Procedimientos para la síntesis de una disolución de hemoglobina modificada.

Un procedimiento de preparación de una disolución de hemoglobina modificada químicamente que comprende:

(a). poner en contacto una disolución de hemoglobina exenta de estroma con al menos un medio de filtración que comprende un filtro de corte de peso molecular 500.000, reteniendo dicho medio de filtración las partículas víricas y permitiendo el paso de un filtrado que comprende un polipéptido de hemoglobina y una enzima antioxidante endógena, y estando el filtrado sustancialmente exento de contaminación vírica;

(b). modificar químicamente el filtrado de la etapa (a) con un agente; y

(c). aislar la disolución de hemoglobina modificada químicamente y enzima antioxidante endógena, reteniendo al menos una de las enzimas antioxidantes endógenas la actividad enzimática.

DESCRIPCIÓN

Procedimientos para la síntesis de una disolución de hemoglobina modificada

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La invención se refiere a un procedimiento de preparación de una disolución de hemoglobina modificada químicamente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 10

Han aparecido avances en los últimos años en el desarrollo de sustitutos de la sangre basados en hemoglobina. Dichos fluidos de transfusión sirven como alternativas a la sangre completa o fracciones de sangre para uso como portadores de oxígeno, expansores del plasma, potenciadores de radiación y quimioterapia y secuestrantes de óxido nítrico. Los sustitutos de la sangre basados en hemoglobina se producen mediante la 15 modificación de hemoglobina ultrapurificada o exenta de estroma usando una variedad de reacciones intermoleculares o intramoleculares. Estas diversas modificaciones se diseñan para estabilizar la proteína, modular las propiedades de unión a oxígeno a niveles fisiológicos aceptables y para disminuir la toxicidad renal. Debido a la presencia de los restos hemo y hierro, la molécula de hemoglobina tiene una toxicidad potencial resultante de la rápida autoxidación de la hemoglobina después de interacciones con radicales libres y vasoconstricción mediada por 20 hemoglobina. Adicionalmente, la hemoglobina puede reaccionar con oxidantes celulares tales como peróxido de hidrógeno, dando como resultado la producción tanto de metahemoglobina (Fe3+) como de ferrilhemoglobina (Fe4+) , un fuerte oxidante que se ha reseñado que reticula proteínas y peroxida lípidos.

Los sistemas antioxidantes en los eritrocitos controlan estas reacciones de radicales libres y protegen 25 la función e integridad estructural de la hemoglobina. Por ejemplo, en el eritrocito, enzimas antioxidantes endógenas tales como superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) catalizan la degradación de superóxido y peróxido de hidrógeno (H2O2) , respectivamente, y sirven por ello para mantener la integridad funcional y estructural de la hemoglobina. Por ello, la capacidad de suministro de oxígeno de disoluciones de hemoglobina polimerizada puede potenciarse mediante la asociación con estas enzimas antioxidantes. 30

Un enfoque experimental reciente ha dado como resultado el diseño de una segunda generación de portadores de oxígeno basados eh hemoglobina en que la reactividad del radical libre está limitada. El diseño está basado en la reticulación mediada por glutaraldehído de SOD y catalasa purificadas con hemoglobina purificada. Véanse, por ejemplo, Dâ?Agnillo y col. (1998) Nature Biotechnol. 16: 667-671 y la patente de EE.UU. nº 5.606.025. Se 35 ha reseñado que la modificación evita la formación de ferrilhemoglobina mediada por H2O2 (Dâ?Agnillo y col. (1998) Free Rad. Bio. Med. 24: 906-912) y reduce la generación de radicales hidroxilo tanto in vitro, en un modelo de miembro posterior de rata de lesión por reperfusión isquémica (Dâ? Agnillo y col. (1998) Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 25: 181-192) como in vivo, en un modelo de rata de lesión por reperfusión isquémica intestinal (Razack y col. (1997) Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 25: 163-180) . Estos estudios han conducido a la 40 propuesta de que las hemoglobinas modificadas con actividad antioxidante pueden reducir la toxicidad potencial de los portadores de oxígeno basados en hemoglobina en ciertas aplicaciones al mantener la forma ferrosa portadora de oxígeno de la hemoglobina y disminuir la aparición de especies radicales libres asociadas a hemoglobina potencialmente dañinas o la liberación de productos de degradación de hemoglobina que pueden ser dañinos para los tejidos circundantes. 45

Aunque se ha sugerido que el complejo polipeptídico reticulado que comprende hemoglobina, SOD y catalasa tiene beneficios potenciales in vivo, los procedimientos enseñados por la patente de EE.UU. nº 5.606.025 para la producción de producto de hemoglobina modificada comprenden combinar hemoglobina purificada con catalasa y superóxido dismutasa bovinas purificadas en la reacción de reticulación. Existen varias desventajas 50 prácticas a la adición de enzimas de vuelta a hemoglobina purificada. En primer lugar, la adición de enzimas bovinas o cualquiera derivada de no humanos es potencialmente un problema basado en la inmunogenicidad asociada a las enzimas durante la administración humana. En segundo lugar, la purificación de las enzimas de sangre humana es costosa y puede ser inhibidora de la producción de un producto económico.

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La hemoglobina piridoxalada conjugada con polioxietileno (PHP) es una hemoglobina derivada de ser humano modificada químicamente. La molécula de PHP es una hemoglobina de superficie recubierta que contiene actividades enzimáticas antioxidantes endógenas (Privalle y col. (1998) Free Rad. Bio. Med. 25: (Supl. 1) S65 resumen; Privalle y col. (2000) Acta Physiol. Scand. 167: (Supl. 645) p200 resumen; Privalle y col. (1999) Free Rad. Bio. Med. 28: 1507-1517 y Talarico y col. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1476: 53-65. Se ha demostrado que la PHP, 60 en varios modelos in vitro, exhibe una reactividad disminuida hacia la oxidación mediada por peróxido de hidrógeno cuando se compara con hemoglobina no modificada o hemoglobina reticulada α, α. Por ello, la reactividad rédox de las preparaciones de hemoglobina puede manipularse y la presencia de antioxidantes endógenos puede reducir el potencial prooxidante de la hemoglobina. Por lo tanto la PHP, en virtud de la presencia de antioxidantes eritrocíticos endógenos, puede funcionar como hemoglobina exenta de célula con el potencial antioxidante del eritrocito intacto, 65

evitando o reduciendo por tanto el potencial prooxidante de la hemoglobina.

Surge un grave problema asociado a los sustitutos de la sangre basados en hemoglobina derivada de animal o ser humano por la posibilidad de contaminantes víricos en la disolución de hemoglobina modificada. La eliminación e inactivación de vírica se efectúa comúnmente usando cromatografía o inactivación térmica. Sin 5 embargo, el tratamiento de las disoluciones de hemoglobina usando estos procedimientos retira o anula la actividad beneficiosa de los antioxidantes asociados a la molécula de hemoglobina.

Por ejemplo, los procedimientos anteriores para la síntesis de un producto de hemoglobina modificada químicamente empleaban medios de filtración que evitaban el paso de partículas víricas, pero también evitaban el 10 paso de enzimas antioxidantes endógenas. Se proporcionan procedimientos alternativos en la patente de EE.UU. nº 5.741.894, que da a conocer un procedimiento para la preparación de una hemoglobina de pureza farmacéutica. La patente de EE.UU. nº 5.464.814 da a conocer un proceso para preparar una hemoglobina piridoxilada polimerizada reticulada exenta de estroma y exenta de tetrámero. Ambos procedimientos emplean una etapa de filtración que permite el paso de hemoglobina, enzimas antioxidantes endógenas y partículas víricas. Las partículas víricas se 15 inactivan posteriormente en una etapa de tratamiento térmico que anula la actividad tanto de partículas víricas como de enzimas antioxidantes. En otros procedimientos, las partículas víricas se retiran junto con las enzimas antioxidantes por cromatografía. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.264.565 y 5.988.361.

