Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

GLICOPROTEINA HIALURONIDASA SOLUBLE (SHASEGP), PROCESO PARA PREPARARLA, USOS Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LA COMPRENDEN.

Resumen:

Una glicoproteína sustancialmente purificada que comprende un polipéptido hialuronidasa soluble activo a pH neutro que contiene al menos un resto azúcar ligado a N

, en el que:

el resto azúcar ligado a N está unido covalentemente a un resto asparagina del polipéptido;

la glicoproteína sustancialmente purificada comprende una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1 o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 91% con una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1; y

la glicoproteína sustancialmente purificada es soluble.

Solicitante: HALOZYME, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 11588 SORRENTO VALLEY ROAD, S17,SAN DIEGO, CA 92121.

Inventor/es: FROST, GREGORY I., BOOKBINDER,LOUIS,H, KUNDU,ANIRBAN.

Fecha de Publicación de la Concesión: 18 de Marzo de 2010.

Fecha Concesión Europea: 11 de Noviembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes: C12N9/26 (...actúan sobre enlaces alfa-glucosídicos-1, 4, p. ej. hialuronidasa, invertasa, amilasa [3]).

Clasificación PCT: C12N1/20 (.Bacterias; Sus medios de cultivo [3]), C12N9/00 (Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A 61 K 7/28; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A 61 K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C 11 D); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas (preparación de malta C 12 C 1/00) [3]), C12P21/06 (.preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados (preparación de productos alimenticios por hidrólisis de proteínas A 23 J 3/00) [3]), C07H21/04 (.con desoxirribosilo como radical sacárido [2]), C12N15/00 (Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética 1/00, 5/00, 7/00; nuevas plantas per se A 01 H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A 01 H 4/00; nuevas razas animales per se A 01 K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A 61 K 48/00; péptidos en general C 07 K) [3,5,6]), C12N9/24 (..actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2) [3]).

Clasificación antigua: A61K31/00 (Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos [2] Notas (1) Es importante tener en cuenta las notas de la clase C07, p. Ej. , las notas que siguen al título de la subclase C07D, que indican las reglas para la clasificación de los compuestos orgánicos en esta clase, estas reglas se aplican también a la clasificación de compuestos orgánicos en el grupo A 61 K 31/00, salvo indicación en contra. [7] (2)Las sales o los complejos de principios activos orgánicos se clasifican según los principios activos básicos. Si un complejo está formado por varios principios activos,se clasifica en el último lugar apropiado. [7] (3) Los principios activos orgánicos que forman sales o complejos con metales pesados no son clasificados en los grupos 31/28, 31/555 o 31/7135, salvo indicación en contra explícita, p.ej. hemina 31/555, cianocobalamina 31/714. [7] (4) En el presente subgrupo, las expresiones "conteniendo otros heterociclos" y "condensados con sistemas heterocíclicos" cubren igualmente los compuestos que tienen varios heterociclos idénticos. [7]).

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Descripción:

Glicoproteína hialuronidasa soluble (sHASEGP), proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden.

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de acuerdo con 35 U.S.C. NAK 119 (e) respecto al documento U.S. de Número de Serie 60/452.360, presentado el 5 de marzo de 2003.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a glicoproteínas hialuronidasa solubles activas a pH neutro (sHASEGP), porciones de las mismas, particularmente dominios hialuronidasa. Más específicamente, la invención se refiere a modificaciones químicas, composiciones farmacéuticas, plásmidos de expresión, métodos para la fabricación y métodos terapéuticos que usan las glicoproteínas hialuronidasas y dominios de las mismas y las moléculas de ácido nucleico codificantes para la modificación terapéutica de glicosaminoglicanos en el tratamiento de una enfermedad y para el uso para aumentar la difusión de otras moléculas inyectadas de menos de 200 nanómetros de diámetro en un animal.

Información antecedente

Los glicosaminoglicanos (GAG) son polisacáridos lineales complejos de la matriz extracelular (ECM). Los GAG se caracterizan por estructuras disacáridas repetidas de una hexosamina N-sustituida y un ácido urónico, [hialuronano (HA), sulfato de condroitina (CS), condroitina (C), sulfato de dermatán (DS), sulfato de heparán (HS), heparina (H)], o una galactosa, [sulfato de queratán (KS)]. Excepto por el HA, todos se presentan unidos covalentemente a proteínas de núcleo. Los GAG con sus proteínas de núcleo se denominan estructuralmente proteoglicanos (PG).

El hialuronano (HA) se encuentra en mamíferos predominantemente en tejidos conjuntivos, piel, cartílago y en líquido sinovial. El hialuronano también es el constituyente principal del humor vítreo del ojo. En el tejido conjuntivo, el agua de hidratación asociada con el hialuronano genera espacios entre tejidos, generando de este modo un entorno que conduce a movimiento y proliferación celular. El hialuronano desempeña un papel clave en fenómenos biológicos asociados con la motilidad celular incluyendo el desarrollo rápido, regeneración, reparación, embriogénesis, desarrollo embrionario, cicatrización de heridas, angiogénesis y oncogénesis (Toole 1991 Cell Bioll Extracell. Matrix, Hay (ed.), Plenum Press, Nueva York, 1384-1386; Bertrand et al. 1992 Int. J. Cancer 52: 1-6; Knudson et al, 1993 FASEB J. 7: 1233-1241). Además, los niveles de hialuronano se correlacionan con la agresividad tumoral (Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20: 600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36: 2133-2139; Kimata et al. 1983 Cáncer Res.43: 1347-1354).

El HA se encuentra en la matriz extracelular de muchas células, especialmente en tejidos conjuntivos blandos. Al HA se le han asignado diversas funciones fisiológicas, tales como en la homeostasis del agua y de proteínas plasmáticas (Laurent TC et al (1992) FASEB J 6: 2397-2404). La producción de HA aumenta en células en proliferación y puede desempeñar un papel en la mitosis. También se ha implicado en la locomoción y en la migración celular. El HA parece desempeñar papeles importantes en la regulación, desarrollo y diferenciación celular (Laurent et al, anteriormente).

El HA se ha usado en la medicina clínica. Su propiedades reológicas y protectoras de tejidos han demostrado utilidad en la cirugía oftálmica para proteger el endotelio corneal durante la cirugía de cataratas. El HA sérico es diagnóstico de enfermedad hepática y diversas afecciones inflamatorias, tales como artritis re6umatoide. El edema intersticial causado por acumulación de HA puede causar disfunción en diversos órganos (Laurent et al, anteriormente).

Las interacciones proteicas del hialuronano también están implicadas en la estructura de la matriz extracelular o "sustancia fundamental".

Las hialuronidasas son un grupo de enzimas activas a pH neutro y a pH ácido que se encuentran por todo el reino animal. Las hialuronidasas varían con respecto a la especificidad de sustrato y mecanismo de acción.

Existen tres clases generales de hialuronidasas:

1. Hialuronidasas de tipo mamífero, (EC 3.2.1.35) que son endo-beta-N-acetilhexosaminidasas con tetrasacáridos y hexasacáridos como los productos finales principales. Tienen actividades tanto hidrolítica como transglicosidasa y pueden degradar el hialuronano y los sulfatos de condroitina (CS), en concreto C4-S y C6-S.

2. Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.99.1), degradan el hialuronano y en diversos grados CS y DS. Son endo-beta-N-acetilhexosaminidasas que funcionan mediante una reacción de beta-eliminación que produce principalmente productos finales disacáridos.

3. Las hialuronidasas (EC 3.2.1.36) de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos son endo-beta-glucuronidasas que generan productos finales tetrasacáridos y hexasacáridos a través de la hidrólisis del enlace beta 1-3.

Las hialuronidasas de mamífero pueden dividirse adicionalmente en dos grupos: enzimas activas a pH neutro y activas a pH ácido. Existen seis genes de tipo hialuronidasa en el genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3 HYAL4 HYALP1 y PH20/SPAM1. HYALP1 es un pseudogén y no se ha demostrado que HYAL3 posea actividad enzimática hacia ningún sustrato conocido. HYAL4 es una condroitinasa y carece de actividad hacia hialuronano. HYAL1 es la enzima activa a pH ácido prototípica y PH20 es la enzima activa a pH neutro prototípica. Las hialuronidasas activas a pH ácido, tales como HYAL1 y HYAL2, carecen de actividad catalítica a pH neutro. Por ejemplo, la HYAL1 no tiene actividad catalítica in vitro sobre pH 4,5 (Frost et al Anal Biochemistry, 1997). HYAL2 es una enzima activa a pH ácido con una actividad específica muy baja in vitro.

Las enzimas de tipo hialuronidasa también pueden estar caracterizadas por las que están inmovilizadas en la membrana plasmática a través de un anclaje glicosilfosfatidilinositol tal como HYAL2 humana y PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 15 de abril de 2003; 100 (8): 4580-5, Phelps et al., Science 1988) y las que son solubles, tales como HYAL1 humana (Frost et al, Biochem Biophys Res Commun. 9 de julio de 1997; 236 (1): 10-5). Sin embargo, existen variaciones entre especies: por ejemplo, la PH20 bovina se unen muy débilmente a la membrana plasmática y no se ancla mediante un anclaje sensible a fosfolipasa (Lalancette et al, Biol Reprod., agosto 2001; 65 (2): 628-36.). Esta característica única de la hialuronidasa bovina ha permitido el uso de la enzima hialuronidasa de testículos bovinos soluble como un extracto para uso clínico (Wydase®, Hyalase®). Otras especies de PH20 son enzimas ancladas a lípidos que no son insolubles sin el uso de detergentes o lipasas. Por ejemplo, la PH20 humana se ancla a la membrana plasmática a través de un anclaje GPI. Los intentos para preparar construcciones de ADN de PH20 humana que no introducirían un anclaje lipídico en el polipéptido dieron como resultado una enzima catalíticamente inactiva o una enzima insoluble (Arming et al Eur J Biochem. 1 de Agosto de 1997;247 (3): 810-4). La hialuronidasa de esperma de macaco de origen natural se encuentra en forma tanto soluble como unida a membrana. Mientras que la forma unida a membrana de 64 kDa posee actividad enzimática a pH 7,0, la forma de 54 kDa sólo es activa a pH 4,0 (Cherr et al, Dev Biol. 10 de abril de 1996; 175 (1): 142-53). Por lo tanto, las formas solubles de PH20 carecen con frecuencia de actividad enzimática en condiciones neutras.

Las condroitinasas son enzimas que se encuentran por todo el reino animal. Estas enzimas degradan los glicosaminoglicanos a través de una reacción endoglicosidasa. Los ejemplos específicos de condroitinasas conocidas incluyen condroitinasa ABC (obtenida de Proteus vulgaris; Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 6-153947, T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi y S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968), S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, y T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543 (1968)), condroitinasa AC (obtenida de Flavobacterium heparinum; T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi y S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968)), condroitinasa AC II (obtenida de Arthrobacter aurescens; K. Hiyama y S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824 (1975), K. Hiyama y S. Okada, J. Biochem. (Tokyo), 80, 1201 (1976)), hialuronidasa ACIII (obtenida de Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa y Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989)), condroitinasa B (obtenida de Flavobacterium eparinum; Y. M. Michelacci y C. P. Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 973 (1974), Y. M. Michelacci y C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121 (1975), Kenichi Maeyama, AkiraTawada, Akiko Ueno y Keiichi Yoshida, Seikagaku, 57, 1189 (1985)), condroitinasa C (obtenida de Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa y Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1939)) y similares.

Las glicoproteínas están compuestas por una cadena polipeptídica unida covalentemente a uno o más restos carbohidrato. Existen dos amplias categorías de glicoproteínas que poseen carbohidratos acoplados a través de sus enlaces N-glicosídicos u O-glicosídicos a su proteína constituyentes Los glicanos ligados a N y O se unen a polipéptidos a través de enlaces asparagina-N-acetil-D-glucosamina y serina(treonina)-N-acetil-D-galactosamina, respectivamente. Los oligosacáridos ligados a N complejos no contienen restos manosa terminales. Contienen sólo restos N-acetilglucosamina, galactosa y/o ácido siálico terminales. Los oligosacáridos híbridos contienen restos manosa terminales, así como restos N-acetilglucosamina, galactosa y/o ácido siálico terminales.

Con glicoproteinas ligadas a N, un precursor oligosacárido se une al grupo amino de asparagina durante la síntesis peptídica en el retículo endoplásmico. El resto oligosacárido se procesa después secuencialmente mediante una serie de enzimas específicas que delecionan y añaden restos de azúcares. El procesamiento se produce en el retículo endoplásmico y continúa con su paso a través del aparato cis-, medial- y trans-Golgi.

Sumario de la invención

Se proporcionan en este documento miembros de la familia de glicoproteínas hialuronidasas solubles activas a pH neutro, particularmente las proteínas hialuronidasas PH-20 humanas solubles (también denominadas en este documento sHASEGP). La sHASEGP proporcionada en este documento es un miembro de la familia de sHASEGP, denominada en este documento sHASEGP. También se proporciona el dominio hialuronidasa soluble y los usos del mismo.

La invención se basa en el descubrimiento de que puede producirse una actividad de hialuronidasa soluble activa a pH neutro con alto rendimiento en un sistema de expresión en mamíferos por introducción de ácidos nucleicos que carecen de aminoácidos que codifican una región estrecha en el extremo carboxi terminal del ADNc de PH20 humana. También se proporcionan modificaciones adicionales de la sHASEGP para aumentar la secreción mediante el uso de péptidos líder no nativos. Se proporcionan además métodos para modificar la sHASEGP para prolongar su semivida a modo de enmascaramiento de la proteína con polietilenglicol y modificaciones postraduccionales respecto a la glicosilación nativa. Los intentos previos para generar una sHASEGP humana secretada activa a pH neutro no tuvieron éxito. Se concluyó que los truncamientos del polipéptido sHASEGP humano daban como resultado tanto una pérdida de actividad enzimática a pH neutro como una incapacidad de las células para secretar la proteína recombinante en sistemas de expresión en mamíferos (Arming, et al Eur J Biochem 1 de agosto de 1997; 247 (3): 810-4). Es crítico generar una sHASEGP secretada que actúe a pH neutro para la producción comercial y la utilidad terapéutica como hialuronidasa. La invención, descrita en este documento, supera dichos retos.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una glicoproteína sustancialmente purificada que comprende un polipéptido hialuronidasa soluble activo a pH neutro que contiene al menos un resto azúcar ligado a N, estando el resto azúcar ligado a N unido covalentemente a un resto asparagina del polipéptido; la glicoproteína sustancialmente purificada comprende una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1 o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 91% con una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1; y la glicoproteína sustancialmente purificada es soluble. Los estudios que se muestran en este documento demuestran que la PH20 humana requiere glicanos ligados a N para la actividad catalítica, mientras que las hialuronidasas bovina y de veneno de abeja permanecen activas sin dichos glicanos ligados a N. Un dominio hialuronidasa humano desprovisto de restos ligados a N es catalíticamente inactivo. Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante clásica no permite la producción de una sHASEGP humana catalíticamente activa, a diferencia de la HASEGP de veneno de abeja, que puede producirse en E. coli.

