Método para generar un microbio modificado genéticamente.

Una célula de levadura diploide modificada genéticamente que comprende:

(a) una alteración funcional en al menos un gen de esporulación

(b) una alteración funcional en al menos un gen de respuesta a feromonas, en donde el al menos un gen de respuesta a feromonas es diferente del al menos un gen de esporulación; y

(c) una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés;

en donde dicha célula de levadura diploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación, incapacitada para el emparejamiento endógeno y es homocigota excepto en su alelo de tipo de emparejamiento.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/036861.

Solicitante: Amyris, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 5885 Hollis Street Suite 100 Emeryville CA 94608 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: UBERSAX,JEFFREY A.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/19 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/81 (para levaduras)

PDF original: ES-2464740_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para generar un microbio modificado genéticamente

1. Campo de la invención Los métodos y composiciones que se proporcionan en el presente documento generalmente se refieren al uso industrial de microorganismos que se han modificado para reducir significativamente el riesgo de su diseminación en la naturaleza, y en particular, la diseminación en la naturaleza de sus secuencias de ADN recombinante. También se proporcionan métodos para producir y usar tales microorganismos genéticamente modificados.

2. Antecedentes Los avances en tecnología de ADN recombinante ha permitido la producción industrial de sustancias útiles en grandes cantidades por medio de la utilización de procariotas y eucariotas. Entre los eucariotas, las levaduras (en particular las levaduras pertenecientes al género Saccharomyces) , se han utilizado ampliamente para la producción de productos fermentados. Generalmente, las levaduras pueden crecer rápidamente y se pueden cultivar con una alta densidad en comparación con las bacterias, y no requieren un ambiente aséptico en el centro industrial. Además, las células de levadura se pueden separar fácilmente del medio de cultivo en comparación con las bacterias, lo que simplifica mucho el proceso para la extracción del producto y su purificación. Debido a estas características, las levaduras (en particular las levaduras modificadas genéticamente que portan secuencias de ADN recombinante) se han empleado como huéspedes para la producción de productos útiles, y se ha establecido la utilidad de tales levaduras. Sin embargo, la utilización de levaduras modificadas genéticamente en la industria conlleva un riesgo medioambiental potencial, debido a que la dispersión de tales levaduras, y/o las secuencias de ADN recombinante que están contenida en tales levaduras, puede tener consecuencias impredecibles en el ecosistema. Por tanto existe una necesidad de levaduras que sean adecuadas para las aplicaciones industriales pero que posean un riesgo reducido de que se diseminen y propaguen en la naturaleza, y en particular, posean un riesgo reducido de diseminación de sus secuencias de ADN recombinante en la naturaleza.

Ramírez y col, Applied And Environmental Microbiology, vol. 74, nº 7, Abril 2008 (2008-04) , páginas 2129-2134, describen la construcción de levaduras del vino Saccharomyces cerevisiae imeI Delta-transgénicas incapaces de diseminarse en la naturaleza. Hadfield y col, Current Genetics, vol. 18, nº 4, Noviembre 1990 (1990-11) , páginas 303-313, describen la resistencia a G418 como marcador dominante e indicador de la expresión génica en Saccharomyces cerevisiae. Mukai y col, Molecular And Cellular Biology vol. 13, nº 4, 1993, páginas 2050-2060,

describen la función de la ruta Ste de transducción de señal de feromonas de emparejamiento que sostiene la transcripción de MAT-alfa-1 en Saccharomyces cerevisiae.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a métodos para generar cepas de levadura modificadas genéticamente, que están incapacitadas para la esporulación y el emparejamiento endógeno. Los métodos que se proporcionan en el presente documento comprenden la alteración funcional de uno o más genes de esporulación y uno o más genes de respuesta a feromonas en células de levadura haploides modificadas genéticamente, y la inducción de dichas células haploides genéticamente modificadas para formar diploides estables que son sexualmente estériles eficaces 45 y constreñidas en el estado diploide de su ciclo vital debido a su falta de capacidad para emparejarse y esporular. Las cepas de levadura, genéticamente modificadas de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento encuentran una utilidad en aplicaciones industriales, por ejemplo, en aplicaciones de fermentación industrial y pueden proporcionar la ventaja de poseer un riesgo significativamente reducido de que se diseminen y se propaguen en la naturaliza por medio del emparejamiento con microorganismos del tipo silvestre.

