METODO MEJORADO PARA LA PRODUCCION A GRAN ESCALA DE ANTIGENOS VIRALES.

Método para la producción de virus o antígenos virales que comprende los pasos de (a) proporcionar un cultivo de células adherentes unidas a un microportador,

(b) desarrollar el cultivo celular hasta alcanzar la confluencia, (c) infectar las células con un virus y (d) incubar dicho cultivo de células infectadas por dicho virus para la propagación de éste, caracterizado porque la densidad celular de la biomasa del cultivo celular desarrollado hasta alcanzar la confluencia aumenta (i) antes del paso (c), o (ii) después del paso (c) y se mantiene a una densidad celular elevada durante el paso (d)

Método mejorado para la producción a gran escala de antígenos virales.

La presente invención se refiere a métodos mejorados para la producción de antígenos virales en un cultivo de células adherentes unidas a un microportador, caracterizada porque los métodos prevén un aumento de la producción por volumen del antígeno viral en el medio de cultivo. La invención se refiere asimismo a una biomasa de cultivo celular de células adherentes con una densidad celular y una concentración de microportadores incrementada en comparación con el cultivo celular confluente respectivo.

La producción eficaz de vacunas requiere el desarrollo de cantidades a gran escala de virus producidos en grandes cantidades a partir de un sistema huésped. Las condiciones de cultivo en las que se desarrolla una cepa viral son muy importantes en lo que se refiere a conseguir una producción aceptablemente alta de la cepa. Así, con el fin de maximizar la producción del virus deseado, tanto el sistema como las condiciones de cultivo se deben adaptar específicamente con el fin de proporcionar un entorno que sea ventajoso para la producción del virus deseado. Por tanto, para lograr una producción aceptablemente elevada de las diversas cepas virales, es necesario un sistema que proporcione condiciones óptimas de crecimiento para una gran cantidad de virus diferentes.

El único proceso que es económicamente viable es un proceso en reactor, ya que la ampliación a escala se puede adecuar al tamaño del mercado y a las dosis de vacunas necesarias. En cuanto a las células adherentes, el proceso para preparar el soporte con un microportador clásico es actualmente la mejor elección para cultivos a gran escala de aquellas células necesarias para la propagación viral (Van Wezel y col., 1967. Nature 216:64-65; Van Wezel y col., 1978. Process Biochem. 3:6-8). Se ha descrito la producción mediante procesos a gran escala del virus de la poliomielitis, virus de la Hepatitis A, VHS o virus de la enfermedad de Mareck en un microportador (US 4.525.349; Widell y col., 1984. J. Virological Meth. 8:63-71; Fiorentine y col., 1985. Develop. Biol. Standard 60:421-430; Griffiths y col., 1982. Develop. Biol. Standard. 50:103-110). Los procesos actuales basados en el cultivo en microportadores permiten la producción de virus mediante fermentadores de un tamaño que alcanza los 1.200 l.

Caij y col. (1989, Arch. Virol. 105: 113-118) compararon las producciones del virus titulado del Cólera Porcino en cultivos en microportadores con los cultivos convencionales monocapa y descubrieron que, mediante la utilización del sistema microportador, se podía obtener una producción más elevada de virus por volumen de medio de cultivo.

Griffiths y col. (1982, Develop. Biol. Standard. 50:103-110) estudiaron la influencia de la concentración de microportadores sobre el crecimiento celular y la producción de VSH. Se descubrió que era necesaria una concentración óptima de microportadores para alcanzar una alta densidad celular, lo que influía también en la producción viral obtenida. Sin embargo, concentraciones más altas de microportador en un sistema de perfusión resultaron en una pérdida celular debido a que la capa celular se desprendía de las perlas.

Además, Kistner y col. (Alternativen Zu Tierexperimenten, Alemania 2001, vol. 18, nº 1, páginas 50 a 54) describen la producción en cultivo de la vacuna contra la gripe en fermentadores bajo condiciones exentas de suero; Kistner y col. (Wiener Klinische Wochenschrift, New York, NY, US, vol. 111, nº 5, 1999, páginas 207 a 214) describen la producción de la vacuna contra la gripe en cultivos de células VERO bajo condiciones exentas de suero; y Barett y col. (Aids Research And Human Retroviruses, New York, NY, US. vol. 5, nº 2, 1989, páginas 159 a 172) describen la producción y purificación a gran escala de las glicoproteínas de la envoltura del VIH-1. Además, la WO 91/09935 describe la producción del virus de la FSME por medio de células VERO unidas a un sustrato; Percheson y col. (Developments In Biological Standardization, vol. 98, 1999, páginas 127 a 132) describen un estudio clínico en adultos sanos utilizando una vacuna contra la gripe derivada de virus desarrollados en cultivo celular; y Sharkey y col. (Journal Of Virology, vol. 75, nº 6, 2001, páginas 2653 a 2659) describen una línea celular estable que produce el retrovirus glicoproteico-pseudotipado del alfavirus.

La productividad del proceso de producción viral en el sistema microportador depende del virus, de las células, del tipo de microportador y de la densidad celular obtenida en el sistema. Concentraciones más elevadas de microportador en el cultivo celular permiten cantidades totales más elevadas de células. Sin embargo, los microportadores son caros y, en estas condiciones, puede tener lugar una pérdida celular debido a que las capas celulares se desprenden de las perlas por el esfuerzo de cizalla que aparece en el sistema. Esto implica que, para producciones virales más elevadas, es necesario un mayor volumen de cultivo celular en los microportadores, sin embargo, esto aumenta los esfuerzos que se deben realizar para procesar y purificar dichos grandes volúmenes.

