Sensor.

Un método para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

exponer la muestra a un transductor que es capaz de transformar un cambio de energía en una señal eléctrica y que comprende un transductor piroeléctrico o piezoeléctrico que tiene un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos

, el transductor que comprende fluoruro de polivinilideno y óxido de indio y estaño, el transductor que tiene, además, al menos un reactivo cautivo sobre o proximal al mismo, al menos el único reactivo cautivo que tiene un sitio activo que es capaz de unirse al analito;

introducir un reactivo marcado en la muestra, en donde el reactivo marcado contiene un sitio activo para el analito o el reactivo cautivo y un marcador que es capaz de absorber la radiación electromagnética generada por una fuente de radiación para generar energía mediante desintegración no radiactiva, en donde el marcador se selecciona de una partícula metálica, una partícula polimérica coloreada, una partícula magnética, una partícula de carbono y una nanopartícula que comprende un material de núcleo no conductor y al menos una capa de cubierta metálica;

permitir que el reactivo marcado se una al analito o el agente cautivo en un primer periodo en el cual el transductor se orienta de manera que se provoca que el reactivo marcado se asiente, al menos en parte, sobre el transductor;

posteriormente, en un segundo periodo, provocar que el reactivo marcado se desprenda mediante la inversión del transductor con respecto a la muestra o invertir parcialmente el transductor con respecto a la muestra de manera que se provoca que el reactivo marcado se separe de la superficie del transductor;

irradiar la muestra con radiación electromagnética durante el primero y el segundo periodos,

transformar la energía generada en una señal eléctrica;

detectar la señal eléctrica.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2008/050699.

Solicitante: Vivacta Limited.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: 100 Guillat Avenue Kent Science Park Sittingbourne Kent ME9 8GU REINO UNIDO.

Inventor/es: ROSS,Steven Andrew, CARTER,TIMOTHY JOSEPH NICHOLAS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/543 (con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos)

PDF original: ES-2530673_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Sensor.

La presente invención se refiere a un sensor y en particular a un sensor y un método para usar un sensor para realizar un ensayo de unión. 5

En un ensayo de unión, tal como un inmunoensayo, se hace uso de la interacción específica de "llave y cerradura" entre el analito (frecuentemente una proteína o hapteno) y una porción de unión (tal como un anticuerpo) dirigida específicamente contra todo o parte (un epítopo) del antígeno (el analito) . La unión entre el analito y el anticuerpo es específica, que minimiza las interacciones con las especies relacionadas pero no idénticas, y fuerte, que da buena 10 sensibilidad. Con el objetivo de cuantificar el analito desconocido, una cantidad determinada ya sea del analito marcado con un marcador característico (por ejemplo, una molécula fluorescente o quimioluminiscente) o un segundo anticuerpo (el "reportero") marcado similarmente, se mezcla con la muestra. Las especies marcadas, presentes en exceso, se unirán después al analito y alcanzan finalmente un equilibrio en el cual la mayor parte del analito se asocia con al menos un marcador. Dado que la concentración del marcador es fija, con el objetivo de cuantificar el analito, la parte asociada 15 con el analito (la fracción "unida") debe separarse físicamente de la no asociada (la fracción "libre") . Cualquier fracción puede cuantificarse después, la "unida" que es directamente proporcional y la "libre" que es inversamente proporcional a la concentración del analito. Normalmente, la separación de las fracciones "unida" y "libre" se lleva a cabo mediante el uso de un segundo anticuerpo (el anticuerpo de "captura") , dirigido contra un epítopo diferente en el analito, unido a una fase sólida tal como una superficie de perla o sólida. Esta superficie de perla o sólida puede separarse después 20 físicamente de la solución en masa y realizar la medición, por ejemplo, mediante el uso de un fluorímetro si el marcador es una molécula fluorescente. Varias diferentes formas de interacciones de unión además de las interacciones anticuerpo/antígeno pueden utilizarse en los ensayos de unión, que incluyen pero sin limitarse a las interacciones ADN/ADN, ARN/ARN y de aptámeros. Las modalidades alternativas de tales ensayos se conocen, tales como los ensayos "competitivos", donde el analito se mezcla con una cantidad conocida del analito marcado y los dos compiten 25 después por los sitios activos. La medida del analito marcado unido es entonces inversamente proporcional a la cantidad de analito no marcado en la muestra original.

