GLICOPROTEINA HIALURONIDASA SOLUBLE (SHASEGP), PROCESO PARA PREPARARLA, USOS Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LA COMPRENDEN.

Una glicoproteína sustancialmente purificada que comprende un polipéptido hialuronidasa soluble activo a pH neutro que contiene al menos un resto azúcar ligado a N

, en el que:

el resto azúcar ligado a N está unido covalentemente a un resto asparagina del polipéptido;

la glicoproteína sustancialmente purificada comprende una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1 o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 91% con una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1; y

la glicoproteína sustancialmente purificada es soluble

Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W04006656US.

Solicitante: HALOZYME, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 11588 SORRENTO VALLEY ROAD, S17,SAN DIEGO, CA 92121.

Inventor/es: FROST, GREGORY I., BOOKBINDER,LOUIS,H, KUNDU,ANIRBAN.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 11 de Noviembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/26 (actúan sobre enlaces alfa-glucosídicos-1, 4, p. ej. hialuronidasa, invertasa, amilasa)

Clasificación PCT:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/20 (Bacterias; Sus medios de cultivo)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N9/00 (Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/06 (preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido... > C07H21/04 (con desoxirribosilo como radical sacárido)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N15/00 (Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/24 (actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2))

Clasificación antigua:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K31/00 (Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos)
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Fragmento de la descripción:

Glicoproteína hialuronidasa soluble (sHASEGP), proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden.

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de acuerdo con 35 U.S.C. NAK 119 (e) respecto al documento U.S. de Número de Serie 60/452.360, presentado el 5 de marzo de 2003.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a glicoproteínas hialuronidasa solubles activas a pH neutro (sHASEGP), porciones de las mismas, particularmente dominios hialuronidasa. Más específicamente, la invención se refiere a modificaciones químicas, composiciones farmacéuticas, plásmidos de expresión, métodos para la fabricación y métodos terapéuticos que usan las glicoproteínas hialuronidasas y dominios de las mismas y las moléculas de ácido nucleico codificantes para la modificación terapéutica de glicosaminoglicanos en el tratamiento de una enfermedad y para el uso para aumentar la difusión de otras moléculas inyectadas de menos de 200 nanómetros de diámetro en un animal.

Información antecedente

Los glicosaminoglicanos (GAG) son polisacáridos lineales complejos de la matriz extracelular (ECM). Los GAG se caracterizan por estructuras disacáridas repetidas de una hexosamina N-sustituida y un ácido urónico, [hialuronano (HA), sulfato de condroitina (CS), condroitina (C), sulfato de dermatán (DS), sulfato de heparán (HS), heparina (H)], o una galactosa, [sulfato de queratán (KS)]. Excepto por el HA, todos se presentan unidos covalentemente a proteínas de núcleo. Los GAG con sus proteínas de núcleo se denominan estructuralmente proteoglicanos (PG).

El hialuronano (HA) se encuentra en mamíferos predominantemente en tejidos conjuntivos, piel, cartílago y en líquido sinovial. El hialuronano también es el constituyente principal del humor vítreo del ojo. En el tejido conjuntivo, el agua de hidratación asociada con el hialuronano genera espacios entre tejidos, generando de este modo un entorno que conduce a movimiento y proliferación celular. El hialuronano desempeña un papel clave en fenómenos biológicos asociados con la motilidad celular incluyendo el desarrollo rápido, regeneración, reparación, embriogénesis, desarrollo embrionario, cicatrización de heridas, angiogénesis y oncogénesis (Toole 1991 Cell Bioll Extracell. Matrix, Hay (ed.), Plenum Press, Nueva York, 1384-1386; Bertrand et al. 1992 Int. J. Cancer 52: 1-6; Knudson et al, 1993 FASEB J. 7: 1233-1241). Además, los niveles de hialuronano se correlacionan con la agresividad tumoral (Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20: 600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36: 2133-2139; Kimata et al. 1983 Cáncer Res.43: 1347-1354).

El HA se encuentra en la matriz extracelular de muchas células, especialmente en tejidos conjuntivos blandos. Al HA se le han asignado diversas funciones fisiológicas, tales como en la homeostasis del agua y de proteínas plasmáticas (Laurent TC et al (1992) FASEB J 6: 2397-2404). La producción de HA aumenta en células en proliferación y puede desempeñar un papel en la mitosis. También se ha implicado en la locomoción y en la migración celular. El HA parece desempeñar papeles importantes en la regulación, desarrollo y diferenciación celular (Laurent et al, anteriormente).

