Procedimiento de diagnóstico prenatal en célula fetal aislada de sangre materna.

Procedimiento de diagnóstico prenatal en células fetales aisladas de sangre materna que comprende las etapas siguientes:



a) la filtración de una muestra de sangre materna pura o diluida en un filtro de porosidad comprendida entre 6 y 15 μm, de forma que se concentren en el filtro según su tamaño ciertas células circulantes, y en particular células de origen fetal que tengan un tamaño comprendido entre 14 y 17 μm;

b) el análisis y la caracterización de las células retenidas aisladas en el filtro para la búsqueda de la presencia de un marcador o marcadores inmunológicos y/o citológicos y/o genéticos, con el fin de identificar su naturaleza epitelial y obtener una presunción de su origen fetal o materno; y la recogida individual de la célula o células epiteliales cuyo origen fetal se supone;

c) la demostración, mediante análisis genético, del origen fetal de una célula o células de origen fetal supuesto recogidas individualmente en la etapa b; y

d) la búsqueda de anomalías genéticas en el genoma o genomas de células cuyo origen fetal se ha demostrado en la etapa c).

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2002/001505.

Solicitante: INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM).

Inventor/es: PATERLINI-BRECHOT,PATRIZIA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/38 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Cemento; Cal; Mortero; Yeso; Ladrillos; Productos cerámicos; Vidrio.

PDF original: ES-2543709_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento de diagnóstico prenatal en célula fetal aislada de sangre materna

La presente Invención está relacionada con un nuevo procedimiento de diagnóstico prenatal no invasivo aplicado a partir de una muestra de sangre materna. Dicho procedimiento permite el diagnóstico prenatal en células fetales epiteliales no apoptóticas aisladas de sangre materna después de su enriquecimiento por filtración, su análisis morfológico o ¡nmunológico y genético. Las ventajas de este procedimiento son, en particular, su inocuidad para la madre o el feto y la muy alta sensibilidad y especificidad del diagnóstico. Permite la detección precoz de una anomalía genética o cromosómica del feto, de una patología genética o Infecciosa (vírica, bacteriana o parasitaria) del feto, de un genotipo preciso y, en particular, del sexo genético del feto.

Los procedimientos de diagnóstico prenatal apuntan especialmente a obtener Informaciones genéticas sobre un feto o un embrión. La búsqueda de informaciones genéticas sobre un feto consiste, o bien en Identificar la presencia de un alelo específico de un gen dado o de una combinación de alelos sobre una secuencia dada de ADN fetal, o bien en asociar genéticamente un polimorfismo del ADN fetal con un alelo particular. Una de las aplicaciones principales del diagnóstico genético prenatal se refiere a la detección de anomalías congénltas.

Los procedimientos de diagnóstico genético prenatal usados clínicamente comprenden esencialmente técnicas Invasivas como amniocentesis, extracción de vellosidades corlónlcas, extracción de sangre fetal o blopslas de tejido. El conjunto de estas técnicas implica que se obtienen las muestras directamente del feto o Indirectamente de las estructuras ovulares. Teniendo en cuenta el carácter muy Invasivo de estos procedimientos, estos son susceptibles de complicaciones para la madre o el feto. Entre estas complicaciones, se citará en el caso de la amniocentesis el riesgo de Infección, de hemorragia fetomaterna con posible alolnmunlzaclón, de pérdidas de líquidos amnlótlcos o de dolores abdominales. Según los estudios, el riesgo estimado de aborto después de una extracción por amniocentesis es de 0,2 a 2,1 % superior al de un grupo de control. Por consiguiente, la amniocentesis solo se propone a mujeres en las que el riesgo de tener un hijo con una minusvalía genética supera el de aborto yatrogénlco.

Con el fin de limitar el uso de técnicas invasivas de diagnóstico prenatal que presentan los riesgos de complicaciones mencionados anteriormente y que son generalmente desagradables y/o fuente de estrés para la madre, el desarrollo de nuevos procedimientos no Invasivos constituye una apuesta importante de la obstetricia moderna.

Las células fetales circulantes en la sangre materna constituyen en particular una fuente de material genético potenclalmente utilizable para el diagnóstico genético prenatal (1, 2).

Efectivamente, en el transcurso del embarazo, diferentes tipos celulares de origen fetal atraviesan la placenta y circulan por la sangre materna (1). Estos tipos celulares incluyen células linfoides y eritroides, precursores mieloides y células epiteliales trofoblásticas (citotrofoblastos y sinciotrofoblastos).

