UNA NUEVA PROTEINA, UN GEN QUE LA CODIFICA Y UN METODO DE USO DE LA MISMA.
Una proteína antifúngica que puede obtenerse a partir de fracción(es) precipitadas mediante el método de precipitación con sulfato de amonio usando un extracto acuoso de Pleurotus cornucopiae,
donde dicha proteína tiene una actividad antifúngica contra al menos el hongo del añublo del arroz, y muestra existencia de un componente que tiene un peso molecular de aproximadamente 15 kDa mediante el método de SDS-PAGE, en la que el extremo N de la proteína tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº 9:
en la que Xaa se desconoce
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP02/02295.
Solicitante: JAPAN TOBACCO INC..
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: 2-1, TORANOMON 2-CHOME, MINATO-KU,TOKYO 105-8422.
Inventor/es: TAKAKURA,YOSHIMITSU,C/O JAPAN TOBACCO INC PIC.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 21 de Julio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A01N63/04
- C07K14/375 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Basidiomycetes.
Clasificación PCT:
- A01N65/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01N CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES O DE PARTES DE ELLOS (conservación de alimentos o productos alimenticios A23 ); BIOCIDAS, p. ej. EN TANTO QUE SEAN DESINFECTANTES, PESTICIDAS O HERBICIDAS (preparaciones de uso médico, dental o para el aseo que eliminan o previenen el crecimiento o la proliferación de organismos no deseados A61K ); PRODUCTOS QUE ATRAEN O REPELEN A LOS ANIMALES; REGULADORES DEL CRECIMIENTO DE LOS VEGETALES. › Biocidas, productos que repelen o atraen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales que contienen sustancias procedentes de algas, líquenes, musgos, hongos pluricelulares o vegetales, o sus extractos (que contienen compuestos de composición determinada A01N 27/00 - A01N 59/00).
- C07K14/375 C07K 14/00 […] › de Basidiomycetes.
- C12N15/09 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
- C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
- C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
- C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
Clasificación antigua:
- A01H5/00 A01 […] › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- A01N37/46 A01N […] › A01N 37/00 Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen compuestos orgánicos que tienen un átomo de carbono que posee tres enlaces a heteroátomos, con a lo más dos enlaces a un halógeno, p. ej. ácidos carboxílicos (conteniendo ácidos ciclopropanocarboxílicos o sus derivados, p. ej. nítrilos de ácidos ciclopropanocarboxílicos, A01N 53/00). › Derivados N-acilados.
- A01N63/00 A01N […] › Biocidas, productos que repelen o atraen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos, virus, hongos microscópicos, animales, o sustancias producidas por, u obtenidas a partir de microorganismos, virus, hongos microscópicos o animales, p. ej. encimas o productos de fermentación (que contienen compuestos de constitución determinada A01N 27/00 - A01N 59/00; algas unicelulares A01N 65/03).
- A01N65/00 A01N […] › Biocidas, productos que repelen o atraen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales que contienen sustancias procedentes de algas, líquenes, musgos, hongos pluricelulares o vegetales, o sus extractos (que contienen compuestos de composición determinada A01N 27/00 - A01N 59/00).
- C07K14/375 C07K 14/00 […] › de Basidiomycetes.
- C12N1/15 C12N […] › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N1/19 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N15/09 C12N 15/00 […] › Tecnología del ADN recombinante.
- C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
- C12P21/02 C12P 21/00 […] › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Fragmento de la descripción:
Una nueva proteína, un gen que la codifica y un método de uso de la misma.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una nueva proteína que tiene una actividad antifúngica y un método para producirla, un gen que codifica la proteína y un método de uso de la proteína y el gen. Específicamente, la invención se refiere a una proteína originada de Pleurotus cornucopiae que tiene una actividad antifúngica contra al menos el hongo del añublo del arroz (Magnaporthe grisea), un gen que codifica la proteína y un método de uso de la proteína y el gen.
La presente solicitud reivindica prioridad en base a la Solicitud de Patente Japonesa Nº 2001-68894 presentada al 12 de marzo de 2001.
Técnica antecedente
Las enzimas líticas tales como quitinasa y ß-1,3-glucanasa son conocidas como proteínas vegetales que tienen una actividad antifúngica contra microorganismos patógenos de plantas. Los experimentos in vitro han demostrado que estas enzimas pueden ejercer el efecto si se emplean en solitario (Schlumbaum et al. (1986), Nature 324, págs. 365-367), pero generalmente puede obtenerse un efecto mejorado si se usa una combinación de dos o más de dichas enzimas (Mauch et al. (1988), Plant Physiol. 88, págs. 936-942). Se sabe que la concentración de inhibición del crecimiento de estas enzimas líticas contra hongos filamentosos debe ser típicamente de aproximadamente varias decenas a varios cientos de µg/ml cuando se usan en solitario, o de aproximadamente varios µg/ml por enzima cuando se usan en combinación. Sin embargo, no se ha informado de que ninguna de estas enzimas tanga un efecto antifúngico contra el hongo del añublo del arroz (Magnaporthe grisea), que causa un enorme daño a los cultivos de arroz.