El HA se ha usado en la medicina clínica. Su propiedades reológicas y protectoras de tejidos han demostrado utilidad en la cirugía oftálmica para proteger el endotelio corneal durante la cirugía de cataratas. El HA sérico es diagnóstico de enfermedad hepática y diversas afecciones inflamatorias, tales como artritis re6umatoide. El edema intersticial causado por acumulación de HA puede causar disfunción en diversos órganos (Laurent et al, anteriormente).

Las interacciones proteicas del hialuronano también están implicadas en la estructura de la matriz extracelular o "sustancia fundamental".

Las hialuronidasas son un grupo de enzimas activas a pH neutro y a pH ácido que se encuentran por todo el reino animal. Las hialuronidasas varían con respecto a la especificidad de sustrato y mecanismo de acción.

Existen tres clases generales de hialuronidasas:

1. Hialuronidasas de tipo mamífero, (EC 3.2.1.35) que son endo-beta-N-acetilhexosaminidasas con tetrasacáridos y hexasacáridos como los productos finales principales. Tienen actividades tanto hidrolítica como transglicosidasa y pueden degradar el hialuronano y los sulfatos de condroitina (CS), en concreto C4-S y C6-S.

2. Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.99.1), degradan el hialuronano y en diversos grados CS y DS. Son endo-beta-N-acetilhexosaminidasas que funcionan mediante una reacción de beta-eliminación que produce principalmente productos finales disacáridos.

3. Las hialuronidasas (EC 3.2.1.36) de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos son endo-beta-glucuronidasas que generan productos finales tetrasacáridos y hexasacáridos a través de la hidrólisis del enlace beta 1-3.

Las hialuronidasas de mamífero pueden dividirse adicionalmente en dos grupos: enzimas activas a pH neutro y activas a pH ácido. Existen seis genes de tipo hialuronidasa en el genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3 HYAL4 HYALP1 y PH20/SPAM1. HYALP1 es un pseudogén y no se ha demostrado que HYAL3 posea actividad enzimática hacia ningún sustrato conocido. HYAL4 es una condroitinasa y carece de actividad hacia hialuronano. HYAL1 es la enzima activa a pH ácido prototípica y PH20 es la enzima activa a pH neutro prototípica. Las hialuronidasas activas a pH ácido, tales como HYAL1 y HYAL2, carecen de actividad catalítica a pH neutro. Por ejemplo, la HYAL1 no tiene actividad catalítica in vitro sobre pH 4,5 (Frost et al Anal Biochemistry, 1997). HYAL2 es una enzima activa a pH ácido con una actividad específica muy baja in vitro.

Las enzimas de tipo hialuronidasa también pueden estar caracterizadas por las que están inmovilizadas en la membrana plasmática a través de un anclaje glicosilfosfatidilinositol tal como HYAL2 humana y PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 15 de abril de 2003; 100 (8): 4580-5, Phelps et al., Science 1988) y las que son solubles, tales como HYAL1 humana (Frost et al, Biochem Biophys Res Commun. 9 de julio de 1997; 236 (1): 10-5). Sin embargo, existen variaciones entre especies: por ejemplo, la PH20 bovina se unen muy débilmente a la membrana plasmática y no se ancla mediante un anclaje sensible a fosfolipasa (Lalancette et al, Biol Reprod., agosto 2001; 65 (2): 628-36.). Esta característica única de la hialuronidasa bovina ha permitido el uso de la enzima hialuronidasa de testículos bovinos soluble como un extracto para uso clínico (Wydase®, Hyalase®). Otras especies de PH20 son enzimas ancladas a lípidos que no son insolubles sin el uso de detergentes o lipasas. Por ejemplo, la PH20 humana se ancla a la membrana plasmática a través de un anclaje GPI. Los intentos para preparar construcciones de ADN de PH20 humana que no introducirían un anclaje lipídico en el polipéptido dieron como resultado una enzima catalíticamente inactiva o una enzima insoluble (Arming et al Eur J Biochem. 1 de Agosto de 1997;247 (3): 810-4). La hialuronidasa de esperma de macaco de origen natural se encuentra en forma tanto soluble como unida a membrana. Mientras que la forma unida a membrana de 64 kDa posee actividad enzimática a pH 7,0, la forma de 54 kDa sólo es activa a pH 4,0 (Cherr et al, Dev Biol. 10 de abril de 1996;...

