Métodos para medir las concentraciones de biomoléculas.

Un método para calcular la concentración de una proteína o un péptido marcado sintetizado en el SNC y una proteína o un péptido sin marcar sintetizado en el SNC en un sujeto que comprende:

(a) proporcionar una muestra obtenida previamente a partir de un sujeto al que se ha administrado previamente uno o varios aminoácidos marcados, en donde los aminoácidos marcados se han incorporado en una proteína o un péptido sintetizado en el SNC de modo que la muestra comprende una fracción marcada de una proteína o un péptido sintetizado en el SNC y una fracción sin marcar de una proteína o un péptido sintetizado en el SNC;

(b) poner en contacto la muestra procedente de un sujeto con un Patrón de Cuantificación en donde el Patrón de Cuantificación incluye una concentración conocida de una proteína o un péptido sintetizado en el SNC que está marcado con un resto que tiene un peso molecular que difiere del uno o varios aminoácidos marcados administrados previamente al sujeto;

(c) aislar las proteínas o los péptidos marcados o sin marcar a partir de la muestra;

(d) determinar una proporción entre la proteína o el péptido sin marcar en la muestra y el Patrón de Cuantificación y determinar una proporción entre la proteína o el péptido marcado en la muestra y el Patrón de Cuantificación; y

(e) calcular la concentración de la proteína o el péptido sin marcar y la proteína o el péptido marcado en la muestra,

en donde el sujeto es un paciente o un cultivo de células.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2009/066810.

Solicitante: C2N Diagnostics.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: Center For Emerging Technologies 4041 Forest Park Avenue Saint Louis, MO 63108 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: WEST,TIM, PAOLETTI,ANDREW COREY.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/48 (Material biológico, p. ej. sangre, orina (G01N 33/02, G01N 33/26, G01N 33/44, G01N 33/46 tienen prioridad ); Hemocitómetros (cómputo de glóbulos repartidos sobre una superficie por barrido óptico de la superficie G06M 11/02))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por separación... > G01N30/06 (Preparación)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por separación... > G01N30/72 (Espectrómetros de masa)

PDF original: ES-2536436_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Métodos para medir las concentraciones de biomoléculas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere en general a métodos para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades, trastornos neurológicos y neurodegenerativos y procesos asociados.

INFORMACIÓN GENERAL

La Enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común de demencia y es un problema creciente de la salud pública. Actualmente se estima que afecta a 5 millones de personas en los Estados Unidos, con un aumento previsto a 13 millones para el año 25 (Herbert et al, 21, Alzheimer Dls. Assoc. Disord. 15(4): 169-173). La EA, como otras enfermedades degenerativas del sistema nervioso central (SNC), se caracteriza por alteraciones en la producción, la acumulación y el aclaramiento de proteínas. En la EA, un trastorno en la regulación del metabolismo de la proteína beta-amiloide (AI3), se indica por una acumulación masiva de esta proteína en los cerebros de las personas con la enfermedad. La EA conduce a una pérdida de memoria, de función cognitiva y en última Instancia de independencia y muerte. La enfermedad tiene un fuerte impacto personal y financiero sobre el paciente, la familia y la sociedad. Debido a la gravedad y el aumento de la prevalencia de esta enfermedad en la población, es urgente que se desarrollen tratamientos mejores.

Actualmente, existen algunas medicaciones que modifican los síntomas, sin embargo, no hay tratamientos que modifiquen la enfermedad. Los tratamientos que modifican la enfermedad probablemente serán más eficaces cuando se administren antes de la aparición de un daño cerebral irreversible. Sin embargo, en el momento en el que se realiza un diagnóstico clínico de EA, ya se ha producido una gran pérdida neuronal (Price et al., 21, Arch. Neurol. 58(9): 1395-142). Por lo tanto, una manera de identificar los sujetos que tienen riesgo de desarrollar EA sería más útil para prevenir o retrasar la aparición de la EA. Actualmente, no hay medios para identificar los cambios fisiopatológicos que se producen en la EA, antes de la aparición de los síntomas clínicos o para medir eficazmente los efectos de tratamientos que pueden prevenir la aparición de la enfermedad o retrasar su progresión.

Por lo tanto, existe una necesidad de un método sensible, exacto y reproduclble para cuantificar biomoléculas en un sujeto. Las tecnologías anteriores utilizadas para una cuantlflcaclón absoluta Incluyen ensayos de inmunoabsorclón ligados a enzimas (ELISAs), que utilizan anticuerpos para capturar y medir las concentraciones. Sin embargo, los ELISAs cuantifican la concentración total o dependen de anticuerpos específicos de isoformas para la cuantlficaclón y pueden, en su mayor parte, ser utilizados para medir la concentración de una sola especie por ensayo. Los anticuerpos son altamente específicos de las especies proteicas y las conformaciones de las proteínas a las que se unen, y la dependencia de dos anticuerpos que se unen a la proteína de interés puede conducir a una alta variabilidad interensayos e intraensayos en las concentraciones descritas de ensayos ELISA. Por tanto, se necesita un método para medir la cuantificación absoluta de las concentraciones de una o varias biomoléculas en fluidos y tejidos biológicos in vivo, en donde las biomoléculas están asociadas con el diagnóstico y/o la progresión de enfermedades.

Los documentos US24/229283, EP1 686 372 y WO 28/145763 describen métodos para determinar la cantidad de un pollpéptido diana en una mezcla de polipéptidos, empleando un patrón interno marcado. El documento US 28/145941 describe métodos para un diagnóstico rápido de trastornos neurológicos. Rüfenacht P. et al., J. Mass Spectrometry 25; 4: 193-21 describen un análisis cuantitativo de péptidos A-beta en cerebros de ratones mediante espectrometría de masas empleando patrones de A-beta marcados.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Entre los diversos aspectos de la presente Invención se encuentra proporcionar un método para el cálculo de la concentración de una o varias biomoléculas en un sujeto. El método incluye proporcionar una muestra de un sujeto al que se ha administrado previamente uno o varios aminoácidos marcados, en donde los aminoácidos marcados se han incorporado en una proteína o péptido sintetizado en el SNC, de modo que la muestra comprende una fracción marcada de una proteína o péptido sintetizado en el SNC y una fracción sin marcar de una proteína o péptido sintetizado en el SNC, y poner en contacto una muestra del sujeto con un Patrón de Cuantificación, en donde el Patrón de Cuantificación es una concentración conocida de una biomolécula marcada de interés. El método Incluye además aislar la biomolécula de interés a partir de la muestra y determinar una proporción entre las biomoléculas marcadas y sin marcar en la muestra, que se utiliza de este modo para calcular la concentración de biomolécula sin marcar en la muestra. En una realización, el método Incluye además normalizar la concentración calculada con una curva de calibración, en donde la curva de calibración se genera mediante la determinación de dos o más proporciones entre biomoléculas sin marcar y el Patrón de Cuantificación, siendo conocida la concentración de la biomolécula sin marcar.

En esta memoria se describe un método in vivo para cuantificar la concentración de una o varias biomoléculas en un sujeto. El método incluye la administración de uno o varios aminoácidos marcados al sujeto, en donde los aminoácidos marcados se incorporan en una biomolécula de interés en el sujeto. El método incluye además la obtención de una muestra de fluido o tejido biológico a partir del sujeto, en donde la muestra incluye una fracción de biomolécula marcada y una fracción de biomolécula sin marcar. Después la muestra se pone en contacto con un Patrón de Cuantificación, en donde el Patrón de Cuantificación incluye una concentración conocida de una biomolécula marcada con un resto que tiene un peso molecular que difiere del uno o varios aminoácidos marcados administrados al sujeto. La proporción entre las biomoléculas marcadas y el Patrón de Cuantificación y la proporción entre las biomolécula sin marcar y el Patrón de Cuantificación se pueden usar entonces para calcular las concentraciones de ambas biomoléculas marcadas y sin marcar, respectivamente. En una realización, el cálculo de la concentración de biomolécula sin marcar comprende multiplicar la concentración del Patrón de Cuantificación con la proporción determinada entre la biomolécula sin marcar y el Patrón de Cuantificación. En otra realización, el cálculo de la concentración de la biomolécula marcada comprende multiplicar la concentración del Patrón de Cuantificación con la proporción determinada entre biomoléculas marcadas y el Patrón de Cuantificación. En aún otra realización, las concentraciones calculadas de biomoléculas sin marcar y marcadas se normalizan con cada una de sus curvas de calibración Individuales, en donde la curva de calibración se genera mediante la determinación de dos o más proporciones entre las biomoléculas sin marcar y marcadas y el Patrón de Cuantificación, conociéndose la concentración de biomoléculas sin marcar y marcadas.