En un aspecto, se proporciona en el presente documento una célula de levadura diploide modificada genéticamente que comprende: (a) una alteración funcional de al menos un gen de esporulación; (b) una alteración funcional de al menos un gen de respuesta a feromonas, en el que el al menos un gen de respuesta a feromonas es diferente del al menos un gen de esporulación; (c) una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que 55 codifica una proteína de interés; en el que dicha célula de levadura haploide heterotálica (ho) está incapacitada para la esporulación e incapacitada para el emparejamiento endógeno. En algunas realizaciones, la célula de levadura modificada genéticamente es heterotálica (ho) . En algunas realizaciones, la célula haploide modificada genéticamente comprende además un plásmido recombinante que codifica una proteína de homotalismo (HO) . En algunas realizaciones, la célula haploide modificada genéticamente comprende uno o más plásmidos recombinantes 60 que codifican el uno o más genes de respuesta a feromonas que están funcionalmente alterados en dicha célula de levadura.

En algunas realizaciones, la célula de levadura modificada genéticamente útil para la práctica de los métodos proporcionados en el presente documento es una célula de Saccharomyces cerevisiae.

En algunas realizaciones, el uno o más genes de esporulación alterados en la célula de levadura modificada genéticamente se seleccionan de entre el grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2, y SP021. En realizaciones particulares, se ha alterado el gen IME1. En algunas realizaciones, el uno o más genes de respuesta a feromonas alterados en la célula de levadura modificada genéticamente se seleccionan de entre el grupo que consiste en STE5, STE4, STE18, STE12, STE7, y STE11. En realizaciones particulares el gen STE5 está alterado. En realizaciones particulares, la célula de levadura genéticamente modificada comprende una alteración funcional de los genes STE5 e IME1. En algunas realizaciones, una célula haploide de la célula de levadura modificada genéticamente comprende una alteración funcional del gen STE5 y un plásmido recombinante que codifica una proteína STE5.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un método para generar una célula de levadura diploide modificada genéticamente que está incapacitada para la esporulación y emparejamiento endógeno. El método comprende: (a) transformar cada primera y segunda células de levadura haploides modificadas genéticamente con al menos un plásmido que codifica una proteína capaz de complementar la incapacidad de emparejamiento endógeno de dicha primera y segunda células de levadura haploides modificadas genéticamente, en que dicha primera célula de levadura haploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno y comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés, y en que dicha segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno, es del tipo de emparejamiento opuesto a la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente, y comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés: (b) emparejar la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente con la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente, formando de esta manera una célula de levadura diploide modificada genéticamente; y, (c) eliminar el uno o más plásmidos de la célula de levadura diploide modificada genéticamente, con lo que la célula de levadura diploide modificada... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una célula de levadura diploide modificada genéticamente que comprende:

(a) una alteración funcional en al menos un gen de esporulación

(b) una alteración funcional en al menos un gen de respuesta a feromonas, en donde el al menos un gen de respuesta a feromonas es diferente del al menos un gen de esporulación; y

(c) una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés;

en donde dicha célula de levadura diploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación, incapacitada para el emparejamiento endógeno y es homocigota excepto en su alelo de tipo de emparejamiento.

2. La célula de levadura diploide modificada genéticamente de la reivindicación 1 que es heterotálica (ho) .

3. Una célula de levadura haploide heterotálica (ho) modificada genéticamente que comprende:

(a) una alteración funcional en al menos un gen de esporulación

(b) una alteración funcional en al menos un gen de respuesta a feromonas, en donde el al menos un gen de respuesta a feromonas es diferente del al menos un gen de esporulación; y

(c) una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés;

en donde dicha célula de levadura haploide heterotálica (ho) modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación e incapacitada para el emparejamiento endógeno.