En cuanto a la propagación viral, es importante alcanzar una densidad celular óptima para obtener la máxima producción viral. También es importante permitir la adsorción eficaz del virus en las células. Por tanto, en los métodos convencionales, el volumen del medio de cultivo se reduce antes de la infección para permitir la adsorción del virus en las células en un volumen mínimo de cultivo y para obtener una mejor relación entre el virus y las células. Sin embargo, para obtener una propagación óptima del virus, el volumen del medio de cultivo se incrementa de nuevo después de un tiempo de adsorción adecuado para que las células puedan mantener su viabilidad y/o desarrollo. Esto, sin embargo, aumenta el volumen del medio de cultivo que incluye las células y/o virus, lo que tiene el inconveniente de que se deben procesar grandes volúmenes para la purificación posterior del virus procedente de las células o del medio de cultivo celular.

En caso de una epidemia de infección viral, resulta crítico producir grandes cantidades de vacunas de forma adecuada para proporcionar varios millones de dosis de vacunas en un período de tiempo muy corto. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de métodos seguros y eficaces para producir virus y antígenos. Además, se necesita una aproximación a la propagación viral mediante el empleo de materiales ya disponibles y que requieran una cantidad mínima de manipulaciones prolongadas, tal como el manejo de volúmenes reducidos de medio de cultivo celular, y que faciliten la purificación y el procesamiento posterior para la producción de vacunas.

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un método para la producción de virus o antígenos virales en un cultivo celular de células adherentes unidas a un microportador.

También es objeto de la presente invención proporcionar un método de producción viral en un pequeño volumen de cultivo celular.

De acuerdo con estos y otros objetos, la presente invención proporciona métodos para la producción de virus o antígenos virales, que comprenden los pasos de proporcionar un cultivo de células adherentes unidas a un microportador, desarrollar el cultivo celular hasta alcanzar la confluencia, infectar estas células con un virus, donde la densidad celular en el cultivo celular aumenta (i) antes de la infección con el virus o (ii) después de la infección con el virus; e incubar el cultivo de células infectadas con el virus para propagarlo. El incremento de la densidad celular en el cultivo celular se lleva a cabo mediante la concentración del cultivo celular, lo que incluye un aumento de la concentración de los microportadores en el cultivo celular.

En general, las células adherentes unidas a microportadores necesitan una relación óptima entre la concentración de microportadores y las células para alcanzar una densidad celular elevada. El incremento de la concentración de microportadores en el cultivo celular permitiría teóricamente alcanzar una densidad celular más alta por volumen de medio de cultivo. Sin embargo, debido a los efectos de cizalla, a la reducción de las fuentes de alimentación en el medio y a la tensión fisiológica de las células por el aumento de la concentración de microportadores, la concentración del soporte del sistema de cultivo celular se limita a una concentración específica (véase también Griffiths y col., 1982, más arriba).

El método de la...

1. Método para la producción de virus o antígenos virales que comprende los pasos de (a) proporcionar un cultivo de células adherentes unidas a un microportador, (b) desarrollar el cultivo celular hasta alcanzar la confluencia, (c) infectar las células con un virus y (d) incubar dicho cultivo de células infectadas por dicho virus para la propagación de éste, caracterizado porque la densidad celular de la biomasa del cultivo celular desarrollado hasta alcanzar la confluencia aumenta (i) antes del paso (c), o (ii) después del paso (c) y se mantiene a una densidad celular elevada durante el paso (d).

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la densidad del cultivo celular desarrollado hasta alcanzar la confluencia se concentra al menos 1,3 veces aproximadamente.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la densidad celular del cultivo celular desarrollado hasta alcanzar la confluencia se encuentra entre aproximadamente 0,6 x 10⁶ y aproximadamente 7,0 x 10⁶ células/ml.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el microportador se selecciona de entre el grupo de microportadores compuesto por dextrano, colágeno, poliestireno, poliacrilamida, gelatina, vidrio, celulosa, polietileno y plástico.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la concentración de microportadores en el cultivo celular del paso (a) se sitúa entre aproximadamente 0,5 g/l y aproximadamente 14 g/l.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dichas células se seleccionan de entre el grupo de células adherentes de VERO, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF o células diploides monocapa.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichas células unidas a un microportador se cultivan en un medio exento de suero.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dichas células unidas a un microportador se cultivan en un medio exento de suero y de proteínas.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el virus se selecciona de entre el grupo de virus de la gripe, Virus de Ross-River, Virus de la Hepatitis A, Virus de la Vaccinia y derivados recombinantes del mismo, Virus del Herpes Simple, Virus de la Encefalitis Japonesa, Virus del Nilo Occidental, Virus de la Fiebre Amarilla y virus quiméricos de los mismos, así como Rhinovirus y Reovirus.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además el paso (e) de cosecha del virus propagado.

11. Método según la reivindicación 10, que comprende además el paso (f) de purificación del virus cosechado para obtener un virus o antígeno viral purificado.

12. Método según la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque el virus producido se cosecha del sobrenadante del cultivo celular.

13. Método según la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque el virus producido se cosecha de la biomasa celular.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque además comprende el paso de procesar el virus o el antígeno viral purificado en una vacuna.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el virus o el antígeno viral producido es el virus de la gripe o el antígeno del virus de la gripe.

16. Método según la reivindicación 14, caracterizado porque dichas células son células VERO.

17. Método según la reivindicación 14, caracterizado porque dichas células son células MDCK.