Un polipéptido del Factor VIIa que comprende un dominio GLA modificado que aumenta la afinidad de unión a la membrana de dicho polipéptido con respecto al correspondiente polipéptido del Factor VIIa nativo,

comprendiendo dicho dominio GLA modificado: a) una sustitución de aminoácido en la posición 11, b) una sustitución de aminoácido en la posición 29, c) una sustitución de aminoácido en la posición 33, y d) una sustitución de aminoácido en la posición 34; donde las posiciones de los aminoácidos del polipéptido del Factor VIIa se numeran de acuerdo con el Factor IX

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las proteínas dependientes de vitamina K contienen de 9 a 13 restos ácido gamma-carboxiglutámico (Gla) en sus 45 restos amino terminales. Los restos Gla son producidos por enzimas en el hígado que utilizan vitamina K para carboxilar las cadenas laterales de los restos ácido glutámico en los precursores de proteínas. Las proteínas dependientes de vitamina K están implicadas en numerosos procedimientos biológicos, de los cuales el mejor descrito es la coagulación de la sangre (revisado por Furie, B. y Furie, B.C. 1988, Cell, 53:505-518). Las proteínas dependientes de vitamina K incluyen la proteína Z, la proteína S, la protrombina, el factor X, el factor IX, la proteína C, el factor VII y Gas6. La última proteína funciona en la regulación del crecimiento celular. Matsubara et al., 1996, Dev. Biol., 180-499-510. Los restos Gla son necesarios para la apropiada unión del calcio y la interacción con la membrana por medio de estas proteínas. Se piensa que el sitio de contacto con la membrana del factor X reside en los restos aminoácido 1-37. Evans y Nelsestuen, 1996, Protein Sci., 5: supl. 1, 163 Abs. Aunque las regiones que contienen Gla de las proteínas del plasma muestran un alto grado de homología de secuencia, tienen al menos un orden de afinidad por la membrana de 1.000 veces. McDonald et al., 1997, Biochemistry, 36:5120-5137.

El factor VII funciona en la fase inicial de coagulación de la sangre y puede ser un elemento clave en la formación de coágulos sanguíneos. El precursor inactivo, o zimógeno, tiene una baja actividad enzimática que aumenta enormemente por la escisión proteolítica en el enlace R152I153 para formar el factor VIIa. Esta activación puede ser catalizada por el factor Xa así como por el factor tisular VIIa, una proteína integrante de la membrana encontrada en numerosos tipos celulares. Fiore, M.M. et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:143-149. La activación por el factor tisular VIIa es referida como autoactivación. Está implicada tanto en la activación (formación del factor VIIa a partir del factor VII) como en la subsiguiente actividad del factor VIIa. La ruta más importante para la activación in vivo no es conocida. El factor VIIa puede activar los factores de coagulación sanguínea IX y X.

El factor tisular es expresado a niveles elevados en la superficie de algunas células tumorales. Es posible un papel para el factor tisular, y para el factor VIIa, en el desarrollo de tumores y la invasión de tejidos. Vrana, J.A. et al., Cancer Res., 56:5063-5070. La expresión celular y la acción del factor tisular también es un factor principal en la respuesta tóxica al choque endotóxico. Dackiw, A.A. et al., 1996, Arch. Surg., 131:1273-1278.

La proteína C es activada por la trombina en presencia de trombomodulina, una proteína integrante de la membrana de las células endoteliales. Esmon, N.L. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257:859-864. La proteína C activada (APC) degrada los factores Va y VIIIa en combinación con su cofactor, la proteína S. La resistencia a la APC es la forma más común de la enfermedad trombótica heredada. Dahlback, B., 1995, Blood, 85:607-614. Los inhibidores de vitamina K son administrados comúnmente como profilaxis para enfermedades trombóticas.

Las proteínas dependientes de vitamina K se utilizan para tratar ciertos tipos de hemofilia. La hemofilia A se caracteriza por la ausencia de factor VIII activo, factor VIIIa, o la presencia de inhibidores del factor VIII. La hemofilia B se caracteriza por la ausencia de factor IX activo, factor IXa. La deficiencia de factor VII, aunque rara, responde bien a la administración de factor VII. Bauer, K.A., 1996, Haemostasis, 26:155-158, supl. 1. La terapia de sustitución del factor VIII es limitada debido al desarrollo de un elevado título de anticuerpos del factor VIII inhibidores en algunos pacientes. Alternativamente, se puede utilizar el factor VIIa en el tratamiento de la hemofilia A y B. El factor IXa y el factor VIIIa activan el factor X. El factor VIIa elimina la necesidad de factores IX y VIII activando directamente el factor X, y puede superar los problemas de las deficiencias de factor IX y VIII con escasas consecuencias inmunológicas. Hedner et al., 1993, Transfus. Medi. Rev., 7:78-83; Nicolaisen, E.M., et al., 1996, Thromb. Haemost., 76:200-204. Los niveles eficaces de administración de factor VIIa son a menudo elevados (45 a 90 µg/kg de peso corporal) y puede ser necesario repetir la administración cada pocas horas. Shulmav, S. et al., 1996, Thromb. Haemost., 75:432-436.

