Polipéptidos.

Polipéptido de unión a albúmina, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de

i) LAX3AKEAANA ELDX14YGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP

en donde

, independientemente uno de otro

X3 se selecciona de E y S; y

X14 se selecciona de A, S, C y K;

y

ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad a la secuencia definida en i).

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/061623.

Solicitante: AFFIBODY AB.

Nacionalidad solicitante: Suecia.

Dirección: Gunnar Asplunds Allé 24 171 63 Solna SUECIA.

Inventor/es: ABRAHMSEN, LARS, EKBLAD,CAROLINE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/195 (de origen bacteriano)

PDF original: ES-2540114_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Polipéptidos Campo técnico

La presente descripción se refiere a una clase de polipéptidos diseñados que tienen una afinidad de unión por la albúmina. También se refiere a nuevos métodos y usos que explotan la unión de estos y otros compuestos a la albúmina en diferentes contextos, algunos de los cuales tienen significación para el tratamiento de enfermedades en mamíferos, Incluyendo seres humanos.

Antecedentes

Albúmina de suero

La albúmina de suero es la proteína más abundante en los sueros de los mamíferos (4 g/l; aproximadamente ,7 mM en los seres humanos), y una de sus funciones es unirse a moléculas tales como lípidos y bilirrubina (Peters, Advances ¡n Proteln Chemlstry 37:161, 1985). La albúmina de suero está desprovista de ninguna función enzimática o ¡nmunológlca. Además, la albúmina de suero humano (HSA) es un portador natural implicado en el transporte endógeno y entrega de numerosas moléculas naturales, así como terapéuticas (Sellers y Koch-Weser, Albumin Structure, Functlon and Uses, eds Rosenoer et al, Pergamon, Oxford, p 159, 1977). La semivida de la albúmina de suero es directamente proporcional al tamaño del animal, donde por ejemplo la albúmina de suero humano tiene una semivida de 19 días y la albúmina de suero de conejo tiene una semivida de aproximadamente 5 días (McCurdy et al, J Lab Clin Med 143:115, 24). La HSA está ampliamente distribuida en todo el cuerpo, en particular en los compartimentos Intersticial y sanguíneo, donde está implicada principalmente en el mantenimiento de la osmolarldad. Estructuralmente, las albúminas son proteínas de cadena única que comprenden tres dominios homólogos y en total 584 o 585 aminoácidos (Dugaiczyk et al, Proc Nati Acad Sci USA 79:71, 1982). Las albúminas contienen 17 puentes disulfuro y un único tiol reactivo, cisteína en la posición 34, pero carecen de restos de carbohidratos enlazados a N y enlazados a O (Peters, 1985, arriba; Nicholson et al, Br J Anaesth 85:599, 2).

La fusión o asociación con HSA da como resultado un aumento de la semivida in vivo de las proteínas

Se han reportado vahas estrategias para acoplar covalentemente proteínas directamente a albúminas de suero o bien a un péptido o proteína que permitirá la asociación in vivo a albúminas de suero. Se han descrito ejemplos de esta última estrategia, p.ej. en la solicitud de patente internacional WO91/1743, en la solicitud de patente internacional WO1/45746 y en Dennls et al (J Biol Chem 277:3535-43, 22). El primer documento describe, entre otros, el uso de péptidos de unión a albúmina o proteínas derivadas de proteína G estreptocócica (SpG) para aumentar la semivida de otras proteínas. La idea es fusionar el péptido/proteína que se une a albúmina, derivado bacterianamente, a un péptido/proteína terapéuticamente interesante, del que se ha mostrado que tiene una eliminación rápida de la sangre. La proteína de fusión así generada se une a la albúmina de suero in vivo, y se beneficia de su semivida más larga, lo que aumenta la semivida neta del péptido/Sproteína terapéuticamente interesante fusionada. La solicitud de patente internacional WO1/45746 y Dennis et al se refieren al mismo concepto, pero aquí, los autores utilizan péptidos relativamente cortos para unirse a la albúmina de suero. Los péptidos fueron seleccionados de una biblioteca de péptidos de expresión en fagos. En Dennis et al, se menciona un trabajo anterior en el que se encontró la mejora de una respuesta inmunológica a una fusión recombinante del dominio de unión a la albúmina de la proteína G estreptocócica al receptor del complemento humano de Tipo 1. La solicitud de patente de EE.UU. publicada como US24/1827 (Dennis) describe también el uso de constructos que comprenden ligandos peptídicos, identificados de nuevo por tecnología de expresión en fagos, que se unen a la albúmina de suero y que se conjugan a compuestos bioactivos para el acceso a tumores.