En esta memoria se describe un método para medir el metabolismo in vivo de una o vahas biomoléculas producidas en el sistema nervioso central de un sujeto. El método comprende administrar un resto marcado al sujeto, en donde el resto marcado es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica y de incorporarse en la(s) biomolécula(s) cuando una o vahas biomoléculas se producen en el sistema nervioso central del sujeto. El método comprende además obtener una muestra del sistema nervioso central del sujeto, en donde... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para calcular la concentración de una proteína o un péptido marcado sintetizado en el SNC y una protema o un péptido sin marcar sintetizado en el SNC en un sujeto que comprende:

(a) proporcionar una muestra obtenida previamente a partir de un sujeto al que se ha administrado previamente uno o varios aminoácidos marcados, en donde los aminoácidos marcados se han incorporado en una proteína o un péptido sintetizado en el SNC de modo que la muestra comprende una fracción marcada de una proteína o un péptido sintetizado en el SNC y una fracción sin marcar de una proteína o un péptido sintetizado en el SNC;

(b) poner en contacto la muestra procedente de un sujeto con un Patrón de Cuantificación en donde el Patrón de Cuantificación incluye una concentración conocida de una proteína o un péptido sintetizado en el SNC que está marcado con un resto que tiene un peso molecular que difiere del uno o varios aminoácidos marcados administrados previamente al sujeto;

(c) aislar las proteínas o los péptidos marcados o sin marcar a partir de la muestra;

(d) determinar una proporción entre la proteína o el péptido sin marcar en la muestra y el Patrón de Cuantificación y determinar una proporción entre la proteína o el péptido marcado en la muestra y el Patrón de Cuantificación; y

(e) calcular la concentración de la proteína o el péptido sin marcar y la proteína o el péptido marcado en la muestra,

en donde el sujeto es un paciente o un cultivo de células.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la muestra se pone en contacto con dos o más Patrones de Cuantificación y se calculan las concentraciones de dos o más proteínas o péptidos sin marcar sintetizados en el SNC.

3. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína o el péptido sintetizado en el SNC se selecciona a partir del grupo que consiste en AB 1-16, AB 1-17, AB 1-37, AB 1-38, AB 1-39, AB 1-4, AB 1-41, AB 1-42 y AB 1-43.

4. El método según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente comparar la concentración de la proteína o el péptido sin marcar sintetizado en el SNC con la concentración de la misma proteína o péptido sintetizado en el SNC en una muestra normal correspondiente, con la concentración de la misma proteína o péptido sintetizado en el SNC de un sujeto con un estado de enfermedad neurológica o neurodegenerativa conocido, con la concentración de la misma proteína o péptido sintetizado en el SNC procedente del mismo sujeto determinada en un momento anterior, o cualquier combinación de las mismas.

5. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína o el péptido sintetizado en el SNC es una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste en beta-amiloide (AB), alfa-slnucleína, Tau, apollpoproteína E, apolipoproteína J, proteína precursora amllolde (APP), alfa-2-macroglobulina, S1B, proteína básica de mlellna, TDP-43, superóxido dismutasa-1, huntlngtlna, una interleucina y TNF.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el patrón de cuantificación es un péptido 29-x de AB, en donde el péptido 29-x de AB se selecciona a partir del grupo que consiste en AB 29-37, AB 29-38, AB 29-39, AB 29-4 y AB 29-42.