Procedimiento para la identificación genética de las especies europeas del género Maja (centollas).

Se ha desarrollado un protocolo para la identificación genética de la centolla europea del Atlántico (Maja brachydactyla) frente a las demás especies del género que se encuentran en el Mediterráneo (M. squinado, M. crispata y M. goltziana). Estas especies constituyen un recurso comercial de gran valor; su identificación es fundamental para posibilitar su trazabilidad y correcto etiquetado y para orientar su gestión y conservación.

El protocolo consiste en amplificar una región de 671 pb del gen 16S del ADN mitocondrial, cuya secuencia nucleotídica es característica de cada una de las 4 especies. En particular, se han identificado 3 enzimas de restricción que digieren el fragmento de 671 pb de forma que la combinación de los patrones de bandas que generan es distintiva y característica de cada una de las especies.

Procedimientos para la identificación genética de las especies europeas del género Maja (centollas) .

Sector de la técnica La centolla es un recurso pesquero muy importante en Europa y, como tal, una exigencia básica de mercado es la autentificación de su origen y su correcto etiquetado. Además, se está explotando de forma intensiva y, de hecho, en el Mediterráneo, la especie más comercializada ya se considera amenazada. Por eso también es fundamental la identificación de estas especies para desarrollar programas de recuperación y repoblación, de modo que se asegure la incorporación correcta de cada especie en su área de distribución geográfica.

Estado de la técnica La centolla es uno de los crustáceos de mayor importancia económica en las costas europeas. Pertenece al género Maja y en esta región se han definido cuatro especies: M. brachydactyla, M. squinado, M. crispata y M. goltziana (Neumann 1998) , si bien el interés comercial se centra en las dos primeras. M. brachydactyla se distribuye en el Atlántico (desde el sur del Mar del Norte hasta Senegal) mientras que M. squinado es endémica del Mediterráneo. M. crispata y M. goltziana fueron descritas inicialmente tanto en el Atlántico (desde el oeste de Portugal hasta el Golfo de Guinea) como en el Mediterráneo, aunque los registros recientes corresponden al Mediterráneo (Carmona-Suárez 2003, Fürböck y Patzner 2005; Soppelsa et al. 2005, Lelli et al. 2007) .

La diferenciación de estas especies es muy complicada, especialmente en el caso de M. brachydactyla y M. squinado; se basa en una serie de caracteres morfológicos como la forma de los primeros gonópodos, la forma de las espinas del caparazón (y su disposición) y varias medidas morfométricas (Neumann 1998) . Sin embargo, estas diferencias no son definitivas, son apreciables sólo por expertos y tienen el inconveniente añadido de que cambian a lo largo de la vida del individuo (no se observan en estado larvario y varían entre juveniles y adultos) . Por este motivo, las centollas pescadas en el Atlántico (M. brachydactyla, según Neumman) son todavía etiquetadas en los mercados como M. squinado.

Desde el punto de vista comercial, las capturas de centolla superaron las 5000 toneladas en el año 2005 (según los últimos datos disponibles de la FAO) ; y, siendo un producto muy apreciado en el mercado, alcanza además precios elevados. Se pesca casi exclusivamente en el litoral Atlántico, mientras que en el Mediterráneo es cada vez más difícil de encontrar. De hecho, en algunas zonas del Mediterráneo, M. squinado se considera una especie amenazada. Por estos motivos, se está desarrollando el cultivo en cautividad, tanto para abastecer a los mercados y paliar la sobreexplotación de las poblaciones naturales como para repoblar y recuperar las áreas más afectadas.

Para resolver los problemas de identificación, hemos llevado a cabo un estudio genético con marcadores de ADN mitocondrial: un fragmento de 710 pb del gen COI y un fragmento de 560 pb del gen 16S (Sotelo et al. 2008) , confirmando el estatus de especie de cada una de las formas propuestas.

En este estudio concluimos además que el fragmento de 16S es un marcador idóneo para la identificación de estas centollas, por ser invariable dentro de especie y variable entre especies. Conociendo la secuencia nucleotídica de estos fragmentos, es posible asignar una muestra de centolla europea de forma inequívoca a una de las cuatro especies. La ventaja de la identificación genética es su validez en cualquier etapa del desarrollo del individuo, desde larva a adulto, y su aplicación sobre una pequeña cantidad de tejido del individuo analizado, por lo que no es necesario disponer del individuo completo.

Aunque la secuenciación del fragmento del 16S es un buen método de identificación, hemos diseñado un protocolo de asignación molecular más rápido y sencillo, pero igualmente eficaz. El principal objetivo es la identificación de M. brachydactyla frente a M. squinado, ya que estas dos especies de centolla son las más parecidas morfológicamente y de mayor interés comercial. Sin embargo, para evitar cualquier posible confusión con las demás especies del Mediterráneo, éstas también se han incluido a la hora de desarrollar la técnica.

Bibliografía Carmona-Suárez CA (2003) Reproductive biology and relative growth in the spider crab Maja crispata (Crustacea: Brachyura: Majidae) . Scientia Marina 67: 75-80.

Fürböck S, Patzner RA (2005) Daily movement patterns of Maja crispata Risso 1827 (Brachyura: Majidae) Acta Adriatica 46: 41-45.

Lelli S, Carpentieri P, Colloca F, Ardizzone GD (2007) The spiny spider crab Maja gotziana (Crustacea: Majidae) in south Lebanese waters. JMBA2 -Biodiversity Records (Published on-line) .

Neumann V (1998) A review of the Maja squinado (Crustacea: Decapoda: Brachyura) species-complex with a key to the eastern Atlantic and Mediterranean species of the genus. Journal of Natural Histor y 32: 1667-1684.

Soppelsa N, Zenetos A, Papathanassiou E (2005) Maja goltziana d'Oliveira, 1888 (Decapada, Brachyura, Majidae) in the southern Tyrrhenian Sea. Crustaceana 78: 121-124.

Sotelo G, Moran P, Posada D (2008) Genetic identification of the northeastern Atlantic spiny spider crab as Maja brachydactyla Balss, 1922. Journal of Crustacean Biology 28: 76-81.

Explicación de la invención El objetivo de la invención es la identificación genética inequívoca de las 4 especies de centolla que se han descrito en las costas europeas. La invención se basa en la amplificación de un fragmento de 671 pb del gen 16S del ADN mitocondrial, para el que ya había cebadores disponibles con anterioridad, y en el estudio de las diferencias en la secuencia entre las 4 especies de centolla. Teniendo en cuenta estas diferencias, se han identificado 3 enzimas de restricción que digieren el fragmento de 671 pb (cada enzima por separado, en una reacción independiente) de modo que el patrón combinado de bandas que generan es característico de cada una de las especies.

Descripción detallada de la invención (forma de realización)

El procedimiento para la identificación genética de las 4 especies europeas del género Maja (centollas) , M. brachydactyla, M. squinado, M. crispata y M. goltziana, consta de las siguientes etapas:

1. Extracción de ADN.

2. Amplificación por PCR de un fragmento de 671 pb del gen mitocondrial 16S.

3. Digestión del fragmento amplificado de 671 pb con 3 endonucleasas de restricción, en reacciones independientes.

4. Electroforesis de los fragmentos que resultan de cada digestión y análisis de los patrones combinados de las 3 enzimas, característicos de cada especie.

1. Extracción de ADN

Para extraer ADN se parte de una muestra de tejido de 0.5 cm3, de músculo preferentemente. Se han descrito muchos protocolos de extracción, pero uno de los más sencillos y rápidos es el que utiliza la resina quelante Chelex [Estoup et al. (1996) Mol Mar Biol Biotech 5: 295-298], Consiste en homogeneizar el tejido en 400 μL de una solución de Chelex 100 (Bio Rad) al 10%. La solución debe mantenerse caliente y en agitación antes de tratar la muestra. Para potenciar la eliminación de proteínas, se añaden 30 μL de proteasa 20 mg/mL (Pronase, Roche) al homogeneizado.Éste se incuba primero a 60º C durante 1 hora (en un baño de agua, con agitación) y después a 99º C durante 15 minutos (en una estufa) . Para que precipiten los restos de tejido, junto con la resina, y el ADN quede en el sobrenadante, se aplica una centrifugación final de 1 minuto.

Si la cantidad de muestra es limitante (si se trata de una larva, por ejemplo) , el kit NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel) es más adecuado porque permite recuperar más ADN y de mejor calidad. En este caso, se siguen las instrucciones del fabricante.

Para comprobar la efectividad de la extracción, una alícuota de 4 μL se somete a electroforesis en un gel de agarosa (Agarose D-1 low EEO-QDT, Pronadisa) al 1% en tampón TBE 1×. El gel lleva incorporado bromuro de etidio, de modo que el ADN se hace visible bajo luz ultravioleta (Figura 1) .

2. Amplificación de un fragmento de 671 pb del gen 16S

Para amplificar por PCR este fragmento se utilizan los cebadores 16L29 y 16HLeu (SEQ ID NO 1 y 2, respectivamente) , que ya habían sido descritos para otros crustáceos decápodos (en el laboratorio de Christoph Schubart) . Hay que indicar que el extremo 3' del fragmento corresponde... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la identificación genética de las especies de centolla descritas en Europa: en el Atlántico, Maja brachydactyla, y en el Mediterráneo, M. squinado, M. crispata y M. goltziana, caracterizado por consistir en:

a. Obtener una muestra para evaluar.

b. Extraer el ADN de la muestra.

c. Amplificar por PCR un fragmento de 671 pb del ADN mitocondrial con los cebadores 16L29 y 16HLeu (SEQ ID NO1y2, respectivamente) y comprobar la correcta amplificación.

d. Digerir el fragmento amplificado de 671 pb con enzimas que reconozcan como secuencias diana: GTGCAG (N) 14

↑NN↓, TCN↓GAyTTA↓TAA.

e. Analizar los productos de digestión y compararlos con los patrones combinados de restricción característicos de cada una de las 4 especies, de modo que:

- con la enzima que reconoce la secuencia GTGCAG (N) 14↑NN↓, 2 fragmentos de 516 y 155 pb son indicativos de M. brachydactyla (perfil A) , y el fragmento sin cortar de 671 pb es indicativo de M. squinado, M. crispata o

M. goltziana (perfil B) . -con la enzima que reconoce la secuencia TCN↓GA, 3 fragmentos de 467, 117 y 87 pb son indicativos de M. squinado (perfil A) , y 2 fragmentos de 554 y 117 pb son indicativos de M. brachydactyla, M. crispata o M. goltziana (perfil B) . -con la enzima que reconoce la secuencia TTA↓TAA, 3 fragmentos de 426, 171 y 74 pb son indicativos de M. brachydactyla (perfil A) , 2 fragmentos de 426 y 245 pb son indicativos de M. squinado o M. crispata (perfil B) , y 4 fragmentos de 395, 171, 74 y 31 pb son indicativos de M. goltziana (perfil C) .

Y, por tanto: -el patrón combinado ABA corresponde a M. brachydactyla -el patrón combinado BAB corresponde a M. squinado -el patrón combinado BBB corresponde a M. crispata -el patrón combinado BBC corresponde a M. goltziana.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la muestra a evaluar procede de una centolla en cualquier etapa de desarrollo capturada en las costas europeas, del Atlántico o del Mediterráneo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la enzima que reconoce como diana de corte la secuencia GTGCAG (N) 14↑NN↓ es BsgI, la enzima que reconoce como diana de corte la secuencia TCN↓GA es Hpy188I y la enzima que reconoce como diana de corte la secuencia TTA↓TAA es PsiI.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que el análisis de los productos de la digestión enzimática se realiza mediante electroforesis en geles de agarosa y posterior visualización bajo luz ultravioleta por tinción con bromuro de etidio.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidad de Vigo <120> Identificación genética de las especies europeas del género Maja (centollas)

<130>

<160> 8

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence <220>

<223> Forward primer designed at Christoph Schubart's lab to amplify a fragment of the 16S gene in several decapod crustaceans <400> 1 ygcctgttta tcaaaaacat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence <220>

<223> Reverse primer designed at Christoph Schubart's lab to amplify a fragment of the 16S gene in several decapod crustaceans; located in the 5' extreme of the tRNALeu gene <400> 2 catattatct gccaaaatag 20

<210> 3

<211> 671

<212> DNA

<213> Maja brachydactyla <400> 3

<210> 4

<211> 671

<212> DNA

<213> Maja squinado <400> 4

<210> 5

<211> 671

<212> DNA

<213> Maja crispata <400> 5

<210> 6

<211> 671

<212> DNA

<213> Maja goltziana <400> 6

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 201000362

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 18.03.2010

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12Q1/68 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

7. 81, ISSN: 0278-0372, todo el documento, en particular, Materiales y Métodos: 'DNA sequencing'; Resultados: 'Genetic differentiation for 16S'. 1-4 A SOTELO, G. et al., 'Identification and characterization of microsatellite loci in the spiny spider crab Maja brachydactyla', CONSERVATION GENETICS, 2007, Vol. 8, No. 1, página.

24. 247, ISSN: 1566-0621, todo el documento. 1-4 A SCHUBART, C. D. et al., 'Molecular phylogeny of the crab genus Brachynotus (Brachyura: Varunidae) based on 16S rRNA gene', HYDROBIOLOGIA, 2001, Vol. 449, página.

4. 46, ISSN 0018-8158, todo el documento. 1-4 A WO 2007011367 A2 (MONTAGNIER, LUC et al.) 25.01.2007, todo el documento. 1-4 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 28.06.2011 Examinador J. Vizán Arroyo Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201000362

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12Q Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, BIOSIS, MEDLINE, EBI

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201000362

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 28.06.2011

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201000362

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

7. 81. 2008 D02 SOTELO, G. et al., Conserva. Geneti., (2007) , 8 (1) .

24. 247. 2007 D03 SCHUBART, C. D. et al., Hydrobiologia, (2001) , 449.

4. 46. 2001 D04 WO 2007011367 A2 (MONTAGNIER, LUC et al.) 25.01.2007

En D1 se describe un procedimiento de diferenciación genética de las especies Maja brachydactyla, Maja squinado y Maja crispata.

En D2 se identifican y caracterizan diferentes loci microsatélites en Maja brachydactyla.

En D3 y D4 se describen procedimientos de identificación de microorganismos basado en una reacción PCR anidada.

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración 1. NOVEDAD (Art. 4.1. y Art. 6.1. de la Ley de Patentes) .

1.1. La presente invención satisface el criterio establecido en el Art. 4.1. de la Ley de Patentes porque el objeto de la invención, definido en las reivindicaciones 1-4, es nuevo de acuerdo con el Art. 6.1. de la Ley de Patentes.

2. ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 4.1. y Art. 8.1. de la Ley de Patentes) .

2.1. Reivindicación independiente 1.

2.1.1. El documento D1 constituye el estado de la técnica más próximo. En él se describe un procedimiento para diferenciar entre sí las especies Maja brachydactyla, Maja squinado y Maja crispata, basado en el análisis de un fragmento de 518pb del correspondiente gen mitocondrial 16S. La comparación de las respectivas secuencias reveló la presencia de un nucleótido Guanina (G) extra en la posición 246 en el fragmento obtenido de M. brachydactyla frente a los obtenidos de M. squinado y M. crispata (cf. D1: Resultados: 'Genetic Differentiation for 16S'; Discusión) .

2.1.2. El problema técnico a resolver por el objeto de la reivindicación independiente 1 puede ser considerado, por consiguiente, como la provisión de un nuevo procedimiento de identificación de las especies Maja brachydactyla, Maja squinado, Maja crispata y Maja goltziana.

2.1.3. La solución propuesta es el procedimiento de la reivindicación 1 que comprende la amplificación de un fragmento de 671 pb del correspondiente gen 16S y su digestión con enzimas de restricción que reconozcan las secuencias diana: GTGCAG (N) 14ºNNº, TCNºGA y TTAºTAA. La identificación de cada una de las diferentes especies se basa en el patrón de fragmentos de restricción obtenido tras la digestión. En el estado de la técnica más próximo, constituido por los documentos D1-D4, no se ha divulgado ningún procedimiento de identificación de las especies indicadas que comparta las mismas características técnicas del procedimiento de la invención. Además, dicho procedimiento no se deduce de una manera obvia mediante la combinación de métodos descritos previamente. Por consiguiente, el objeto de protección de la reivindicación independiente 1 y el de las dependientes 2-4 se considera inventivo.

2.2. La presente invención satisface el criterio establecido en el Art. 4.1. de la Ley de Patentes porque el objeto de la invención, definido en las reivindicaciones 1-4, implica actividad inventiva de acuerdo con el Art. 8.1. de la Ley de Patente.

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