Dominios de unión a albúmina de proteínas receptoras bacterianas

La proteína G estreptocócica (SpG) es un receptor bifuncional presente en la superficie de ciertas cepas de estreptococos, y es capaz de unirse tanto a IgG como a albúmina de suero (Bjórck et al, Mol Immunol 24:1113, 1987). La estructura es altamente repetitiva, con varios dominios estructuralmente y funcionalmente diferentes (Guss et al, EMBO J 5:1567, 1986), más concretamente tres dominios que se unen a Ig y tres dominios que se unen a albúmina de suero (Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987). La estructura de uno de los tres dominios que se unen a albúmina de suero en la SpG ha sido determinada, mostrando un paquete plegado de tres hélices (Kraulls et al, FEBS Lett 378:19, 1996, Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-2, 22). Un motivo de 46 aminoácidos se definió como ABD (dominio de unión a albúmina), y también se ha designado posteriormente como G148-GA3 (GA por unión a albúmina relacionada con proteína G). En, por ejemplo, la solicitud de patente internacional W9/1643, se describen vahantes de unión a albúmina del motivo de 46 aminoácidos ABD.

Se han identificado también otros dominios de unión a albúmina bacterianos además de los de la proteína G, algunos de los cuales son estructuralmente similares a los de la proteína G. Son ejemplos de proteínas que contienen tales dominios de unión a albúmina las proteínas PAB, PPL, MAG y ZAG (Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 26). Se han llevado a cabo estudios de estructura y función de tales dominios de unión a albúmina, y son reportados p.ej. por Johansson y colaboradores (Johansson et al, J Mol Biol 266:859-865, 1997). Además,

Rozak et al han informado sobre la creación de variantes artificiales de G148-GA3, que fueron seleccionados y estudiados con respecto a especificidad y estabilidad a diferentes especies (Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 26), mientras que Jonsson et al desarrollaron variantes artificiales de G148-GA3 que tienen una afinidad muy mejorada por la albúmina de suero humano (Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 28). Para algunas de las variantes se consiguió una afinidad más alta a costa de una estabilidad térmica reducida.

Además de las proteínas que contienen tres hélices descritas anteriormente, hay también otras proteínas bacterianas no relacionadas que se unen a la albúmina.

ABD e Inmunización

Recientemente, se Identificaron experimentalmente algunos epítopos de linfocitos T y B dentro de la reglón de unión a albúmina de la proteína G estreptococia de la cepa 148 (G148) (Goetsch et al, Clin Dlagn Lab Immunol 1:125- 32, 23). Los autores responsables del estudio estaban Interesados en utilizar los epítopos de células T de G148 en vacunas, es decir, utilizar la propiedad inmunoestimulatoria inherente de la reglón de unión a albúmina. Goetsch ef al encontraron adlclonalmente un epítopo de células B, es decir, una reglón unida por anticuerpos después de la Inmunización, en la secuencia de G148.

En las composiciones farmacéuticas para administración a seres humanos no se desea respuesta inmune. Por lo tanto, el dominio de unión a albúmina G148 es inadecuado como tal para el uso en tales composiciones, debido a sus propiedades ¡nmunoestlmulatorias mencionadas anteriormente.

Descripción

Los anteriores inconvenientes y deficiencias de la técnica anterior son vencidos o aliviados por, en un primer aspecto, un polipéptido de unión a albúmina, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de

i) LAXsAKEAANA ELDX14YGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP en donde, independientemente uno de otro

X3 se selecciona de E y S; y X14 se selecciona de A, S, C y K;

y

ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad a... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Polipéptido de unión a albúmina, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de i) LAX3AKEAANA ELDX14YGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP

en donde, independientemente uno de otro X3 se selecciona de E y S; y X14 se selecciona de A, S, C y K;

y

¡I) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad a la secuencia definida en i).

2. Polipéptido de unión a albúmina según la reivindicación 1, que se une a albúmina de tal modo que el valor kff de la interacción es como máximo 5x 1 ® s"1, por ejemplo como máximo 5x 1'6 s'1.

3. Polipéptido de unión a albúmina según la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de una

cualquiera de SEQ ID NO: 1-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-62, SEQ

ID NO:64-65, SEQ ID NO:67-68, SEQ ID NO:7-71, SEQ ID NO:73-74, SEQ ID NO:76-77, SEQ ID NO:79-8, SEQ

ID NO:82-83, SEQ ID NO:85-86, SEQ ID NO:88-89, SEQ ID NO:91-92, SEQ ID NO:94-95, SEQ ID NO:97, SEQ ID

NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:17, SEQ ID N:19-11, SEQ ID NO:112-116, SEQ ID NO:118-122, SEQ ID NO:124-128, SEQ ID NO:13-13 SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:164-167, SEQ ID NO:169-174, SEQ ID NO:176-181, SEQ ID NO:183-188, SEQ ID NO:19-195 and SEQ ID NO:197-23, por ejemplo seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 1-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-62, SEQ ID NO:64-65, SEQ ID NO:67-68, SEQ ID NO:7-71, SEQ ID NO:73-74, SEQ ID NO:76-77, SEQ

ID NO:79-8, SEQ ID NO:82-83, SEQ ID NO:85-86, SEQ ID NO:88-89, SEQ ID NO:91-92, SEQ ID NO:94-95, SEQ

ID NO:97, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 19-11 SEQ ID NO:112-116, SEQ ID NO:118-122, SEQ ID NO:124-128, SEQ ID NO:13-133, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139y SEQ ID NO:143.

4. Polipéptido de unión a albúmina según la reivindicación 3, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de una cualquiera de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:49y SEQ ID NO:55.

5. Polipéptido de unión a albúmina según cualquier reivindicación precedente, que se une a albúmina de suero

humano.

6. Proteína de fusión o conjugado, que comprende

i) un primer resto que consiste en un polipéptido de unión a albúmina según cualquier reivindicación precedente; y

ii) un segundo resto que consiste en un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada.

7. Polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado según cualquier reivindicación precedente, que comprende además una etiqueta.

8. Polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a albúmina o una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Método para producir un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende expresar un polinucleótido según la reivindicación 8.

1. Método para producir un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 por síntesis peptídica no biológica usando aminoácidos y/o derivados de aminoácidos que tienen cadenas laterales reactivas protegidas, comprendiendo la síntesis peptídica no biológica

acoplamiento por etapas de los aminoácidos y/o los derivados de aminoácidos para formar un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que tiene cadenas laterales reactivas protegidas,

retirada de los grupos protectores de las cadenas laterales reactivas del polipéptido, y

plegado del polipéptido en disolución acuosa.

11. Proteína de fusión o conjugado según la reivindicación 6, para uso como medicamento.

12. Proteína de fusión o conjugado según la reivindicación 6, para uso en diagnosis.

13. Composición, que comprende

un compuesto que per se tiene una solubilidad en agua de no más que 1 pg/ml; acoplado a

un polipéptido de unión a albúmina, una proteína de fusión o conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el compuesto y el polipéptido de unión a albúmina, una proteína de fusión o conjugado están acoplados covalentemente.

14. Método de preparación de una composición según la reivindicación 13, que comprende

a) proporcionar un compuesto que per se tiene una solubilidad en agua de no más que 1 pg/ml; y

b) acoplar covalentemente el compuesto a un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, formando así una composición que comprende un complejo covalente de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado.

15. Método para aumentar la solubilidad acuosa de un compuesto, que comprende

proporcionar un compuesto que per se tiene una solubilidad en agua de no más que 1 pg/ml;

acoplar covalentemente el compuesto a un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, formando así un complejo covalente de compuesto y polipéptido de unión a albúmina; y

mezclar dicho complejo de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado con albúmina bajo condiciones que promuevan la asociación no covalente del polipéptido de unión a albúmina con albúmina de suero humano;

por lo que la solubilidad en agua del compuesto en dicho complejo es mayor que la solubilidad en agua del compuesto per se.