Se describen en el estado de la técnica procedimientos de análisis del genoma de células fetales circulantes en la sangre materna con vistas a un diagnóstico prenatal, pero estos continúan estando relativamente limitados en términos de sensibilidad y especificidad del diagnóstico (3, 4, 5, 6). El interés del desarrollo de un procedimiento de diagnóstico prenatal no invasivo y altamente específico da como resultado la posibilidad de disminuir mediante dicho ensayo la proporción de diagnósticos invasivos indicados en mujeres embarazadas y cuyo resultado es finalmente negativo. A modo de ejemplo, en el caso de la trisomía 21, que afecta a una mujer de cada 700, actualmente en Francia solo se ofrece un diagnóstico prenatal si la edad de la madre es igual a 38 años, mientras que a las mujeres más jóvenes se les propone un ensayo de cribado bioquímico capaz de detectar un 60 % de las trisomías 21 a expensas de una tasa de amniocentesis del 5 %. Sin embargo, aún un 40 % de los casos de trisomía 21 no son detectados por los ensayos actualmente disponibles. Se ha descrito recientemente la detección prenatal de la trisomía 21 en células fetales aisladas del plasma materno usando la técnica FISH. Este enfoque es interesante, pero las células fetales eran raras en el plasma (1 de cada 500 a 1 de cada 2000) e incluían a menudo células apoptóticas; un diagnóstico fiable requeriría la aplicación del procedimiento a un gran número de células, haciendo imposible una aplicación rutinaria. Además, las células fetales euploides no pueden identificarse mediante este enfoque.

Una de las limitaciones de estos enfoques procede del hecho de que las células fetales circulantes en la sangre están presentes a muy baja concentración. Los estudios basados en la detección por PCR del cromosoma Y en muestras de sangre sin selección previa han permitido evaluar el número medio de células fetales en aproximadamente 1 célula por mililitro de sangre (7). Por otro lado, se ha mostrado que las células fetales de origen mieloide o linfoide (CD34 o CD38 positivas) siguen presentes en la sangre materna hasta 27 años después de un embarazo o un aborto (8). Su aislamiento no se asocia por tanto a la certidumbre de que derivan del embarazo en curso. Se conciben por tanto fácilmente las dificultades técnicas del desarrollo de un diagnóstico prenatal en sangre materna utilizable rutinariamente y la necesidad de concentrar las células fetales epiteliales (trofoblásticas) que se destruyen después de cada embarazo y que permiten analizar el genoma fetal del embarazo en curso.

Varios autores han propuesto sin embargo mejorar la sensibilidad de la detección de células fetales en la sangre materna mediante el enriquecimiento de la población celular contenida en la sangre materna en células fetales o mediante la separación de las células fetales contenidas en la sangre materna (para revisión, 1, 2).

En particular, el estado de la técnica comprende la enseñanza de procedimientos de separación de células fetales circulantes basados en sus propiedades de afinidad frente a ciertos anticuerpos.

Se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 97/42503 (BIOCOM S.A.) un procedimiento de inmunoseparación magnética de células fetales consistente en fijar las células fetales sobre bolas paramagnéticas sobre las que se han fijado anticuerpos dirigidos contra antígenos expresados en la superficie de células fetales. Se describe también en la patente W090/06509 (Flinders Technologies Pty, Ltd) un procedimiento de aislamiento de células trofoblásticas para el diagnóstico prenatal con la ayuda de anticuerpos que reconocen antígenos expresados en la superficie de células trofoblásticas. Sin embargo, no se ha puesto de manifiesto hasta ahora ningún anticuerpo específico exclusivamente de células fetales. Este punto es importante, pues el diagnóstico prenatal debe efectuarse sobre una población celular fetal "pura".

A modo de ejemplos de procedimientos de enriquecimiento de una población de células originarias de sangre materna en células fetales, se citarán en particular las patentes US 5.714.325 (New England Medical Center Hospitals), US 5.580.724 (Board of Regents, The University of Texas System) y US 5.646.004 (Activated Cell Therapy, Inc.).

La patente US 5.714.325 enseña un procedimiento de enriquecimiento en granulocitos fetales mediante separación de los granulocitos fetales de las células maternas con la ayuda de anticuerpos que reconocen antígenos expresados en la superficie de los granulocitos fetales, en particular con la ayuda de la combinación de un anticuerpo anti-CD71 (receptor de transferñna) y de un anticuerpo antiglicoforina A.

La patente US 5.580.724 describe otro procedimiento de enriquecimiento en células fetales de una población de células originarias de sangre materna mediante estimulación /n v/fro de la proliferación de células fetales con la ayuda de factores de crecimiento específicos.

El enriquecimiento en células fetales puede realizarse también mediante centrifugación de una muestra de sangre en una solución con gradiente de densidad (PERCOLL, FICOLL, albúmina, sacarosa o dextrano, por ejemplo) como se describe en la patente US 5.646.004.