La invención incluye métodos y células para la generación de un polipéptido glicoproteico sHASEGP ligado a N mediante el uso de una célula capaz de introducir dichos restos de azúcares ligados a N o por introducción de dichos restos ligados a N en un polipéptido sHASEGP. Se describen adicionalmente métodos para identificar apropiadamente sHASEGP glicosilados.

Se proporcionan modificaciones de sHASEGP para prolongar adicionalmente la semivida. Se proporcionan modificaciones químicas de una sHASEGP con polímeros tales como polietilenglicol y dextrano. Dichas modificaciones protegen a la sHASEGP de su eliminación de la circulación y del sistema inmune, así como receptores de glicosilación para manosa y asialoglicoproteína. Se proporcionan además métodos para unir a grupos funcionales específicos, tales como sitios de glicosilación, aminoácidos cargados positivamente y cisteínas.

También se proporcionan en este documento ensayos para identificar efectores, tales como compuestos, incluyendo moléculas pequeñas, y condiciones, tales como pH, temperatura y fuerza iónica, que modulan la activación, expresión o actividad de sHASEGP. En ensayos ejemplares, se evalúan los efectos de compuestos de ensayo sobre la capacidad de un dominio hialuronidasa de sHASEGP para escindir un sustrato conocido, típicamente un glicosaminoglicano o proteoglicano. Los agentes, generalmente compuestos, particularmente moléculas pequeñas, que modulan la actividad del dominio hialuronidasa son compuestos candidato para modular la actividad de la sHASEGP. Los dominios hialuronidasa también pueden usarse para producir anticuerpos específicos de hialuronidasa con actividad de alteración de la función. Los dominios hialuronidasa proporcionados en este documento incluyen, pero sin limitación, el dominio glicosil-hidrolasa N-terminal con porciones C-terminales del mismo truncadas que presenta actividad catalítica in vitro.

También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas y dominios hialuronidasa. Se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un dominio hialuronidasa soluble o porciones catalíticamente activas del mismo y también los que codifican la sHASEGP de longitud completa. El ácido nucleico que codifica el dominio hialuronidasa y el ácido nucleico cadena abajo se exponen en la SEC ID Nº: 6; y el dominio hialuronidasa de sHASEGP se expone en la SEC ID Nº: 1 (aminoácidos 35-464). La secuencia proteica y la secuencia de ácido nucleico codificante de la sHASEGP de longitud completa se exponen en las SEC ID Nº:1 y 6.

También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que hibridan con dicho ácido nucleico codificante de sHASEGP a lo largo de su longitud completa o a lo largo de al menos aproximadamente el 70%, 80% o 90% de la longitud completa y codifican el dominio hialuronidasa o una porción del mismo. La hibridación se efectúa generalmente en condiciones de rigurosidad al menos reducida, generalmente al menos moderada y con frecuencia elevada.

El fragmento de ácido nucleico aislado es ADN, incluyendo genómico o ADNc, o es ARN o puede incluir otros componentes, tales como ácido peptidonucleico u otros análogos de nucleótidos. El ácido nucleico aislado puede incluir componentes adicionales, tales como promotores heterólogos o nativos y otras secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción, estos genes pueden unirse a otros genes, tales como genes indicadores u otros genes indicadores o genes que codifican indicadores.

También se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que incluye la secuencia de moléculas que es complementaria a la secuencia de nucleótidos que codifica sHASEGP o la porción de la misma.

También se proporcionan fragmentos de los mismos u oligonucleótidos que pueden usarse como sondas o cebadores y que contienen al menos aproximadamente 10, 14, 16 nucleótidos, generalmente menos de 1000 o menos de o igual a 100, expuestos en la SEC ID Nº: 6 (o la complementaria de la misma); o contienen al menos aproximadamente 30 nucleótidos (o la complementaria de los mismos) o contienen oligonucleótidos que hibridan a lo largo de su longitud completa (o al menos aproximadamente el 70, 80 o 90% de la misma) con cualquiera de dichos fragmentos u oligonucleótidos. La longitud de los fragmentos está en función del propósito para el que se usen y/o de la complejidad del genoma de interés. Generalmente las sondas y cebadores contienen menos de aproximadamente 50, 150 ó 500 nucleótidos.

También se proporcionan plásmidos que contienen cualquiera de las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en este documento. También se proporcionan células que contienen los plásmidos. Dichas células incluyen, pero sin limitación, células bacterianas, células de levaduras, células fúngicas, células vegetales, células de insecto y células animales.

También se proporcionan sistemas de expresión en mamíferos potenciados usando líderes de señal capaces de una secreción eficaz de sHASEGP. Un ejemplo de dicha secuencia de aminoácidos de péptido líder secretor eficaz y de la proteína de fusión con sHASEGP se encuentra en las SEC ID Nº: 43 y 46.

También se proporciona un método para producir una glicoproteína sustancialmente purificada que comprende introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención unido operativamente a un promotor adecuado en una célula capaz de incorporar restos de azúcares ligados a N en el polipéptido; cultivar la célula en condiciones por las que se exprese por la célula un polipéptido codificado; y recuperar el polipéptido o polipéptidos expresados.

También se proporcionan células, generalmente células eucariotas, tales como células de mamífero y células de levadura, en las que el polipéptido sHASEGP se expresa en la superficie de las células. Dichas células se usan en ensayos de selección de fármacos para identificar compuestos que modulan la actividad del polipéptido sHASEGP. Estos ensayos, incluyendo ensayos de unión in vitro, y ensayos basados en transcripción en los que se evalúa la transducción de señales mediada directa o indirectamente, tal como por activación de factores procrecimiento, por la sHASEGP.

También se proporcionan péptidos codificados por dichas moléculas de ácido nucleico. Entre esos polipéptidos se incluye el dominio hialuronidasa de sHASEGP o un polipéptido con cambios de aminoácidos de modo que la especificidad y/o actividad hialuronidasa permanezca sustancialmente sin cambios. En particular, se proporciona una glicoproteína sHASEGP de mamífero sustancialmente purificada que incluye una forma secretada catalíticamente activa a pH neutro.

La invención también incluye un dominio catalítico hialuronidasa y puede incluir además otros dominios. La sHASEGP puede formar homodímeros y también puede formar heterodímeros con alguna otra proteína, tal como una proteína unida a membrana. También se proporciona una glicoproteína sustancialmente purificada que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la sHASEGP, determinándose el porcentaje de identidad usando algoritmos y penalizaciones por huecos convencionales que maximizan el porcentaje de identidad.

Se contemplan en este documento variantes de corte y empalme de la sHASEGP, particularmente aquellos con un dominio hialuronidasa catalíticamente activo.

En otras realizaciones, se proporcionan polipéptidos sustancialmente purificados que incluyen un dominio hialuronidasa de un polipéptido sHASEGP o una porción catalíticamente activa del mismo, pero que no incluyen la secuencia completa de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1. Entre estos hay polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% o 100% con la SEC ID Nº: 1 ó 3.

En una realización específica, se proporciona un ácido nucleico que codifica una glicoproteína hialuronidasa eucariota denominada sHASEGP. En particular, el ácido nucleico incluye la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 6, particularmente expuesta como los nucleótidos 106-1446 de la SEC ID Nº: 6 o una porción de la misma que codifique un polipéptido catalíticamente activo.

También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones de rigurosidad al menos reducida, generalmente rigurosidad moderada, más típicamente rigurosidad elevada con la SEC ID Nº: 6 o secuencias degeneradas de la misma.

En una realización, el fragmento de ácido nucleico aislado hibrida con una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 6 (o secuencias degeneradas de la misma) en condiciones de alta rigurosidad. Una sHASEGP de longitud completa se expone en la SEC ID Nº: 1 y está codificada por la SEC ID Nº: 6 o secuencias degeneradas de la misma.