Los péptidos antifúngicos (AFP) de bajo peso molecular, tales como defensina, también tienen una actividad antimicrobiana. Entre estos, se ha descrito que Ca-AMP1 (Publicación Doméstica Japonesa Nº 505048/96), CB-1 (Oita et al. (1996), Biosci. Biotech. Biochem. 60, págs. 481-483), Rs-AFP1 y Rs-AFP2 (Terras et al. 1992, J. Biol. Chem. 267, págs. 15301-15309), y Ace-AMP1 (Publicación Doméstica Japonesa Nº 501424/97) tienen un efecto antifúngico contra el hongo del añublo del arroz. Estos péptidos de bajo peso molecular inhiben el 50% del crecimiento de diversos microorganismos patógenos de plantas, incluyendo el mencionado anteriormente, por encima de una concentración del orden de varios µg/ml.
También se han hecho intentos de crear una planta resistente a enfermedades aislando el gen para una enzima lítica o un péptido antifúngico de bajo peso molecular y transfectándolo a una planta (Broglie et al. (1991), Science 254, pags. 1194-1197; Terras et al. (1995), The Plant Cell 7, pags. 573-588). Un estudio reciente describió que el arroz transformante obtenido sobreexpresando quitinasa obtenida de arroz ejercía una mayor resistencia al hongo del añublo del arroz (Nishizawa et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 99: 383-390).
También se han descrito otras plantas resistentes a microorganismos patógenos creadas mediante introducción de genes tales como para la proteína PR (Alexander et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: pags. 7327-7331), glucosa oxidasa (Wu et al. (1995) Plant Cell 7: pags. 1357-1368), estilbeno sintasa (Hain et al. (1993) Nature 361: pags. 153-156), etc.
Sin embargo, muchos casos existentes no consiguen obtener plantas transgénicas que tengan una resistencia aceptable en la práctica. Esto puede atribuirse al bajo nivel de expresión de los transgenes, y más esencialmente a la baja actividad antifúngica de las proteínas antifúngicas descritas hasta la fecha. Por lo tanto, sería deseable identificar y aplicar en la práctica una proteína antifúngica más potente que las convencionales.
Descripción de la invención
Un objeto de la presente invención es buscar e identificar una nueva proteína antifúngica capaz de inhibir el crecimiento de diversos microorganismos patógenos vegetales, incluyendo el hongo del añublo del arroz (Magnaporthe grisea), que causa un enorme daño a los cultivos de arroz.
Otro objeto de la presente invención es clonar un gen que codifica dicha nueva proteína, y determinar la secuencia de nucleótidos del mismo.
Otro objeto más de la presente invención es introducir el gen de la presente invención en un organismo huésped (microorganismo, animal, planta, etc.) para crear un transformante, y de este modo darle un uso práctico al gen de la presente invención.
Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un agente antifúngico que contiene la proteína antifúngica de la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la aparición de la inhibición del crecimiento de M. grisea por la proteína antifúngica de la presente invención (cultivos de 48 horas en presencia de una fracción de proteína calentada a 80ºC durante 10 minutos).
La figura 2 muestra los patrones electroforéticos de fracciones de proteína de Pleurotus cornucopiae separadas por una columna Q-Sepharose FF con respecto a una actividad antifúngica. M representa un marcador de peso molecular, y FT representa la fracción que ha pasado a través de la columna. Los símbolos (-, +, ++) debajo de las pistas indican la potencia de la actividad antifúngica. Las actividades antifúngicas mostradas entre paréntesis pertenecen a fracciones diferentes de las purificadas descritas en la presente invención.
La figura 3 muestra un diagrama de separación de la proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae mediante columna MonoQ con respecto a una actividad antifúngica. Las posiciones de elución que muestran la actividad antifúngica se indican mediante +.
La figura 4 muestra patrones electroforéticos de proteína de Pleurotus cornucopiae separada por una columna Mono Q con respecto a una actividad antifúngica. Los números por encima de las pistas corresponden a los números de fracción de la figura 3, M representa un marcador de peso molecular y Ori representa la fracción de Q-Sepharose aplicada en Mono Q. Los símbolos (-, +, ++, +++) debajo de las pistas indican la potencia de una actividad antifúngica. Las flechas indican la proteína antifúngica (15 kDa).
La figura 5 muestra un diagrama de separación de la proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae mediante Superose 6 con respecto a una actividad antifúngica. Las flechas indican las posiciones de elución del patrón de filtración en gel (BIO-RAD). Las posiciones de las fracciones que muestran la actividad antifúngica se indican mediante +.