4. La célula de levadura haploide modificada genéticamente de la reivindicación 3, que comprende además un plásmido recombinante que codifica una proteína de homotalismo (HO) funcional.

5. La célula de levadura haploide modificada genéticamente de la reivindicación 4, que comprende además un plásmido recombinante que codifica una copia funcional del al menos un gen de respuesta a feromonas que está alterado funcionalmente en dicha célula de levadura haploide modificada genéticamente.

6. La célula de levadura modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que es una célula de Saccharomyces cerevisiae.

7. La célula de levadura modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicho al menos un gen de esporulación se selecciona del grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2 y SP021.

8. La célula de levadura modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicho al menos un gen de respuesta a feromonas se selecciona del grupo que consiste en STE5, STE4, STE18, STE12, STE7 y STE11.

9. La célula de levadura modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende una alteración funcional del gen IME1 y del gen STE5.

10. Un método para generar una célula de levadura diploide modificada genéticamente que está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno, comprendiendo el método:

(a) transformar cada primera y segunda células de levadura haploides modificadas genéticamente con al menos un plásmido que codifica una proteína capaz de complementar una incapacidad de emparejamiento endógeno de dichas primera y segunda célulass de levadura haploides modificadas genéticamente, en donde dicha primera célula de levadura haploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno y comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés, y en donde dicha segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno, es del tipo de emparejamiento opuesto al de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente y comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés;

(b) emparejar la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente con la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente, formando de esta manera una célula de levadura diploide modificada genéticamente; y

(c) eliminar el uno o más plásmidos de la célula de levadura diploide modificada genéticamente,

en donde la célula de levadura diploide modificada genéticamente resultante está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno, es homocigota excepto para su alelo de tipo de emparejamiento y comprende dos copias de una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés.

en donde dicha primera célula de levadura haploide modificada genéticamente y la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente están incapacitadas para el emparejamiento endógeno debido a una alteración funcional en al menos un gen de respuesta a feromonas, e incapacitadas para la esporulación debido a una alteración funcional en al menos un gen de esporulación, en donde el al menos un gen de respuesta a feromonas es diferente del al menos un gen de esporulación.

11. El método de la reivindicación 10, en el que la etapa (a) comprende la transformación de cada primera y segunda células de levadura haploides modificadas genéticamente con al menos un plásmido que codifica una copia funcional del al menos un gen de respuesta a feromonas que está alterado funcionalmente en dichas primera y segunda células de levadura haploides modificadas genéticamente.

12. El método de las reivindicaciones 10 u 11, en el que el gen de respuesta a feromonas se selecciona del grupo que consiste en STE5, STE4, STE18, STE12, STE7 y STE11.

13. El método de la reivindicación 10 u 11, en el que el gen de esporulación se selecciona de entre el grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2 y SP021.

14. El método de las reivindicaciones 10 u 11, en el que la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente se obtiene induciendo un cambio en el tipo de emparejamiento en una población de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente.

15. El método de la reivindicación 14, en el que la población de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente es heterotálica (ho) y se induce para cambiar el tipo de emparejamiento transformando la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente con un plásmido recombinante que codifica una proteína de homotalismo (HO) funcional, en donde la expresión de proteína HO es capaz de inducir un cambio en el tipo de emparejamiento de dicha primera célula de levadura haploide modificada genéticamente.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente y la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente están incapacitadas para el emparejamiento endógeno debido a una alteración funcional del gen STE5, y están incapacitadas para la esporulación debido a una alteración funcional del gen IME1.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la célula de levadura diploide modificada genéticamente es una célula de Saccharomyces cerevisiae

18. Una célula de levadura diploide incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno que es homocigota excepto para su alelo de tipo de emparejamiento, generada por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 10-17.

19. Una célula de levadura diploide MAT!/a ste5/ste5 ime1/ime1 que es homocigota excepto en su alelo de tipo de emparejamiento.

Figura 3