Una manera única de distinguir entre la fracción marcada "unida" y la fracción marcada "libre" sin tener que realizar las etapas de separación y lavado es la descrita en WO 2004/090512, en la cual la fase sólida que incorpora el anticuerpo 30 de captura es una película piezoeléctrica o piroeléctrica, por lo general PVDF. Esta tiene la capacidad única de combinar la función de separación de la fase sólida junto con la técnica de medición. Como se describe en WO 2004/090512 el anticuerpo "reportero" marcado (marcado con un material coloreado adecuado tal como carbono u oro coloidal) se une a la superficie de captura a una velocidad proporcional a la concentración del analito que se mide; esta unión se monitorea simultáneamente mediante la irradiación de la superficie con luz de un color complementario. La 35 energía luminosa se absorbe por el marcador en la superficie y se transfiere mediante desintegración no radiactiva como calor, que se detecta por la película de PVDF. Un beneficio simultáneo de este sistema es que la energía absorbida de manera similar por el marcador no unido en la solución en masa se pierde en el medio líquido sin detectarse por la película de PVDF que efectúa así automáticamente una "separación" entre las fracciones "unida" y "libre". Es conveniente usar una partícula coloidal de suficiente tamaño para permitir que un número significativo de 40 fotones se absorba por la partícula para dar una señal fuerte y por lo tanto buena sensibilidad.

El sensor descrito en WO 2004/090512 se usa para monitorear en tiempo real la cinética de unión del marcador a la superficie de captura, la cual es proporcional a la concentración del analito. Este método depende de la velocidad de difusión de las especies marcadas hacia la superficie y la velocidad de unión en la superficie. Si cualquiera de estas 45 velocidades es subóptima, pueden limitarse la sensibilidad total o el tiempo de reacción del ensayo. La velocidad de unión en la superficie puede limitarse por un número de factores, tal como el impedimento estérico entre el anticuerpo marcado (por ejemplo, si una partícula grande de carbono o de oro se usa como el marcador) . Adicionalmente, puede existir repulsión electrostática que puede inhibir el acercamiento de una partícula grande (20-500 nm) a una superficie sólida, o pueden existir efectos de orientación donde la partícula se acerca a la fase sólida pero la superficie de unión en 50 la partícula se orienta en la dirección incorrecta para que tenga lugar la unión. Esto es más probable que ocurra con partículas grandes recubiertas de muchos anticuerpos, con sólo una pequeña fracción de estos anticuerpos que se unen al analito, de manera que sólo pequeñas partes del área de la superficie de la partícula están disponibles para unirse a la superficie. Además de estos factores limitantes sobre la velocidad de unión, también existen otros factores que pueden limitar el tamaño de la partícula usada en una prueba de inmunoensayo. Por ejemplo, en las pruebas de tiras 55 inmunocromatográficas de "flujo lateral" convencionales, el tamaño óptimo de la partícula coloidal de oro es de aproximadamente 40 nm, debido a que las partículas más grandes tienden a quedar atrapadas en la membrana de flujo debido a su tamaño y densidad. Finalmente, las partículas más grandes tienen menores velocidades de difusión y así requieren de más tiempo para difundir hacia la superficie de captura, y posiblemente limitan así la señal disponible.

60 Aún queda una necesidad en la técnica, por lo tanto, de mejoras adicionales en la sensibilidad de tales ensayos.

En consecuencia, la presente invención proporciona un método para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

exponer la muestra a un transductor que es capaz de transformar un cambio de energía en una señal eléctrica y que comprende un transductor piroeléctrico o piezoeléctrico que tiene un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos, el transductor que comprende fluoruro de polivinilideno y óxido de indio y estaño, el transductor que tiene, además, al menos un reactivo cautivo sobre o proximal al mismo, al menos el único reactivo cautivo que tiene un sitio activo que es capaz de unirse al analito; 5

introducir un reactivo marcado en la muestra, en donde el reactivo marcado contiene un sitio activo para el analito o el reactivo cautivo y un marcador que es capaz de absorber la radiación electromagnética generada por una fuente de radiación para generar energía mediante desintegración no radiactiva, en donde el marcador se selecciona de una partícula metálica, una partícula polimérica coloreada, una partícula magnética, una partícula de carbono y una nanopartícula que comprende un material de núcleo no conductor y al menos una 10 capa de cubierta metálica;

permitir que el reactivo marcado se una al analito o al agente cautivo en un primer periodo en el cual el transductor se orienta de manera que se provoca que el reactivo marcado se asiente, al menos en parte, sobre el transductor;

posteriormente, en un segundo periodo, provocar que el reactivo marcado se desprenda mediante la inversión 15 del transductor con respecto a... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

exponer la muestra a un transductor que es capaz de transformar un cambio de energía en una señal eléctrica y que comprende un transductor piroeléctrico o piezoeléctrico que tiene un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos, el transductor que comprende fluoruro de polivinilideno y óxido de indio y estaño, el transductor que tiene, además, al menos un reactivo cautivo sobre o proximal al mismo, al menos el único reactivo cautivo que tiene un sitio activo que es capaz de unirse al analito; 10