Se ha encontrado que una forma soluble de factor tisular (factor tisular soluble o sTF) que no contiene la región de contacto con la membrana es eficaz en el tratamiento de la hemofilia cuando se administra simultáneamente con el factor VIIa. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.504.064. En perros, se demostró que el sTF reducía la cantidad de factor VIIa necesaria para tratar la hemofilia. La asociación con la membrana de sTF-VIIa es completamente dependiente del sitio de contacto con la membrana del factor VII. Esto contrasta con el complejo de tejido normal-factor VIIa, que se une a la membrana a través tanto del factor tisular como de VII (a).

Shah et al., 1998 (Proc. Natl. Acad. Sci, 95:4229-4234) describen la manipulación del sitio de unión a la membrana de las proteínas dependientes de vitamina K y concretamente la función biológica mejorada del factor Q10E32 mutante del factor VII humano (que es el mismo que el mutante VIIQ11E33 descrito en la presente solicitud).

McDonald et al., 1997 (Biochemistry, 36(17):5120-5127) comparan las proteínas dependientes de vitamina K de origen natural y las correlacionan con sus propiedades de unión a la membrana e identifican que el Factor VII, que contiene sustituciones en ambas posiciones 1 y 33, presenta la afinidad de membrana más baja.

En el documento WO 88/10295 se describe el factor VII/VIIa modificado, que está estabilizado frente a la escisión proteolítica remplazando ciertos restos Arg y Lys. Entre otros la K33 del factor VII/VIIa es remplazada por Gln, Glu, His, Gly, Thr, Ala o Ser.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Se ha descubierto que las modificaciones en el dominio de ácido gamma-carboxiglutámico (GLA) de los polipéptidos dependientes de vitamina K potencian sus afinidades de unión a la membrana. Los polipéptidos dependientes de vitamina K modificados de esta manera tienen un aumento de actividad y se pueden utilizar como anti-coagulantes, pro-coagulantes, o para otras funciones que utilizan proteínas dependientes de vitamina K. Por ejemplo, una molécula de factor VII mejorada puede proporcionar numerosos beneficios disminuyendo la dosificación de VIIa necesaria, reduciendo la frecuencia relativa de administración y/o proporcionando cambios cualitativos que permitan un tratamiento más eficaz de los estados de deficiencia.

La invención se expone en las reivindicaciones.

La invención ofrece polipéptidos dependientes de vitamina K que incluyen un dominio GLA modificado que intensifica la afinidad de unión a la membrana del polipéptido con respecto al correspondiente polipéptido dependiente de vitamina K nativo. La actividad del polipéptido dependiente de vitamina K también resulta intensificada. El dominio GLA modificado comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 11, 29, 33 y

34. El dominio puede incluir otras sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos puede estar en los aminoácidos 2, 5, 9, 12, 35, o 36, y sus combinaciones. El dominio GLA modificado puede incluir una secuencia de aminoácidos, que, en el estado saturado de calcio, forma una estructura terciaria que tiene un núcleo catiónico con un halo de carga electronegativa. Los polipéptidos dependientes de vitamina K pueden ser utilizados para tratar trastornos de la coagulación y pueden incrementar la formación de coágulos.

El dominio GLA modificado del factor VIIa, y factor VIIa con el sitio activo modificado pueden contener una sustitución en los aminoácidos 11, 29, 33, 34, o 35, y sus combinaciones. Por ejemplo, se puede sustituir un resto glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico, o asparagina en el aminoácido 11, se puede sustituir un resto ácido glutámico o fenilalanina en el aminoácido 29, o se puede sustituir un resto ácido glutámico en el aminoácido 33, y sus combinaciones. La sustitución de un resto glutamina en el aminoácido 11 es particularmente útil. En una realización, se sustituye un resto glutamina en el aminoácido... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido del Factor VIIa que comprende un dominio GLA modificado que aumenta la afinidad de unión a la membrana de dicho polipéptido con respecto al correspondiente polipéptido del Factor VIIa nativo, comprendiendo dicho dominio GLA modificado:

a) una sustitución de aminoácido en la posición 11, b) una sustitución de aminoácido en la posición 29, c) una sustitución de aminoácido en la posición 33, y d) una sustitución de aminoácido en la posición 34;

donde las posiciones de los aminoácidos del polipéptido del Factor VIIa se numeran de acuerdo con el Factor IX.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho dominio GLA modificado comprende adicionalmente un resto tirosina es insertado en el aminoácido 4.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dicho dominio GLA modificado comprende adicionalmente la sustitución de un resto aminoácido hidrófobo o un resto ácido glutámico en el aminoácido 35.

4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3, donde el resto aminoácido hidrófobo es un resto fenilalanina, leucina o isoleucina.

5. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde un resto glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico, o asparagina es sustituido en el aminoácido 11.

6. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde un resto ácido glutámico es sustituido en el aminoácido

33.

7. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde el resto aminoácido hidrófobo es sustituido en el aminoácido 34.

8. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7, donde un resto fenilalanina, leucina o isoleucina es sustituido en el aminoácido 34.

9. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde un resto fenilalanina o ácido glutámico es sustituido en el aminoácido 29.

10. Una molécula de ácido nucleico aislada, comprendiendo dicha molécula una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una célula anfitriona de mamífero que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso como medicamento.

15. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para la fabricación de un medicamento pro-coagulante para el tratamiento de los trastornos de la coagulación.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicho trastorno de la coagulación es la hemofilia A, la hemofilia B o una enfermedad del hígado.