Como alternativa, la patente de EE.UU. nº 5.194.590 da a conocer un procedimiento de preparación de 20 una hemoglobina humana que comprende la lisis de eritrocitos y la retirada del estroma de eritrocitos por un proceso de filtración microporosa que permite que la hemoglobina y los contenidos enzimáticos de los eritrocitos pasen a través del filtro usando un filtro de 0, 1 μm. Después de la modificación química, se efectúa un proceso de purificación en tres etapas que retira los tetrámeros no modificados y reduce también la contaminación vírica. La etapa de cromatografía adicional es esencial para retirar los contaminantes víricos de la disolución de hemoglobina, 25 que pasaban a través del filtro de 0, 1 μm.

Debido a que las enzimas antioxidantes proporcionan propiedades ventajosas a la hemoglobina modificada, son necesarios procedimientos para preparar hemoglobina purificada que esté exenta de virus pero siga reteniendo actividad antioxidante. 30

S. Matsumara y col. (1992, Biomat. Artif. Cells Immobilization Biotechnol., vol. 20, páginas 435-438) describe la producción a gran escala y caracterización de hemoglobina piridoxalada con polioxietileno liofilizada PHP.

35

T. L. Talarico y col. (1999, Biopharmacology, vol. 12, páginas 42-47) describe análisis de comparabilidad para apoyar que un cambio... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de una disolución de hemoglobina modificada químicamente que comprende:

5

(a) . poner en contacto una disolución de hemoglobina exenta de estroma con al menos un medio de filtración que comprende un filtro de corte de peso molecular 500.000, reteniendo dicho medio de filtración las partículas víricas y permitiendo el paso de un filtrado que comprende un polipéptido de hemoglobina y una enzima antioxidante endógena, y estando el filtrado sustancialmente exento de contaminación vírica;

10

(b) . modificar químicamente el filtrado de la etapa (a) con un agente; y

(c) . aislar la disolución de hemoglobina modificada químicamente y enzima antioxidante endógena, reteniendo al menos una de las enzimas antioxidantes endógenas la actividad enzimática.

15

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos una de las enzimas antioxidantes endógenas que retienen actividad enzimática se selecciona del grupo consistente en superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho medio de filtración permite el paso de al menos 20 un 50 % de las enzimas antioxidantes endógenas.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio de filtración comprende un filtro de corte de peso molecular 500.000 de AG Technology.

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5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho medio de filtración reduce el paso de partículas víricas que son de entre aproximadament.

20. 25 nm de tamaño.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho medio de filtración reduce el paso de partículas víricas que son d.

8. 100 nm de tamaño. 30

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho medio de filtración reduce el paso de partículas víricas que son de entre aproximadament.

8. 50 nm de tamaño.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho medio de filtración reduce el paso de partículas 35 víricas que son de entre aproximadament.

5. 25 nm de tamaño.

9. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho medio de filtración reduce el paso de dichas partículas víricas de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 unidades logarítmicas.

40

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho medio de filtración produce un filtrado que tiene una reducción de la carga vírica de al menos 3 unidades logarítmicas.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el agente es un agente modificador bifuncional.

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12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho agente se selecciona del grupo consistente en cloruro de sebacilo, glutaraldehído, derivado de diaspirina, polialdehído, polioxietileno, dextrano e inulina.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el agente es un polioxietileno bifuncional.

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14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el agente es una mezcla de un polioxietileno bifuncional y monofuncional.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la disolución de hemoglobina modificada que comprende una enzima antioxidante endógena es PHP. 55

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que modificar químicamente dicho filtrado con un agente comprende desoxigenación y piridoxalación.

17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha disolución de hemoglobina modificada 60 químicamente aislada que comprende una enzima antioxidante endógena comprende un título vírico de hepatitis A de menos de aproximadamente 1 unidad de TCID50/ml.

18. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la disolución de hemoglobina modificada químicamente comprende un aumento de aproximadamente 50 % a aproximadamente 200 % de la actividad 65

antioxidante eritrocitaria endógena por unidad de hemoglobina encontrada en eritrocitos.