introducir un reactivo marcado en la muestra, en donde el reactivo marcado contiene un sitio activo para el analito o el reactivo cautivo y un marcador que es capaz de absorber la radiación electromagnética generada por una fuente de radiación para generar energía mediante desintegración no radiactiva, en donde el marcador se selecciona de una partícula metálica, una partícula polimérica coloreada, una partícula magnética, una partícula de carbono y una nanopartícula que comprende un material de núcleo no conductor y al menos una 15 capa de cubierta metálica;

permitir que el reactivo marcado se una al analito o el agente cautivo en un primer periodo en el cual el transductor se orienta de manera que se provoca que el reactivo marcado se asiente, al menos en parte, sobre el transductor;

posteriormente, en un segundo periodo, provocar que el reactivo marcado se desprenda mediante la inversión 20 del transductor con respecto a la muestra o invertir parcialmente el transductor con respecto a la muestra de manera que se provoca que el reactivo marcado se separe de la superficie del transductor;

irradiar la muestra con radiación electromagnética durante el primero y el segundo periodos, transformar la energía generada en una señal eléctrica;

detectar la señal eléctrica. 25

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el reactivo marcado es más denso que la muestra y la gravedad actúa sobre el reactivo marcado para provocar que el reactivo marcado se asiente, al menos en parte, sobre el transductor.

30 3. Un método como se reivindica en las reivindicaciones 1 o 2, en donde el reactivo marcado es menos denso que la muestra y la flotación actúa sobre el reactivo marcado para provocar que el reactivo marcado se asiente, al menos en parte, sobre el transductor.

4. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra se irradia con una serie de 35 pulsos de radiación electromagnética y el método comprende además la etapa de detectar el tiempo de retardo entre cada pulso de radiación electromagnética desde la fuente de radiación y la generación de la señal eléctrica, en donde el tiempo de retardo entre cada uno de los pulsos de radiación electromagnética y la generación de la señal eléctrica se corresponde con la posición del marcador en cualquiera de una o más posiciones a diferentes distancias desde la superficie del transductor. 40

5. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en donde al menos el único reactivo cautivo es un anticuerpo, el analito es un antígeno, y el reactivo marcado es un antígeno marcado que es capaz además de unirse al menos al único reactivo cautivo o un anticuerpo marcado que es capaz además de unirse al analito.

45 6. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en donde al menos el único reactivo cautivo se adsorbe en el transductor.

7. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en donde el marcador es una partícula que tiene 50 una densidad de 1.5 a 23 g/ml.

8. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en donde se toma una medición de línea de referencia después de introducir el reactivo marcado en la muestra, pero antes de permitir que el reactivo marcado se asiente sobre el transductor. 55

9. Un kit para detectar un analito en una muestra que comprende: un dispositivo que comprende una fuente de radiación adaptada para generar radiación electromagnética;

un transductor capaz de transformar un cambio de energía en una señal eléctrica, cuyo transductor comprende un transductor piroeléctrico o piezoeléctrico que tiene un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos, el transductor 60 que comprende fluoruro de polivinilideno y óxido de indio y estaño;

al menos un reactivo cautivo sobre o proximal al transductor, el reactivo cautivo que tiene un sitio activo que es capaz de unirse al analito;

una cámara para mantener la muestra en contacto de fluidos con el transductor, en donde la cámara se sella con una tapa o por las fuerzas capilares; y 65

un detector que es capaz de detectar la señal eléctrica generada por el transductor, en donde el dispositivo comprende un cartucho giratorio dentro de un lector fijo, y el cartucho incluye la cámara de muestras y el transductor; y un reactivo marcado, en donde el reactivo marcado contiene un sitio activo para el analito o el reactivo cautivo y un marcador que es capaz de absorber la radiación electromagnética generada por una fuente de radiación para generar energía mediante desintegración no radiactiva, en donde el marcador se selecciona de una partícula metálica, una 5 partícula polimérica coloreada, una partícula magnética, una partícula de carbono y una nanopartícula que comprende un material de núcleo no conductor y al menos una capa de cubierta metálica.

10. Un kit como se reivindica en la reivindicación 9, en donde al menos el único reactivo cautivo se adsorbe en el transductor. 10

11. Un kit como se reivindica en las reivindicaciones 9 o 10, en donde el reactivo marcado se une de manera liberable a una de las superficies de la cámara.

12. Un kit como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9 a la 11, en donde al menos el único reactivo cautivo 15 es un anticuerpo, el analito es un antígeno, y el reactivo marcado es un antígeno marcado que es capaz además de unirse al menos al único reactivo cautivo o un anticuerpo marcado que es capaz además de unirse al analito.

13. Un kit como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9 a la 12, en donde el marcador es una partícula que tiene una densidad de 1.5 a 23 g/ml. 20