La figura 6 muestra patrones electroforéticos de proteína de Pleurotus cornucopiae purificada mediante Superose 6 con respecto a una actividad antifúngica. Los números por encima de las pistas corresponden a los números de fracciones en la figura 5, Ori representa la fracción MonoQ aplicada en Superose 6 y M representa un marcador de peso molecular. Los símbolos (-, +, ++) por debajo de las pistas indican la potencia de una actividad antifúngica. La flecha indica la proteína antifúngica (15 kDa).
La figura 7 muestra un árbol taxonómico molecular de las secuencias de aminoácidos (regiones de proteína maduras) de tamavidina 1 y tamavidina 2, estreptavidina y su homólogo, y avidina.
La figura 8 muestra los resultados de experimentos de supresión de una actividad antifúngica mediante adición de biotina. Esporas de M. grisea suspendidas en 1/2 PD se colocaron en placas de microvaloración. Se prepararon pocillos que contenían 1000 ng/ml de tamavidina 1, estreptavidina y avidina purificadas, o pocillos que contenían 100 ng/ml de biotina además de estas proteínas a las mismas concentraciones, o pocillos que no contenían proteína y se incubaron a 28ºC durante 48 horas. También se muestran pocillos que contienen 50 ng/ml de tamavidina 1 purificada.
La figura 9 muestra la purificación de tamavidina 2 recombinante expresada en E. coli en una columna de iminobiotina. C representa la fracción de proteína soluble total de E. coli, que no se indujo mediante IPTG, y T representa la fracción de proteína soluble total de E. coli inducida mediante IPTG 1 mM. F representa la fracción de proteína que ha pasado a través de la columna de iminobiotina sin unirse a la columna, obtenida de la fracción de proteína soluble total de E. coli inducida...
Reivindicaciones:
1. Una proteína antifúngica que puede obtenerse a partir de fracción(es) precipitadas mediante el método de precipitación con sulfato de amonio usando un extracto acuoso de Pleurotus cornucopiae, donde dicha proteína tiene una actividad antifúngica contra al menos el hongo del añublo del arroz, y muestra existencia de un componente que tiene un peso molecular de aproximadamente 15 kDa mediante el método de SDS-PAGE, en la que el extremo N de la proteína tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº 9:
en la que Xaa se desconoce.
2. Una proteína antifúngica que muestra una actividad antifúngica contra el hongo del añublo del arroz, donde dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, o un aminoácido con el 90% o más homología con dicha secuencia.
3. Las proteínas antifúngicas de acuerdo con la reivindicación 2, que tienen una secuencia de aminoácidos con el 95% o más homología con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.
4. Una proteína antifúngica constituida por un polipéptido, en la que dicho polipéptido se selecciona entre
un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos parcial 8-143 de la SEC ID Nº 2, y
un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con el 90% o más homología con la secuencia de aminoácidos parcial 8-143 de la SEC ID Nº 2
en la que dichos polipéptidos muestran una actividad antifúngica contra el hongo del añublo del arroz.
5. Un método para producir la proteína antifúngica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende:
6. Un gen que codifica la proteína antifúngica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
7. El gen de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho gen tiene una secuencia de bases de las bases 71-502 de la SEC ID Nº 1, o una secuencia de bases que puede hibridar con la secuencia de bases anterior en condiciones rigurosas (NaHPO4 0,5 M (pH 7,2), SDS al 7%, EDTA 1 mM a 65ºC).
8. El gen que codifica una proteína antifúngica que muestra una actividad antifúngica contra el hongo del añublo del arroz, donde dicho gen tiene una secuencia de bases de las bases 71-502 de la SEC ID Nº 1 o una secuencia de bases que puede hibridar con la secuencia de bases anterior en condiciones rigurosas (NaHPO4 0,5 M (pH 7,2), SDS al 7%, EDTA 1 mM a 65ºC).
9. El gen de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que tiene una secuencia de bases con el 90% o más homología con la secuencia de bases de las bases 71-502 de la SEC ID Nº 1.
10. El gen de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que tiene una secuencia de bases con el 95% o más homología con la secuencia de bases de las bases 71-502 de la SEC ID Nº 1.
11. Un oligonucleótido para obtener un gen que codifica una proteína antifúngica de Pleurotus cornucopiae, que tiene una secuencia de nucleótidos descrita en una cualquiera de las SEC ID Nº 10-15.
12. Un método para aislar el gen de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, que comprende:
13. Un vector recombinante que comprende el gen de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-10.
14. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 13, que es un vector de expresión.
15. Un transformante obtenido introduciendo el vector recombinante de la reivindicación 13 ó 14 en un organismo huésped no humano.
16. El transformante de la reivindicación 15, que es una planta resistente a enfermedades.
17. Un agente antifúngico que comprende la proteína antifúngica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 como ingrediente activo.
18. Una proteína recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 producida por el transformante de la reivindicación 15.
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