También se proporcionan muteínas del dominio hialuronidasa de sHASEGP, particularmente muteínas en las que el resto Cys en el dominio hialuronidasa que está libre, es decir, que no forma enlaces disulfuro con ningún otro resto Cys en el dominio hialuronidasa, se sustituye con otra sustitución de aminoácido, típicamente, aunque no necesariamente, con una sustitución de aminoácido conservativo o una sustitución que no elimine la actividad, y muteínas en las que se elimina un sitio o sitios de glicosilación específicos.

Se proporcionan en este documento polipéptidos sHASEGP, incluyendo pero sin limitación, variantes de corte y empalme de la misma y ácidos nucleicos que codifican sHASEGP y dominios, derivados y análogos de la misma. También se proporcionan glicoproteínas hialuronidasa secretadas de cadena sencilla que tienen un extremo N-terminal funcionalmente equivalente al generado por activación de una peptidasa señal para formar sHASEGP. Existen siete sitios de glicosilación ligados a N potenciales en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de la sHASEGP como se ejemplifica en la SEC ID Nº: 1. Se forman enlaces disulfuro entre los restos Cys C60-C351 y los restos Cys C224 a C238 para formar el dominio hialuronidasa de núcleo. Sin embargo, son necesarias cisteínas adicionales en el extremo carboxi terminal para una actividad catalítica enzimática a pH neutro, de modo que la sHASEGP de los aminoácidos 36 a Cys 464 en la SEC ID Nº:1 comprende el dominio hialuronidasa de sHASEGP humana mínimamente activo. Por lo tanto, el sitio de glicosilación ligado a N N-490 no es necesario para una actividad de sHASEGP apropiada.

La glicosilación ligada a N de la sHASEGP ses crítica para su actividad catalítica y su estabilidad. Mientras que la alteración del tipo de glicano que modifica una glicoproteína puede tener efectos drásticos sobre la antigenicidad, plegamiento estructural, solubilidad y estabilidad de una proteína, se piensa que la mayoría de las enzimas no requieren glicosilación para una actividad enzimática óptima. Por lo tanto, las sHASEGP son únicas a este respecto, de modo que la eliminación de la glicosilación ligada a N puede dar como resultado una inactivación casi completa de la actividad hialuronidasa. La presencia de glicanos ligados a N es crítica para generar una sHASEGP activa. Se incluyen sistemas de expresión de proteínas adecuados para la introducción de restos de glicosilación ligados a N críticos en sHASEGP. Además, se incluye la introducción de polipéptido sHASEGP desglicosilado en presencia de extractos capaces de introducir glicanos ligados a N. En un aspecto de la invención, se describe una glicosilación compleja protegida terminalmente con sialación, aunque también se contemplan otras protegidas terminalmente con restos manosa libres. Preferiblemente, se encuentran restos de ácido siálico en los restos terminales de glicosilación ligada a N en sHASEGP.

Los oligosacáridos ligados a N se incluyen en varios tipos principales (de oligomanosa, complejos, híbridos, sulfatados), teniendo todos núcleos de 3-GlcNAc-GlcNAc (Man) unidos mediante el nitrógeno amida de restos Asn que se incluyen en secuencias -Asn-Xaa-Thr/Ser- (en las que Xaa no es Pro). Se ha descrito la glicosilación en un sitio -Asn-Xaa-Cys- para proteína de coagulación C. Con frecuencia se asignan indirectamente los sitios ligados N por aparición de un ciclo "en blanco" durante la secuenciación. La identificación positiva puede realizarse después de la liberación del oligosacárido por PNGasa F, que convierte la Asn glicosilada en Asp. Después de la liberación por PNGasa F, los oligosacáridos ligados a N pueden purificarse usando cromatografía Bio-Gel P-6, sometiéndose la combinación de oligosacáridos a cromatografía preparativa de intercambio aniónico a pH elevado (HPAEC) (Townsend et al., (1989) Anal. Biochem. 182, 1-8). Se pueden resolver ciertos isómeros de oligosacáridos usando HPAEC. Los restos fucosa desplazarán las posiciones de elución antes en el cromatograma de HPAEC, mientras que los restos ácido siálico adicionales aumentarán el tiempo de retención. El tratamiento simultáneo de glicoproteínas cuyas estructuras de oligosacáridos se conocen (por ejemplo, fetuína bovina, glicoproteína ácida a-1, ovoalbúmina, ARNasa B, transferrina) puede facilitar la asignación de los picos de oligosacáridos. Los oligosacáridos recogidos pueden caracterizarse por una combinación de análisis de composición y de enlaces por metilación (Waeghe et al; (1983), Carbohydr Res. 123, 281-304), asignándose las configuraciones anoméricas mediante espectroscopía de RMN (Van Halbeek (1993) en Methods Enzymol 230).

También se proporcionan formulaciones de sHASEGP. Pueden formularse sHASEGP en formas liofilizadas y soluciones estabilizadas. Las formulaciones que contienen iones metálicos específicos, tales como calcio, magnesio o sodio son útiles para una actividad óptima a pH neutro. Además de formulaciones en solución estabilizadas, se contemplan en este documento formulaciones de liberación lenta para una eliminación prolongada de glicosaminoglicanos. También se proporcionan en este documento kits que proporcionan jeringas preenvasadas de sHASEGP para la administración de pequeños volúmenes de sHASEGP para procedimientos quirúrgicos intraoculares y otros procedimientos de volúmenes pequeños. También se proporcionan formulaciones salinas equilibradas para uso ex vivo en procedimientos de tecnología reproductiva artificial.

También se proporciona el uso de sHASEGP en la eliminación de glicosaminoglicanos. Las sHASEGP abren canales en el espacio intersticial a través de la degradación de glicosaminoglicanos que permiten la difusión de moléculas de un tamaño menor de 500 nm. Estos canales permanecen durante un período de 24-48 horas dependiendo de la dosis y de la formulación. Dichos canales pueden usarse para facilitar la difusión de moléculas añadidas exógenamente tales como fluidos, moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos y vectores de terapia génica y otras moléculas de un tamaño inferior a 500 nm.

Las sHASEGPS también pueden usarse para eliminar glicosaminoglicanos en exceso tal como los que aparecen después de isquemia-reperfusión, inflamación, arterioesclerosis, edema, cáncer, lesión de médula espinal y otras formas de cicatrización. En algunos casos, las sHASEGP pueden suministrarse por vía sistémica mediante infusión intravenosa. Esto puede ser útil cuando el acceso local no está fácilmente disponible, tal como el corazón o el cerebro o en el caso de una neoplasia diseminada, en la que la enfermedad está por todo el cuerpo. Son preferibles sHASEGP supersialadas para aumentar la semivida en suero y la distribución sobre enzimas hialuronidasa nativas que carecen de ácidos siálicos terminales.

En algunos casos, tales como lesión de médula espinal, glaucoma y tratamientos cosméticos, se prefiere un suministro sostenido.

En otras indicaciones, es preferible una sola dosis de acción corta. La eliminación temporal de glicosaminoglicanos puede usarse para aumentar el suministro de soluciones y fármacos en espacios intersticiales. Esto puede ser útil para la difusión de anestesia y para la administración de fluidos, moléculas y proteínas terapéuticas. La administración subcutánea e intramuscular de moléculas en presencia de sHASEGP también facilita su distribución sistémica más rápidamente. Dichos métodos son muy útiles cuando el acceso intravenoso no está disponible o cuando es necesario un suministro sistémico más rápido de moléculas. El suministro de otras moléculas de gran tamaño, tales como Factor VIII, que están escasamente biodisponibles tras la administración subcutánea, puede inyectarse con sHASEGP para aumentar su disponibilidad.

También se proporcionan usos de sHASEGP para la eliminación enzimática de la matriz del cumulus que rodea los ovocitos. La eliminación de la matriz del cumulus usando una sHASEGP purificada sin los contaminantes tóxicos de la hialuronidasa obtenida de extractos permite una recuperación más suave del ovocito con mayores viabilidades. Además, pueden prepararse sHASEGP sin el uso de extractos de ganado u otros organismos que llevan virus y otros patógenos tales como encefalopatías espongiformes transmisibles.

También pueden usarse inyecciones de pequeños volúmenes de sHASEGP para uso intraocular para espacios pequeños. Pueden inyectarse sHASEGP en la cámara anterior del ojo para eliminar sustratos viscoelásticos en exceso que se administran durante la cirugía. La inyección intraocular de sHASEGP también puede usarse para reducir la presión intraocular en el glaucoma, para disolver agregados vítreos, o "desprendimientos", para limpiar una hemorragia de humor vítreo, para el tratamiento de la degeneración macular, para promover el desprendimiento de vitreorretinal en la retinopatía diabética y mezclarse con otras enzimas para promover la reformación de la córnea junto con lentes correctoras. Se reconocerá que en algunos casos, el uso de una sHASEGP de larga duración tal como una sHASEGP pegilada será deseable.

Pueden imaginarse coformulaciones de sHASEGP con otras sustancias para plumas inyectables para volúmenes pequeños o administración subcutánea rápida. Pueden formularse ejemplos tales como Epipen®, insulina y otros fluidos. Los métodos de la invención incluyen administración del polipéptido sHASEGP o composiciones farmacéuticas que contienen sHASEGP antes de, simultáneamente con o después de la administración de otras moléculas terapéuticas. La sHASEGP puede administrarse en un sitio diferente del sitio de administración de la molécula terapéutica o la sHASEGP puede administrarse en el mismo sitio que el sitio de administración de la molécula terapéutica.

Por lo tanto, se proporciona en este documento una familia de glicoproteínas hialuronidasas secretadas activas a pH neutro eucariotas denominadas sHASEGP y dominios funcionales, especialmente dominios hialuronidasa (o catalíticos) de las mismas, muteínas y otros derivados y análogos de las mismas. También se proporcionan en este documento ácidos nucleicos que codifican las sHASEGP. Además se proporcionan formulaciones y usos de dichas sHASEGP para tratar enfermedades y para el uso como enzimas modificadoras de tejidos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un mapa de vector del vector HZ24 de sHASEGP.

Descripción detallada de la invención

A. Definiciones

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un especialista en la técnica a la que pertenece la invención o invenciones. Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes publicadas y publicaciones, secuencias de Genbank, páginas web y otros materiales publicados a los que se hace referencia por toda la descripción de este documento, a menos que se indique otra cosa, se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de que exista una pluralidad de definiciones para los términos de este documento, prevalecen las de esta sección.

Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección de este tipo, se entiende que dichos identificadores pueden cambiar y que información particular en internet puede ir y venir, pero puede encontrarse información equivalente buscando en internet. La referencia a las mismas prueba la disponibilidad y la difusión pública de dicha información.

Como se usan en este documento, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácido y otros compuestos están, a menos que se indique otra cosa, de acuerdo con el uso común, abreviaturas reconocidas, o la TUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (véase, (1972) Biochem. 11: 942-944).

Como se usa en este documento, la hialuronidasa eucariota se refiere a una familia diversa de endoglucosaminidasas de glicosaminoglicanos en las que un resto glutamato en la hialuronidasa hidroliza los enlaces beta 1,4 del hialuronano y sulfatos de condroitina a través de un mecanismo catalítico ácido-base.

Son de interés particular las sHASEGP de origen de mamíferos, incluyendo seres humanos. Los especialistas en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de un solo aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, 4a Edición, The Benjamin/Cummings Pub. co., pág. 224).

Como se usa en este documento, una sHASEGP anclada a membrana, se refiere a una familia de hialuronidasas ancladas a membrana que comparten características estructurales comunes como se describen en este documento.

Como se usa en este documento, una hialuronidasa soluble se refiere a un polipéptido caracterizado por su solubilidad en condiciones fisiológicas. La HASEGP soluble puede diferenciarse por ejemplo por su reparto en la fase acuosa de una solución de Triton X-114 calentada a 37ºC (Bordier et al J Biol Chem., 25 de febrero de 1981; 256 (4): 1604-7). Por otro lado, la HASEGP anclada por lípidos se repartirá en la fase rica en detergente, pero se repartirá en la fase pobre en detergente o acuosa después el tratamiento con fosfolipasa C.

Por lo tanto, la referencia, por ejemplo, a "sHASEGP" incluye todas las glicoproteínas codificadas por la familia de genes de sHASEGP incluyendo, pero sin limitación: sHASEGP humana, sHASEGP de ratón o una molécula equivalente obtenida de cualquier otra fuente o que se ha preparado de forma sintética o que presenta la misma actividad. Las secuencias de moléculas de ácido nucleico codificantes y las secuencias de aminoácidos codificadas de sHASEGP ejemplares y/o dominios de las mismas se exponen, por ejemplo, en la SEC ID Nº: 4. El término también incluye sHASEGP con sustituciones de aminoácidos que no alteran sustancialmente la actividad de cada miembro y también incluye variantes de corte y empalme de las mismas. Los especialistas en esta técnica conocen sustituciones adecuadas, incluyendo, aunque no necesariamente, sustituciones conservativas de aminoácidos, y pueden realizarse sin eliminar la actividad biológica, tal como la actividad catalítica de la molécula resultante.

Como se usa en este documento, una sHASEGP, cada vez que se hace referencia a la misma en este documento, incluye un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1; o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 91% con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1.

En particular, se describe el polipéptido sHASEGP con los dominios hialuronidasa que se indican en la SEC ID Nº: 4. El polipéptido es un polipéptido de una o dos cadenas. También se proporcionan porciones más pequeñas del mismo que conservan la actividad hialuronidasa. Los dominios hialuronidasa de las sHASEGP varían en tamaño y constitución, incluyendo inserciones y deleciones en bucles superficiales. Por lo tanto, para los fines de este documento, el dominio catalítico es una porción de una sHASEGP, como se define en este documento, y es homólogo a un dominio de otras secuencias de tipo hialuronidasa, tales como HYAL1, HYAL2, HYAL3, que se han identificado previamente; no se reconoció sin embargo, que una forma de cadena sencilla aislada del dominio hialuronidasa humano pudiera funcionar en ensayos in vitro. Los restos aspartato y glutamato necesarios para la actividad están presentes en motivos conservados.

Como se usa en este documento, un "dominio hialuronidasa neutro de una sHASEGP soluble" se refiere a un dominio beta-1,4-endoglucosaminidasa de una sHASEGP que presenta actividad hialuronidasa a pH neutro, es soluble en condiciones como se describen y comparte homología y características estructurales con los dominios hialuronidasa de la familia de glicosil-hidrolasas pero contiene secuencias adicionales en el extremo carboxi terminal que son necesarias para la actividad a pH neutro. Por tanto, es al menos la porción mínima del dominio que presenta actividad hialuronidasa como se evalúa mediante ensayos in vitro convencionales y permanece soluble. Se contemplan en este documento dichos dominios hialuronidasa y porciones catalíticamente activas de los mismos. También se proporcionan formas truncadas del dominio hialuronidasa que incluyen el fragmento más pequeño del mismo que actúa catalíticamente como una forma de cadena sencilla.

Un dominio hialuronidasa de una sHASEGP, cada vez que se hace referencia al mismo en este documento, incluye al menos una o todas de o cualquier combinación de o una porción catalíticamente activa de: un polipéptido glicoproteico ligado a N que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1; un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de rigurosidad reducida, moderada o elevada con la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 6; un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N: 1; un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1; y/o un dominio hialuronidasa de un polipéptido codificado por una variante de corte y empalme de la sHASEGP.

Por lo tanto, para los fines de este documento, el dominio hialuronidasa es una porción de una sHASEGP, como se define en este documento, y es homólogo a un dominio de otras sHASEGP. Como con la clase más grande de enzimas de la familia de hialuronidasas, los dominios catalíticos de sHASEGP comparten un alto grado de identidad de secuencia de amino ácidos. Los restos Asp y Glu necesarios para la actividad están presentes en motivos conservados.

Por forma activa se entiende una forma activa in vivo y/o in vitro. Como se describe en este documento, el dominio hialuronidasa también puede existir como una glicoproteína secretada soluble. Se muestra en este documento que, al menos in vitro, las formas de cadena sencilla de las sHASEGP y los dominios catalíticos o porciones enzimáticamente activas de las mismas (típicamente truncamientos C-terminales) presentan actividad hialuronidasa. Por lo tanto, se proporcionan en este documento formas aisladas de los dominios hialuronidasa de sHASEGP y su uso en ensayos de selección de fármacos in vitro para la identificación de agentes que modulen la actividad de las mismas.

Como se usa en este documento, el dominio catalíticamente activo de una sHASEGP se refiere al dominio endoglucosaminidasa activo a pH neutro como se define por la actividad in vitro hacia un sustrato de glicosaminoglicano.

Las sHASEGP de interés incluyen las que son activas frente a sulfatos de condroitina y proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) in vivo e in vitro; y las que son activas frente a hialuronano. Como se usa en este documento, una sHASEGP humana es una codificada por un ácido nucleico, tal como ADN, presente en el genoma de un ser humano, incluyendo todas las variantes alélicas y variaciones conservativas siempre que no sean variantes que se encuentren en otros mamíferos.

Como se usa en este documento, un ácido nucleico que codifica un dominio hialuronidasa o porción catalítica activa de una "sHASEGP" debe interpretarse que se refiere a un ácido nucleico que codifica sólo el dominio hialuronidasa de cadena sencilla detallado o una porción activa del mismo y no las otras porciones contiguas de la sHASEGP como una secuencia continua.

Como se usan en este documento, los términos "enfermedad" o "trastorno" se refieren a una afección patológica en un organismo que es el resultado de, por ejemplo, una infección o defecto genético, y que se caracteriza por síntomas identificables.

Como se usa en este documento, una variante de corte y empalme se refiere a una variante producida por procesamiento diferencial de un transcrito primario de ácido nucleico genómico, tal como ADN, que da como resultado más de un tipo de ARNm. Se proporcionan en este documento variantes de corte y empalme de sHASEGP.

Como se usa en este documento, el dominio hialuronidasa de una proteína sHASEGP se refiere al dominio hialuronidasa de una sHASEGP que presenta una actividad endoglucosaminidasa a pH neutro. Por lo tanto, es al menos la porción mínima de la proteína que presenta actividad endoglucosaminidasa como se evalúa por ensayos convencionales in vitro. Los dominios hialuronidasa humanos ejemplares incluyen al menos una porción suficiente de secuencias de aminoácidos expuestas en la SEC ID Nº: 4 que presentan actividad endoglucosaminidasa.

También se contemplan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene actividad endoglucosaminidasa en un ensayo hialuronidasa in vitro y que tienen una identidad de secuencia de al menos el 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la longitud completa de un dominio hialuronidasa de un polipéptido sHASEGP, o que hibrida a lo largo de su longitud completa o a lo largo de al menos aproximadamente el 70%, 80% o 90% de la longitud completa con un ácido nucleico que codifica un dominio hialuronidasa, particularmente en condiciones de rigurosidad moderada, generalmente elevada.

Para los dominios hialuronidasa, los restos en la región N-terminal pueden ser críticos aunque no suficientes para su actividad. Se muestra en este documento que el dominio hialuronidasa de la sHASEGP es catalíticamente activo. Por lo tanto, el dominio hialuronidasa requiere generalmente los aminoácidos N-terminales del mismo para su actividad; la porción C-terminal puede estar truncada hasta el último resto cisteína aunque requiere aminoácidos adicionales para ser óptimamente activa. La cantidad que puede eliminarse puede determinarse empíricamente ensayando el polipéptido para determinar su actividad hialuronidasa en un ensayo in vitro que evalúe la escisión catalítica.

Por lo tanto, se contemplan porciones más pequeñas de los dominios hialuronidasa, particularmente los dominios de cadena sencilla de la misma que conservan actividad hialuronidasa. Dichas versiones más pequeñas son generalmente versiones truncadas C-terminales de los dominios hialuronidasa. Los dominios hialuronidasa varían en tamaño y constitución, incluyendo inserciones y deleciones en bucles superficiales. Dichos dominios presentan una estructura conservada, incluyendo al menos una característica estructural, tal como el donador de protones y/o otras características de dominios hialuronidasa de endoglucosaminidasas. Por lo tanto, para los fines de este documento, el dominio hialuronidasa es una porción de cadena sencilla de una sHASEGP, como se define en este documento, pero es homólogo en sus características estructurales y en la retención de una similitud u homología de secuencia con el dominio hialuronidasa de otras secuencias de tipo hialuronidasa. La glicoproteína presenta actividad hialuronidasa como una cadena sencilla.

Como se usa en este documento, por homólogo se entiende una identidad de secuencia de ácido nucleico superior al 25%, tal como del 25%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%. Si es necesario, se especificará el porcentaje de homología. Los términos "homología" e "identidad" se usan con frecuencia indistintamente. En general, las secuencias se alinean de modo que se obtenga el mayor orden de coincidencias (véase, por ejemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part/, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carillo et al. (1988) et al. (1988) Slam J Applied Math 48]: 1073).

Mediante la identidad de secuencia, se determina el número de aminoácidos conservados mediante programas de algoritmos de alineamiento convencionales y se usan con las penalizaciones por huecos por defecto establecidas por cada proveedor. Las moléculas de ácido nucleico sustancialmente homólogas hibridarían típicamente a una rigurosidad moderada o a una rigurosidad elevada a todo lo largo de la longitud del ácido nucleico o a lo largo de al menos aproximadamente el 70%, 80% o 90% de la molécula de ácido nucleico de longitud completa de interés. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de codones en la molécula de ácido nucleico que hibrida.

Puede determinarse si dos moléculas de ácido nucleico cualesquiera tienen secuencias de nucleótidos que tienen una "identidad" de al menos, por ejemplo, el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% usando algoritmos informáticos conocidos tales como el programa "FASTA", usando por ejemplo los parámetros por defecto como en Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85]: 2444 (otros programas incluyen el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S] [F.], [et al, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990), Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, y [CARRILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por ejemplo, la función BLAST de la base de datos del National Center for Biotechnology Information puede usarse para determinar la identidad. Otros programas disponibles en el mercado o públicamente incluyen, el PROGRAMA "MEGALIGN" de DNASTAR (Madison, WI) y el programa "Gap" del University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) (Madison, WI)). Puede determinarse el porcentaje de homología o identidad de proteínas y/o moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, por comparación de la información de secuencia usando un programa informático GAP, por ejemplo, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443, según se revisó por Smith y Waterman Adv. Appl. Matemáticas (1981) 2:482). En resumen, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 por cada hueco y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización por huecos terminales. Por lo tanto, como se usa en este documento, el término "identidad" representa una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de ensayo y uno de referencia.

Como se usa en este documento, la expresión "identidad de al menos el 90% con" se refiere a porcentajes de identidad del 90 al 99,99 respecto a los polipéptidos de referencia. Una identidad a un nivel del 90% o más es indicativa del hecho de que, suponiendo para fines de ejemplificación que se compara una longitud de polinucleótido de ensayo y de referencia de 100 aminoácidos. No más del 10% (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos en el polipéptido de ensayo difieren de los del polipéptido de referencia. Pueden realizarse comparaciones similares entre polinucleótidos de ensayo y de referencia. Dichas diferencias pueden representarse como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente a lo largo de la longitud completa de una secuencia de aminoácidos o pueden agruparse en una o más localizaciones de longitud variable hasta el máximo permisible, por ejemplo, una diferencia de 10/100 aminoácidos (una identidad de aproximadamente el 90%). Las diferencias se definen como sustituciones o deleciones de ácidos nucleicos o aminoácidos. A nivel de homologías o identidades por encima de aproximadamente el 85-90%, el resultado debería ser independiente del programa y del ajuste de parámetros por huecos; dichos altos niveles de identidad pueden evaluarse fácilmente, con frecuencia sin depender de un programa informático.

Como se usa en este documento, un cebador se refiere a un oligonucleótido que contiene dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, típicamente más de tres, a partir del que puede iniciarse la síntesis de un producto de extensión de cebador. Las condiciones experimentales que llevan a la síntesis incluyen la presencia de nucleósidos trifosfato y un agente para la polimerización y la extensión, tal como una ADN polimerasa y un tampón, temperatura y pH adecuados.

Como se usa en este documento, los animales incluyen cualquier animal, tal como, pero sin limitación, cabras, vacas, ciervos, ovejas, roedores, cerdos y seres humanos. Los animales no humanos, excluyen los seres humanos como el animal contemplado. Las sHASEGP proporcionadas en este documentos son de cualquier origen, animal, vegetal, procariota y fúngico. La mayoría de las sHASEGP son de origen animal, incluyendo origen de mamífero.

Como se usa en este documento, la terapia génica implica la transferencia de un ácido nucleico heterólogo, tal como DNA, a ciertas células, células diana de un mamífero, particularmente un ser humano, con un trastorno o afeciones para las que se busque dicha terapia. El ácido nucleico, tal como ADN, se introduce en las células diana seleccionadas de tal forma que el ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, se expresa y se produce un producto terapéutico codificado por el mismo.

Como alternativa, el ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, puede mediar de alguna forma la expresión de ADN que codifica el producto terapéutico, o puede codificar un producto, tal como un péptido o ARN que de algún modo medie, directa o indirectamente, la expresión de un producto terapéutico. También puede usarse terapia génica para suministrar un ácido nucleico que codifique un producto génico que sustituya a un gen defectuoso o complemente un producto génico producido por el mamífero o la célula en la que se introduce. El ácido nucleico introducido puede codificar un compuesto terapéutico, tal como un inhibidor de factor de crecimiento del mismo, o un factor de necrosis tumoral o inhibidor del mismo, tal como un receptor por lo tanto, que no se produzca normalmente en el hospedador mamífero o que no se produzca en cantidades terapéuticamente eficaces o en un momento terapéuticamente útil. El ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, que codifica el producto terapéutico puede modificarse antes de la introducción en las células del hospedador afectado para aumentar o alterar de otro modo el producto o la expresión del mismo. La tera-pia génica también puede implicar el suministro de un inhibidor o represor u otro modulador de la expresión génica.

Como se usa en este documento, un ácido nucleico heterólogo es un ácido nucleico que (si es ADN codifica ARN) y proteínas que no se producen normalmente in vivo por la célula en la que se expresa o que media o codifica mediadores que alteran la expresión de un ácido nucleico endógeno, tal como ADN, afectando a la transcripción, traducción u otros procesos bioquímicos regulables. También puede hacerse referencia a un ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, como un ácido nucleico extraño, tal como ADN. Cualquier ácido nucleico, tal como ADN que un especialista en la técnica reconocería o consideraría heterólogo o extraño para la célula en la que se exprese se incluye en este documento mediante la expresión ácido nucleico heterólogo; el ácido nucleico heterólogo incluye un ácido nucleico añadido de forma exógena que también se exprese de forma endógena. Los ejemplos de ácidos nucleicos heterólogos incluyen, pero sin limitación, un ácido nucleico que codifique proteínas marcadoras rastreables, tales como una proteína que confiera una resistencia a fármacos, un ácido nucleico que codifique sustancias terapéuticamente eficaces, tal como agentes anticancerosos, enzimas y hormonas y un ácido nucleico tal como ADN, que codifique otros tipos de proteínas, tales como anticuerpos. Los anticuerpos que están codificados por el ácido nucleico heterólogo pueden secretarse o expresarse en la superficie de la célula en la que se ha introducido el ácido nucleico heterólogo.

Generalmente el ácido nucleico heterólogo no es endógeno para la célula en la que se introduce, pero se ha obtenido de otra célula o se ha preparado sintéticamente.

Generalmente, aunque no necesariamente, dicho ácido nucleico codifica ARN y proteínas que no se producen normalmente por la célula en la que se expresa.

Como se usa en este documento, un producto terapéuticamente eficaz es un producto que está codificado por un ácido nucleico heterólogo, típicamente ADN, que tras la introducción del ácido nucleico en un hospedador, se expresa un producto que mejora o elimina los síntomas, manifestaciones de una enfermedad heredada o adquirida, o que cura la enfermedad.

Como se usa en este documento, relatar que una glicoproteína consiste esencialmente en el dominio hialuronidasa significa que la única porción de sHASEGP del polipéptido es un dominio hialuronidasa o una porción catalítica activa del mismo. El polipéptido puede incluir opcionalmente y generalmente incluirá secuencias de aminoácidos adicionales no derivadas de sHASEGP.

Como se usa en este documento, un dominio se refiere a una porción de una molécula, por ejemplo glicoproteínas o los ácidos nucleicos codificantes, que es estructuralmente y/o funcionalmente diferente de otras porciones de la molécula.

Como se usa en este documento, la hialuronidasa se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis de glicosaminoglicanos.

Para mayor claridad, la referencia a hialuronidasa se refiere a todas las formas, y se designarán específicamente las formas particulares. Para los fines de este documento, el dominio hialuronidasa incluye las formas unida a membrana y soluble de una proteína sHASEGP.

Como se usan en este documento, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos peptidonucleicos (PNA) y una mezcla de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser mono- o bicatenarios. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, opcionalmente marcados con un marcador detectable tal como un marcador fluorescente o radiomarcador, se contemplan moléculas monocatenarias. Dichas moléculas son típicamente de una longitud tal que su diana es estadísticamente única o de bajo número de copias (típicamente menor de 5, generalmente menor de 3) para sondar o cebar una genoteca. Generalmente una sonda o cebador contiene al menos 14,16 ó 30 posiciones contiguas de complementariedad de secuencia con o identidad con un gen de interés. Las sondas y cebadores pueden ser de 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos de longitud.

Como se usa en este documento, un ácido nucleico que codifica un fragmento o porción de una sHASEGP se refiere a un ácido nucleico que codifica sólo el fragmento o porción relatada de sHASEGP y no las otras porciones contiguas de la sHASEGP.