 


Reivindicaciones:

1. Una glicoproteína sustancialmente purificada que comprende un polipéptido hialuronidasa soluble activo a pH neutro que contiene al menos un resto azúcar ligado a N, en el que:

el resto azúcar ligado a N está unido covalentemente a un resto asparagina del polipéptido;

la glicoproteína sustancialmente purificada comprende una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1 o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 91% con una secuencia de aminoácidos incluida en la SEC ID Nº: 1; y

la glicoproteína sustancialmente purificada es soluble.

2. Una glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 1, en la que el polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 36-482 de la SEC ID Nº: 1 o los aminoácidos 1-482 de la SEC ID Nº: 1.

3. La glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 2, en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 48.

4. La glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 1, en la que el polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 que está truncada en un resto aminoacídico que es o está entre los restos aminoacídicos 467 y 483.

5. La glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 1, en la que el polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 que está truncada en un resto aminoacídico seleccionado de entre 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483.

6. La glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 5, en la que el polipéptido se secreta en células CHO.

7. Una glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 1, en la que el polipéptido está modificado con un polímero.

8. Una glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 7, en la que el polímero es PEG o dextrano.

9. Un método para producir una glicoproteína sustancialmente purificada de la reivindicación 1, que comprende:

introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la reivindicación 1 unido operativamente a un promotor adecuado en una célula capaz de incorporar restos de azúcares ligados a N en el polipéptido;

cultivar la célula en condiciones por las que se exprese un polipéptido codificado por la célula; y

recuperar el polipéptido o polipéptidos expresados.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la célula es una célula CHO.

11. Una composición farmacéutica que comprende una glicoproteína de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, en la que el polipéptido se produce por expresión en células de mamífero de una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1-482 de la SEC ID Nº: 1 o una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 36-482 de la SEC ID Nº: 1.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en la que la célula de mamífero es una célula CHO.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, que comprende además un agente farmacéuticamente activo.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, en la que el agente farmacéuticamente activo se selecciona de entre un agente quimioterápico, un agente analgésico, un agente antiinflamatorio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonicida, un agente antiparkinsoniano, un gente antimalárico, un agente anticonvulsivante, un agente antidepresor, un agente antiartrítico, un agente antifúngico, un agente antihipertensor, un agente antipirético, un agente antiparasitario, un agente antihistamínico, un agente agonista alfa-adrenérgico, un agente alfa-bloqueante, un agente anestésico, un agente broncodilatador, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueante beta-adrenérgico, un agente bloqueante de canales de calcio, un agente farmacológico cardiovascular, un agente anticonceptivo, un agente descongestivante, un agente diurético, un agente depresor, un agente de diagnóstico, un agente electrolítico, un agente hipnótico, un agente hormonal, un agente hiperglucemiante, un agente relajante muscular, un agente de contracción muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpaticomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un agente simpaticomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente viricida, un agente vitamínico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, una molécula orgánica o un inductor del sueño.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, en la que el agente farmacéuticamente activo se selecciona de entre insulina, una citocina, un anticuerpo y un anticuerpo monoclonal.

17. Un conjugado que comprende una glicoproteína soluble de la reivindicación 1 o que comprende un dominio de una proteína soluble de la reivindicación 1.

18. Una composición de cualquiera de las reivindicaciones 11-16 para el uso en el tratamiento de un exceso de glicosaminoglicanos; para tratar un tumor; para tratar un trastorno cardiovascular; para aumentar la penetración de agentes quimioterápicos en tumores sólidos; para el uso en la inducción de licuefacción del humor vítreo; para el uso en el suministro de una molécula de menos de 500 nm de tamaño a un tejido que contenga cantidades excesivas de glicosaminoglicanos.

19. Uso de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 11-16 en la formulación de un medicamento para tratar un exceso de glicosaminoglicanos; para tratar un trastorno cardiovascular; para aumentar la penetración de agentes quimioterápicos en tumores sólidos; para el uso en la inducción de licuefacción del humor vítreo; o para el uso en el suministro de una molécula menor de 500 nm de tamaño a un tejido que contenga cantidades excesivas de glicosaminoglicanos