa sen los títulos de anticuerpos inducidos contra cada antígeno por la formulación que contiene diferentes concentraciones de adyuvante (Grupos 1, 4 y 5).

IX.2 Experimento Lims 20080334–20080340 Los ratones C57BL se inmunizaron por vía intramuscular tres veces (día 0, 14 y 28) con 1/10 de una dosis humana de los lotes clínicos de dPly–PhtD–PD liofilizados (DSPEA006A) a diferentes concentraciones (15 - 15 - 15; 30 - 30 - 30 y 60 - 60 - 60 µg) y reconstituidos en solución salina o en adyuvante AS03A (250 µg de SB62), AS03B (125 µg de SB62) y AS03C (62,5 µg de SB62). Se extrajo sangre de los ratones el día 42 y la respuesta de anticuerpos dirigidos contra cada antígeno se midió mediante ELISA. Los datos se presentan en la Figura 14 como GMC en µg/ml.

Un aumento significativo de los títulos de anticuerpos dirigidos contra todos los antígenos se muestra en la formulación que contiene AS03 (grupos 1 a 9) en comparación con las formulaciones que contienen solamente solución salina (Grupos 10 a 12). No se observó claro impacto de la dosis de antígeno en la respuesta inmunitaria dirigida contra cada antígeno. No se observó ningún impacto significativo de la dilución adyuvante sobre la respuesta de anticuerpo dirigido contra dPly y PhtD. Para PD se observó una diferencia significativa entre AS03A y C a la concentración de antígeno de 3 y 6 µg.

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende un PhtD neumocócico sin conjugar y una neumolisina neumocócica sin conjugar y una composición adyuvante que consiste en una emulsión de aceite en agua, en la que dicha emulsión de aceite en agua consiste en 0,5-10 mg de aceite metabolizable, 3-9 mg de tocol y 0,1-4 mg de agente emulsionante por dosis para ser humano y el aceite y el agente emulsionante están en un vehículo acuoso, en la que el volumen de la dosis está entre 0,4 y 1,5 ml.

2. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el volumen de dosis es de 0,5 ml.

3. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la emulsión de aceite en agua comprende 1 - 10, 2 - 10, a 3 - 9, 4 - 8, 5 - 7, o 5 - 6 mg de aceite metabolizable, por dosis para ser humano.

4. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 – 3, en la que la emulsión de aceite en agua comprende 4 - 8, 5 - 7, o 5 - 6 mg de tocol, por dosis para ser humano.

5. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 – 4, en la que la emulsión de aceite en agua comprende 0,3 - 4, 0,4 - 3, o 2 - 3 mg de agente emulsionante, por dosis pada ser humano.

6. Una composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1 – 5, en la que el aceite metabolizable es escualeno.

7. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 – 6, en la que el tocol es alfa- tocoferol.

8. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 – 7, en la que el agente emulsionante es monooleato de sorbitán polioxietileno.

9. Una composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento profiláctico o terapia de la infección neumocócica o enfermedad neumocócica.

10. Uso de una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento profiláctico o terapia de la infección neumocócica o enfermedad neumocócica.