Como se usa en este documento, una unión operativa de un ácido nucleico heterólogo con secuencias reguladoras y efectoras de nucleótidos, tales como promotores, potenciadores, sitios de terminación de la transcripción y de la traducción y otras secuencias señal se refiere a la relación entre dicho ácido nucleico, tal como ADN, y dichas secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la unión operativa de ADN heterólogo a un promotor se refiere a la relación física entre el ADN y el promotor de modo que la transcripción de dicho ADN se inicia a partir del promotor mediante una ARN polimerasa que reconoce específicamente, se une a y transcribe el ADN en la fase de lectura. Por lo tanto, las expresiones unido operativamente o asociado funcionalmente se refieren a la relación funcional de un ácido nucleico, tal como ADN, con secuencias reguladoras y efectoras de nucleótidos tales como promotores, potenciadores, sitios de terminación de la transcripción y de la traducción y otras secuencias señal. Por ejemplo, la unión operativa de ADN a un promotor se refiere a la relación física y funcional entre el ADN y el promotor de modo que la transcripción de dicho ADN se inicia a partir del promotor mediante una ARN polimerasa que reconoce específicamente, se une a y transcribe el ADN. Para optimizar la expresión y/o la transcripción in vitro puede ser necesario eliminar, añadir o alterar porciones 5' no traducidas de los clones para eliminar codones de inicio de la traducción (es decir, inicio) extra alternativos potencialmente inapropiados u otras secuencias que pueden interferir con o reducir la expresión, a nivel de transcripción o traducción. Como alternativa, pueden insertarse sitios de unión al ribosoma de consenso (véase, por ejemplo, Kozak J. Biol. Chem. 266: 19867-19870 (1991)) inmediatamente 5' del codón de inicio y pueden aumentar la expresión. Puede determinarse empíricamente cómo de deseable (o necesaria) es dicha modificación.

Como se usa en este documento, una secuencia complementaria con al menos una porción de una ARN, en relación con oligonucleótidos antisentido, se refiere a una secuencia que tiene una complementariedad suficiente para ser capaz de hibridar con el ARN, generalmente en condiciones de rigurosidad moderadas u elevadas, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleico antisentido de sHASEGP bicatenarios, puede ensayarse por lo tanto una sola cadena del dúplex de ADN (o ARNbc) o puede ensayarse la formación de un tríplex. La capacidad para hibridar depende del grado de complementariedad y de la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, cuanto más largo es el ácido nucleico que hibrida, más emparejamientos erróneos de bases con un ARN que codifica sHASEGP puede contener y aún así formar un dúplex estable (o tríplex, según sea el caso). Un especialista en la técnica puede determinar un grado tolerable de emparejamientos erróneos mediante el uso de procedimientos convencionales para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.

Para los fines de este documento, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos en cualquiera de las sHASEGP y dominios hialuronidasa de las mismas con tal de que la proteína resultante presente actividad hialuronidasa. Las sustituciones de aminoácidos contempladas incluyen sustituciones conservativas, tales como las expuestas en la Tabla 1, que no eliminan la actividad proteolítica. Como se describen en este documento, también se contemplan sustituciones que alteran propiedades de las proteínas, tales como eliminación de sitios de escisión y otros sitios de este tipo; dichas sustituciones generalmente no son conservativas pero pueden efectuarse fácilmente por los especialistas en la técnica.

Las sustituciones conservativas adecuadas de aminoácidos se conocen por los especialistas en la técnica y pueden realizarse generalmente sin alterar la actividad biológica, por ejemplo, la actividad enzimática de la molécula resultante. Los especialistas en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de un solo aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. Biology of the Gene, 4a Edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., pág. 224). También se incluye en la definición el fragmento catalíticamente activo de una sHASEGP, particularmente, una porción hialuronidasa de cadena sencilla. Se realizan sustituciones de aminoácidos conservativas, por ejemplo, de acuerdo con las expuestas en la Tabla 1 de la forma siguiente:

Tabla 1 Resto original Sustitución conservativa Ala (A) Gl

Reivindicaciones:

1. Una glicoproteína sustancialmente purificada que comprende un polipéptido hialuronidasa soluble activo a pH neutro que contiene al menos un resto azúcar ligado a N, en el que:

el resto azúcar ligado a N está unido covalentemente a un resto asparagina del polipéptido;

la glicoproteína sustancialmente purificada comprende una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1 o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 91% con una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1; y

la glicoproteína sustancialmente purificada es soluble.

2. Una glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 1, en la que el polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 36-482 de la SEC ID Nº: 1 o los aminoácidos 1-482 de la SEC ID Nº: 1.

3. La glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 2, en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 48.

4. La glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 1, en la que el polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 que está truncada en un resto aminoacídico que es o está entre los restos aminoacídicos 467 y 483.

5. La glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 1, en la que el polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 que está truncada en un resto aminoacídico seleccionado de entre 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483.

6. La glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 5, en la que el polipéptido se secreta en células CHO.

7. Una glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 1, en la que el polipéptido está modificado con un polímero.

8. Una glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 7, en la que el polímero es PEG o dextrano.

9. Un método para producir una glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 1, que comprende:

introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la reivindicación 1 unido operativamente a un promotor adecuado en una célula capaz de incorporar restos de azúcares ligados a N en el polipéptido;

cultivar la célula en condiciones por las que se exprese un polipéptido codificado por la célula; y

recuperar el polipéptido o polipéptidos expresados.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la célula es una célula CHO.

11. Una composición farmacéutica que comprende una glicoproteína de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, en la que el polipéptido se produce por expresión en células de mamífero de una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1-482 de la SEC ID Nº: 1 o una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 36-482 de la SEC ID Nº: 1.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en la que la célula de mamífero es una célula CHO.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, que comprende además un agente farmacéuticamente activo.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, en la que el agente farmacéuticamente activo se selecciona de entre un agente quimioterápico, un agente analgésico, un agente antiinflamatorio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonicida, un agente antiparkinsoniano, un gente antimalárico, un agente anticonvulsivante, un agente antidepresor, un agente antiartrítico, un agente antifúngico, un agente antihipertensor, un agente antipirético, un agente antiparasitario, un agente antihistamínico, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente alfa-bloqueante, un agente anestésico, un agente broncodilatador, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueante beta-adrenérgico, un agente bloqueante de canales de calcio, un agente farmacológico cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente descongestivante, un agente diurético, un agente depresor, un agente de diagnóstico, un agente electrolítico, un agente hipnótico, un agente hormonal, un agente hiperglucemiante, un agente relajante muscular, un agente de contracción muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpaticomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un agente simpaticomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente vitamínico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, una molécula orgánica o un inductor del sueño.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, en la que el agente farmacéuticamente activo se selecciona de entre insulina, una citocina, un anticuerpo y un anticuerpo monoclonal.

17. Un conjugado que comprende una glicoproteína soluble de la reivindicación 1 o que comprende un dominio de una proteína soluble de la reivindicación 1.

18. Una composición de cualquiera de las reivindicaciones 11-16 para el uso en el tratamiento de un exceso de glicosaminoglicanos; para tratar un tumor; para tratar un trastorno cardiovascular; para aumentar la penetración de agentes quimioterápicos en tumores sólidos; para el uso en la inducción de licuefacción del humor vítreo; para el uso en el suministro de una molécula de menos de 500 nm de tamaño a un tejido que contenga cantidades excesivas de glicosaminoglicanos.

19. Uso de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 11-16 en la formulación de un medicamento para tratar un exceso de glicosaminoglicanos; para tratar un trastorno cardiovascular; para aumentar la penetración de agentes quimioterápicos en tumores sólidos; para el uso en la inducción de licuefacción del humor vítreo; o para el uso en el suministro de una molécula menor de 500 nm de tamaño a un tejido que contenga cantidades excesivas de glicosaminoglicanos


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