Sin embargo, se comprueba que estos protocolos que comprenden varias etapas de aislamiento pueden dañar las células fetales y dar lugar a pérdidas celulares significativas. Además, ninguno de estos procedimientos permite un enriquecimiento de la población de células originarias... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de diagnóstico prenatal en células fetales aisladas de sangre materna que comprende las etapas siguientes:

a) la filtración de una muestra de sangre materna pura o diluida en un filtro de porosidad comprendida entre 6 y 15 pm, de forma que se concentren en el filtro según su tamaño ciertas células circulantes, y en particular células de origen fetal que tengan un tamaño comprendido entre 14 y 17 pm;

b) el análisis y la caracterización de las células retenidas aisladas en el filtro para la búsqueda de la presencia de un marcador o marcadores inmunológicos y/o citológlcos y/o genéticos, con el fin de identificar su naturaleza epitelial y obtener una presunción de su origen fetal o materno; y la recogida individual de la célula o células epiteliales cuyo origen fetal se supone;

c) la demostración, mediante análisis genético, del origen fetal de una célula o células de origen fetal supuesto recogidas individualmente en la etapa b; y

d) la búsqueda de anomalías genéticas en el genoma o genomas de células cuyo origen fetal se ha demostrado en la etapa c).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se procede a la identificación del origen fetal o materno de las células de la etapa (c) mediante la búsqueda de un marcador o marcadores genéticos característicos de las células fetales.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la presión de filtración aplicada en dicha etapa a está comprendida entre 5 kPa y 80 kPa, y preferiblemente 10 kPa.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque las células retenidas en el filtro se recogen individualmente por microdisección.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la microdisección consiste en cortar con láser la parte de la membrana filtrante sobre la que se retiene una célula o despegar la célula con la ayuda del láser y recuperar después la célula única recogida en un tubo apropiado.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa (d) se realiza en el genoma de una célula única recogida.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque el análisis genético en el genoma de una célula única recogida permite (i) la demostración del origen fetal o materno de dicha célula y (¡i) la búsqueda de anomalías genéticas o cromosómicas del feto o de un genotipo particular de este si se demuestra el origen fetal de dicha célula.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la demostración del origen fetal o materno de una célula recogida se realiza mediante la identificación en una preparación de ADN derivado del genoma de la célula única recogida de uno o varios marcadores genéticos o de polimorfismo, de una combinación de estos marcadores o de una carga alélica particular de estos marcadores, demostrando la contribución biparental al ADN fetal.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque la búsqueda de una anomalía genética o cromosómica del feto o de un genotipo particular de este se realiza mediante la identificación de una diana genética en una preparación de ADN derivada del genoma de la célula única recogida.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque, anteriormente a la demostración del origen fetal o materno de una célula única recogida y/o a la búsqueda de una anomalía genética o cromosómica del feto o de un genotipo particular de este, se lisa dicha célula recogida y se preamplifica el conjunto de su genoma y se purifica de manera que se obtenga una preparación de ADN preamplificado derivada del genoma de una célula única recogida.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque se procede a la demostración del origen fetal o materno de una célula recogida, y después a la búsqueda de una anomalía genética o cromosómica del feto o de un genotipo particular de este, mediante la amplificación de marcadores genéticos o de polimorfismo o de una combinación de estos marcadores o de una o varias secuencias portadoras de la diana o dianas genéticas buscadas, a partir de la preparación de ADN preamplificado derivada del genoma de dicha célula.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque la amplificación de al menos un marcador genético o de polimorfismo o de al menos una secuencia portadora de una diana genética se realiza a partir de menos de un quinto de la preparación de ADN preamplificado.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizado porque se procede a la demostración del origen fetal o materno de una célula recogida y/o a la búsqueda de una anomalía genética o cromosómica del feto o de un genotipo particular de este mediante la secuenclaclón de los marcadores o dianas genéticas amplificados.

14. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque se procede a la demostración del origen fetal o materno de una célula recogida y/o a la búsqueda de una anomalía genética o cromosómica del feto o de un genotipo particular de este mediante la hibridación de toda o parte de la preparación de ADN preampllflcado con sondas de ADN específicas o de tipo PNA (ácido péptldonuclelco).

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque se fijan las sondas de ADN específicas sobre un soporte formando un chip de ADN o mlcrorred o macrorred.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, caracterizado porque al menos un marcador de polimorfismo para identificar es un marcador mlcrosatelltal, un marcador de VNTR (número variable de repeticiones en tándem), un marcador de SNP (polimorfismo de nucleótido simple) o un marcador de STR (repeticiones cortas en tándem).

17. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, caracterizado porque se procede a la demostración del origen fetal o materno de una célula recogida mediante la búsqueda de un marcador o de una combinación de marcadores o de una carga alélica de estos marcadores que se distingan de los detectados en el genoma de células no maternas, en particular mediante la búsqueda en el genoma de dicha célula recogida de un marcador o de una combinación de marcadores específica del ADN de células paternas.

18. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque se procede a la búsqueda de una anomalía cromosómica mediante un procedimiento de hibridación genómica comparativa (CGH) de una preparación de ADN preampllflcado derivada del genoma de una célula única recogida y cuyo origen fetal se demuestra, y de una preparación de ADN preamplificado de células de origen materno o de células de referencia no fetales.

19. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se procede al diagnóstico prenatal de una anomalía cromosómica o del sexo del feto mediante la hibridación /n s/fu de una sonda específica de la anomalía cromosómica o del sexo para detectar en el genoma de células retenidas en el filtro.

20. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la muestra de sangre materna filtrada es originaria de una extracción de sangre efectuada después de la 5" semana de embarazo.

21. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el análisis genético de las células retenidas en el filtro se realiza a partir de la filtración de 1 a 10 mi de sangre materna

extraída.

22. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque la muestra de sangre materna extraída se diluye de 10 a 100 veces en una solución de filtración.

23. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se procede a la filtración de la muestra de sangre materna pura o diluida con la ayuda de un filtro cuyos poros tienen un diámetro de aproximadamente 8 pm.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado porque el filtro presenta poros de un diámetro de aproximadamente 8 pm y una densidad de poros comprendida entre 5x1 o" y 5x1 (f poros/cm^.

25. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque el filtro es una membrana filtrante de policarbonato cuyo tamaño de poros está calibrado.

26. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque dicha búsqueda de la presencia de un marcador o marcadores inmunológicos comprende un inmunomarcaje con la ayuda de un anticuerpo anticitoqueratinas.

27. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque dicha búsqueda de la presencia de un marcador o marcadores inmunológicos comprende la búsqueda de la presencia de antígenos asociados a células trofoblástlcas.

28. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque dicha búsqueda de la presencia de un marcador o marcadores citológicos comprende la búsqueda de la presencia de marcadores cltológlcos específicos de células cltotrofoblásticas y/o sincitiotrofoblásticas.

29. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado porque dicha sangre materna es la sangre de una mujer embarazada entre la 5" y la 15" semanas de embarazo.

30. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque, antes de dicha 5 etapa de filtración, se diluye dicha muestra de sangre materna en una solución de filtración consistente en un

reactivo de fijación de células nucleadas y/o de lisis de glóbulos rojos.

31. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque las células retenidas en el filtro se vuelven a poner en cultivo para la obtención de un cultivo de células concentradas en células

10 fetales.


 

Patentes similares o relacionadas:

Método para analizar ácido nucleico molde, método para analizar sustancia objetivo, kit de análisis para ácido nucleico molde o sustancia objetivo y analizador para ácido nucleico molde o sustancia objetivo, del 29 de Julio de 2020, de Kabushiki Kaisha DNAFORM: Un método para analizar un ácido nucleico molde, que comprende las etapas de: fraccionar una muestra que comprende un ácido nucleico molde […]

MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMOS ATÓPICOS SENSIBLES A COMPONENTES ALERGÉNICOS DEL POLEN DE OLEA EUROPAEA (OLIVO), del 23 de Julio de 2020, de SERVICIO ANDALUZ DE SALUD: Biomarcadores y método para el diagnostico, estratificación, seguimiento y pronostico de la evolución de la enfermedad alérgica a polen del olivo, kit […]

Detección de interacciones proteína a proteína, del 15 de Julio de 2020, de THE GOVERNING COUNCIL OF THE UNIVERSITY OF TORONTO: Un método para medir cuantitativamente la fuerza y la afinidad de una interacción entre una primera proteína de membrana o parte de la misma y una […]

Secuenciación dirigida y filtrado de UID, del 15 de Julio de 2020, de F. HOFFMANN-LA ROCHE AG: Un procedimiento para generar una biblioteca de polinucleótidos que comprende: (a) generar una primera secuencia del complemento (CS) de un polinucleótido diana a partir […]

Métodos para la recopilación, estabilización y conservación de muestras, del 8 de Julio de 2020, de Drawbridge Health, Inc: Un método para estabilizar uno o más componentes biológicos de una muestra biológica de un sujeto, comprendiendo el método obtener un […]

Evento de maíz DP-004114-3 y métodos para la detección del mismo, del 1 de Julio de 2020, de PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.: Un amplicón que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 32 o el complemento de longitud completa del mismo.

Composiciones para modular la expresión de SOD-1, del 24 de Junio de 2020, de Biogen MA Inc: Un compuesto antisentido según la siguiente fórmula: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te (secuencia […]

Aislamiento de ácidos nucleicos, del 24 de Junio de 2020, de REVOLUGEN LIMITED: Un método de aislamiento de ácidos nucleicos que comprenden ADN de material biológico, comprendiendo el método las etapas que consisten en: (i) efectuar un lisado […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .