Método para determinar el potencial alergénico de una proteína modificada que comprende las etapas de,

a) inmunizar un primer ratón transgénico con una proteína de interés e inmunizar un segundo ratón transgénico con una proteína modificada, en el que dicha proteína modificada es una variante de dicha proteína de interés y dicha proteína de interés incluye un epítopo de células T en el que la variante difiere de la proteína de interés por tener un epítopo de células T alterado; b) recoger suero de dicho primer y dicho segundo ratón transgénico inmunizado; c) medir el suero por las inmunoglobulinas específicas de antígeno; y d) comparar la respuesta inmunogénica de dicha variante y dicha proteína de interés; en el que el primer ratón transgénico y el segundo ratón transgénico son HLA DR3/DQ2, y en el que la variante y la proteína de interés producen una respuesta inmunogénica diferente en dichos ratones transgénicos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las proteínas utilizadas en aplicaciones industriales, farmacéuticas y comerciales son de creciente prevalencia. Como resultado, la exposición incrementada debido a esta prevalencia ha sido el responsable de ciertos peligros para la seguridad causados por la sensibilización de ciertas personas a estos péptidos, con lo que la posterior exposición provoca reacciones alérgicas extremas que pueden ser perjudiciales e incluso fatales. Por ejemplo, se sabe que las proteasas provocan una hipersensibilidad peligrosa en algunos individuos. Como resultado, a pesar de la utilidad de proteasas en la industria, por ejemplo, en detergentes de lavandería, cosméticos, tratamiento textil, etc, y la amplia investigación realizada en el campo para proporcionar proteasas mejoradas que presentan, por ejemplo, una eliminación de manchas más eficaz bajo condiciones de detergencia; la utilización de proteasas en la industria ha sido problemática debido a su capacidad para producir una respuesta alergénica hipersensible en algunos humanos.

Se ha realizado mucho trabajo para aliviar estos problemas. Entre las estrategias exploradas para reducir el potencial inmunogénico del uso de proteasas, se han mejorado procesos de producción que reducen el potencial contacto controlando y minimizando las concentraciones en el punto de trabajo de las partículas de polvo o aerosoles que transportan proteasas en al aire, procesos de granulación mejorados que reducen la cantidad de polvo o aerosol producidos realmente a partir del producto de proteasa, y procesos de recuperación mejorados para reducir el nivel de contaminantes potencialmente alergénicos en el producto final. Sin embargo, los esfuerzos para reducir la alergenicidad de proteasa, per se, han sido relativamente insatisfactorios. Alternativamente, se han realizado esfuerzos para enmascarar epítopos en proteasas que son reconocidos por inmunoglobulina E (IgE) en individuos hipersensibles (Publicación PCT No WO 92/10755) o para aumentar o cambiar la naturaleza de los determinantes antigénicos mediante la unión de polímeros o péptidos/proteínas a la proteasa problemática.

Cuando una respuesta inmune adaptativa aparece en una forma exagerada o inapropiada, se dice que el individuo que experimenta la reacción es hipersensible. Las reacciones de hipersensibilidad son el resultado de respuestas inmunes normalmente beneficiosas que actúan de manera inapropiada y, algunas veces, causan reacciones inflamatorias y daño en los tejidos. Pueden estar provocadas por muchos antígenos; y la causa de la reacción de hipersensibilidad variará de un individuo a otro. La hipersensibilidad no se manifiesta normalmente tras un primer contacto con el antígeno, sino que normalmente aparece tras un contacto posterior. Una forma de hipersensibilidad aparece cuando una respuesta de IgE está dirigida contra antígenos ambientales inocuos, tales como el polen, ácaros del polvo o caspa animal. La liberación resultante de mediadores farmacológicos por mastocitos sensibles a IgE produce una reacción inflamatoria aguda con síntomas, tales como asma o rinitis.

No obstante, una estrategia que comprende modificar los sitios de IgE no serán en general exitosa en la prevención de la causa de la reacción de sensibilización inicial. Por consiguiente, dichas estrategias, aunque quizás neutralizan o reducen la gravedad de la reacción de hipersensibilidad posterior, no reducirán el número de personas realmente sensibles. Por ejemplo, cuando se sabe que una persona es hipersensible a cierto antígeno, la manera general, y la única segura, de tratar dicha situación es asilar la persona hipersensible del antígeno tanto como sea posible. De hecho, cualquier otro procedimiento de acción sería peligroso para la salud del individuo hipersensible. De este modo, aunque es importante reducir el peligro de una proteína específica para un individuo hipersensible, para fines industriales, sería mucho más valioso hacer que la proteína sea incapaz de iniciar la reacción de hipersensibilidad en primer lugar.

Los linfocitos T (células T) juegan un papel clave en la inducción y regulación de las respuestas inmunes y en la ejecución de funciones efectoras inmunológicas. Se sabe que la inmunidad específica contra agentes infecciosos y tumores depende de estas células y se cree que contribuyen a la curación de lesiones. Por otro lado, el fallo en el control de estas respuestas puede conducir a la auto-agresión. En general, el antígeno se presenta a las células T en forma de células presentados de antígeno que, mediante una variedad de mecanismos de la superficie celular, capturan y expresan el antígeno o antígeno parcial de una manera adecuada para el reconocimiento del antígeno por la célula T. Tras el reconocimiento de un epítopo específico por los receptores en la superficies de las células T (receptores de células T), las células T empiezan una serie de interacciones complejas, incluyendo la proliferación, que dan lugar a la producción de anticuerpo por células B. Aunque las células T y las células B son activadas ambas por epítopos antigénicos que existen en una proteína o péptido determinado, los auténticos epítopos reconocidos por estas células mononucleares en general no son idénticos. De hecho, el epítopo que activa una célula T para iniciar la creación de diversidad inmunológica es bastante a menudo no el mismo epítopo que es más tarde reconocido por células B en el transcurso de la respuesta inmunológica. De este modo, con respecto a la hipersensibilidad, aunque la interacción antigénica específica entre la célula T y el antígeno es un elemento crítico en el inicio de la respuesta inmune a la exposición antigénica, lo específico de esta interacción, es decir el epítopo reconocido, a menudo no es relevante para el posterior desarrollo de una reacción alérgica completa.

La Publicación PCT No. WO 96/40791 da a conocer un proceso para producir conjugados de óxido de polialquileno-polipéptido con una alergenicidad reducida utilizando óxido de polialquileno como material de partida.

La Publicación PCT No. WO 97/30148 da a conocer un conjugado de polipéptido con una alergenicidad reducida que comprende una molécula portadora polimérica que tiene dos o más moléculas polipeptídicas acopladas covalentemente a la misma.

La Publicación PCT No. WO 96/17929 da a conocer un proceso para producir polipéptidos con una alergenicidad reducida que comprende la etapa de conjugar de 1 a 30 polimoléculas a un polipéptido parental.

La Publicación PCT No. WO 92/10755 da a conocer un método de producir variantes de proteínas que provocan una respuesta inmunogénica reducida en animales. En esta solicitud, las proteínas de interés, una serie de proteasas y variantes de las mismas se utilizaron para inmunizar ratas. A continuación, el suero de las ratas se utilizó para medir la reactividad de los anticuerpos policlonales ya producidos y presentes en el suero inmunizado a la proteína de interés y variantes de la misma. A partir de estos resultados, era posible determinar si los anticuerpos en la preparación eran comparativamente más o menos reactivos con la proteína y sus variantes, permitiendo de este modo un análisis de qué cambios en la proteína probablemente neutralizarán o reducirán la capacidad de la Ig de unirse. A partir de estas pruebas en ratas, la conclusión a la que se llegó fue que el cambio de cualquiera de los 309 residuos de subtilisina correspondiente a 127, 128, 129, 130, 131, 151, 138, 151,152,153, 154,161, 162,183,167,168, 169,170, 171, 172, 173,174, 175, 176,186, 193, 94,195,196,197, 247, 251, 261 dará lugar a un cambio en el potencial inmunológico.

La Publicación PCT No. WO 94/10191 da a conocer proteínas poco alergénicas que comprenden formas oligoméricas de la proteína monomérica parental, donde el oligómero ha mantenido sustancialmente su actividad.

WO 00/34317 da a conocer métodos para que las proteínas terapéuticas sean menos inmunogénicas o nada inmunogénicas mediante la extracción de epítopos de células T previamente identificados mediante, por ejemplo la modificación de aminoácidos. También se describen variantes modificadas de las proteínas tratadas de este modo. El análisis de la actividad de proteínas terapéuticas de variante modificada se puede realizar utilizando ratones transgénicos reconstituidos con (partes de) el sistema inmune de la especie elegida para recibir las proteínas terapéuticas.

Aunque algunos estudios han proporcionado métodos de reducción de la alergenicidad... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar el potencial alergénico de una proteína modificada que comprende las etapas de,

a) inmunizar un primer ratón transgénico con una proteína de interés e inmunizar un segundo ratón transgénico con una proteína modificada, en el que dicha proteína modificada es una variante de dicha proteína de interés y dicha proteína de interés incluye un epítopo de células T en el que la variante difiere de la proteína de interés por tener un epítopo de células T alterado; b) recoger suero de dicho primer y dicho segundo ratón transgénico inmunizado; c) medir el suero por las inmunoglobulinas específicas de antígeno; y d) comparar la respuesta inmunogénica de dicha variante y dicha proteína de interés; en el que el primer ratón transgénico y el segundo ratón transgénico son HLA DR3/DQ2, y en el que la variante y la proteína de interés producen una respuesta inmunogénica diferente en dichos ratones transgénicos.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de interés es una enzima.

3. El método según la reivindicación 2, en el que dicha enzima es una proteasa.

4. El método según la reivindicación 1, en el que la inmunoglobulina específica de antígeno es IgG.

5. El método según la reivindicación 1, en el que los ratones transgénicos HLA DR3/DQ2 se han retrocruzado con ratones que carecen de la expresión de moléculas endógenas I-A de clase II.

6. El método según la reivindicación 1, en el que dicho epítopo de células T se altera con sustituciones de aminoácidos.

7. El método según la reivindicación 1, en el que dicho epítopo de células T se altera por tener una parte terminal de dicha proteína de interés que incluye dicho epítopo de células T sustituido por una parte terminal correspondiente de un homólogo de dicha proteína de interés, en el que dicho homólogo no comprende un epítopo de células T idéntico a dicho epítopo de células T sustituido.

8. El método según la reivindicación 1, en el que dicha respuesta inmunogénica producida por la variante es inferior a la respuesta inmunogénica producida por la proteína de interés.

9. El método según la reivindicación 1, en el que dicha respuesta inmunogénica producida por la variante es mayor que la respuesta inmunogénica producida por la proteína de interés.

10. El método según la reivindicación 1, en el que dicha respuesta inmunogénica es predictiva de la respuesta alergénica en humanos.

11. El método según la reivindicación 10, en el que dicha proteína de interés es una proteasa.